Protocol
Toutes les procédures décrites ci-dessous ont été examinés et approuvés par le Comité de protection des animaux et usage institutionnel à l'Université Northwestern et ont été réalisées dans des conditions stériles.
1. Modification de cellules GL261 avec luciole luciférase Exprimant
NOTE: les vecteurs lentiviraux à base de VIH-1 expriment la luciférase de luciole (Fluc) sous le contrôle du promoteur du virus de la rate formant foyer (SFFV). Le gène rapporteur optique a été cloné dans le vecteur plasmidique pHRSIN-CSGW-dlNotI.
- Maintenir 293-T des cellules dans du milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et des cellules de GL261 dans du milieu RPMI supplémenté avec 10% de FBS et 1% de pénicilline-streptomycine à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée contenant 95 % d'air et 5% de dioxyde de carbone (CO 2).
- Lorsque la culture de cellules 293-T atteint 80% de confluence dans un flacon T-75, laver les cellules une fois avec du phosphate solution saline tamponnée (PBS) sans Ca2 + et Mg2 +, incuber les cellules avec 3 ml de trypsine (0,05%) à 37 ° C pendant 5 min, trituré avec une pipette de 5 ml en maintenant le ballon légèrement incliné et collecter toutes les cellules du fond du flacon. Transférer le 3 ml de suspension de cellules traitées à la trypsine dans un tube conique de 15 ml et ajouter 7 ml de milieu RPMI chair (un total de 10 ml de la suspension cellulaire).
- Mélanger la suspension de cellules et avec une pipette 5 ml. Prendre 100 ul de la suspension cellulaire à partir du tube et compter le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre. Pour ce faire, mélanger 100 pi de la suspension de cellules avec 300 ul de solution de bleu trypan et insérer 2 ul du mélange dans un hémocytomètre. Comptez le nombre de cellules sans coloration bleue de quatre points de vue différents sous un microscope. La moyenne du nombre de cellules de chaque vue, que ce nombre représente 10 4 cellules / ml.
- Pendant ce temps, centrifuger le tube contenant la suspension cellulaire à 300 g pendant 7 min. Aspirer les médias et remettre en suspension les culots de cellules avec du milieu RPMI frais pour faire une suspension de cellules de GL261 à une densité de 1,0 x 10 6 / ml. Seed 2,5 x 10 6 cellules GL261 avec 2,5 ml de milieu RPMI dans un flacon T-175 avec 27,5 ml de DMEM (jour 1).
- Après 24 heures, remplacer le milieu avec 20 ml de DMEM frais (jour 2).
- Pour produire le vecteur lentiviral, mélanger 54 ul réactif de transfection avec 2 ml DMEM dépourvu de sérum pendant 5 min. Ajouter 3 pg de gag-pol, 3 ug de virus de la stomatite vésiculaire G enveloppe (VSV-G), et 4,5 ug de Fluc (pSIN-Fluc) dans le DMEM avec un réactif de transfection, et incuber pendant 20 min à température ambiante. Déposer le mélange d'ADN dans toute la fiole T-293 (T-175) et incuber à 37 ° C dans une chambre humidifiée contenant 95% d'air et 5% de CO 2 pendant 48 heures (jour 2).
- Ajouter 10 ml de DMEM frais à 24 h après la transfection (volume total de milieu de culture cellulaire 293-T devrait être d'environ 30 ml) (jour 3).
- Pour diviser les cellules GL261 dans unPlaque de 24 puits, laver les cellules une fois avec PBS sans Ca2 + et Mg2 +, incuber les cellules avec 5 ml de trypsine (0,05%) à 37 ° C pendant 5 min, trituré avec une pipette de 5 ml en tenant le ballon légèrement incliné , recueillir toutes les cellules du fond du flacon, et compter les cellules via hémocytomètre comme dans l'étape 1.2. Pendant ce temps, centrifuger le tube à 300 g pendant 7 min. Aspirer les médias et remettre en suspension les culots de cellules avec du milieu RPMI frais pour faire une suspension de cellules de GL261 à une densité de 2,5 x 10 4 / ml. Seed 2,5 x 10 4 cellules GL261 avec 1 ml de milieu RPMI dans une plaque de 24 puits (jour 3).
- Recueillir 30 ml du surnageant avec 10 ml lentiviral pipette à partir de la fiole T-293 (T-175) à 48 h après la transfection et la transfère le surnageant dans 50 ml de tube conique. Aspirer le surnageant 30 ml d'lentiviral via une seringue de 50 ml, à travers un filtre à seringue de 0,22 um, et aliquoter le surnageant viral dans des aliquotes de 1 ml par jour (4).
- Remplacer les 1 ml de RPMI milieu dans la plaque de cellules GL261 (24 puits) avec 1 ml du surnageant lentiviral et incuber à 37 ° C dans une chambre humidifiée (jour 4).
- Après 48 h d'infection lentivirale, remplacer le milieu avec 1 ml de RPMI frais (jour 6).
- Après 24 heures, répéter l'infection lentiviral des cellules GL261 (jour 7).
- Après la 2 e 48 h d'infection lentivirale, remplacer le milieu avec 1 ml de RPMI frais (jour 9).
- Continuer à cultiver les cellules de luciférase GL261 modifié (qui sera désigné sous le nom de cellules GL261.luc) et développer la culture de cellules dans un flacon T-75.
- Lorsque la culture cellulaire GL261.luc atteint 70% de confluence dans un flacon T-75, récolter les cellules par trypsinisation et compter par hémocytomètre comme à l'étape 1.2. Plaque la cellule GL261.luc dans une plaque de 24 puits à des densités diplômés (1,0 x 10 6, 5,0 x 10 5, 2,5 x 10 5, 1,0 x 10 5, 5,0 x 10 4, 2,5 x 10 4 cellules / puits) et incuber à 37 ° C dans un humidichambre fiée contenant 95% d'air et 5% de CO 2 pendant 3 heures.
- Mesurer cellulaire activité de la luciférase par rapport à la luciférase U-87 MG (U87.luc) des cellules à l'aide de l'imagerie par bioluminescence (figure 1) modifié.
- Démarrez le logiciel d'image (cliquez icône sur le bureau) et initialiser le système d'imagerie (cliquez sur le bouton "Initialiser"). L'initialisation démarre automatiquement et peut prendre plusieurs minutes pour le système check-up et la caméra refroidir à -90 ° C.
- Ajouter 25 pl de luciférine (D-Luciferin sel de potassium, 150 mg / kg) dans chaque puits.
- Incuber les cellules avec luciférine pendant 1 min à température ambiante et de l'image de la plaque pendant 10 sec. Pour configurer le système d'imagerie, sélectionnez "luminescent", "10 sec" temps d'exposition, et binning "Medium". Placer la plaque de 24 puits sur la station d'imagerie et cliquez sur le bouton "Acquérir" pour démarrer l'image.
- Après l'image est acquise avec succès, vous verrez une fenêtre d'image et un outil palette à l'écran. Cliquez sur "Roi (régions d'intérêt) Outils» et sélectionnez 6 x 4 à partir de l'icône de la fente. Créer 6 x 4 fentes pour couvrir la zone de signal sur l'image de la plaque de 24 puits et cliquez sur l'onglet mesures (crayon icône). Observez une fenêtre avec une table de mesures de ROI comme unité de photons par seconde par stéradian par centimètre carré (photons / s / sr / cm 2).
- Utilisation U87.luc cellules, préalablement à jour avec la même lentivirus utilisé ici pour la modification de GL261 11, en tant que témoin pour l'évaluation de l'activité luciférase dans les cellules transduites GL261.luc.
2. Essai de prolifération in vitro
- Lorsque les cultures de cellules GL261 et GL261.luc atteignent 70% de confluence dans un flacon T-75, récolter les deux lignes de cellules par trypsinisation et comptées comme à l'étape 1.2, et de cellules de la plaque dans une plaque à 96 puits à une densité de 1500 cellules dans 80 ul de milieu RPMI par puits en utilisant une pipette multicanaux pour réduire le temps et l'erreur de pipetage. Seed chaque lignée cellulaire dans 20 puits au total. Pour limiter l'évaporation dans les puits peuplées par les cellules, remplissez puits vides avec 100 pi de milieu RPMI frais.
- Évaluer la prolifération cellulaire en utilisant un dosage de prolifération cellulaire colorimétrique. Ici, nous utilisons le dosage de prolifération de cellules MTS. En utilisant une pipette à canaux multiples, ajouter 20 ul de réactif MTS dans chaque puits de la plaque à 96 puits contenant des cellules.
- Incuber la plaque à 37 ° C dans une chambre humidifiée contenant 95% d'air et 5% de CO 2 pendant 3 heures. Mesurer l'absorbance à 490 nm en utilisant un lecteur de microplaques. Ceci est répété aux jours 1, 2, 4, et 7, après étalement. Pour normaliser les valeurs d'absorbance, les valeurs de chaque jour sont divisées par les valeurs correspondantes obtenues à jour une (Figure 2).
3. cellules tumorales Implantation
Remarque: Autoclaver tous les équipements. Préparer zone chirurgicale par pulvérisation d'un désinfectant (solution de chlorhexidine à 2%) et couvrir avec absorbent rideaux. Afin de maintenir des conditions stériles, porter des gants chirurgicaux stériles pendant la chirurgie, et de diviser la zone chirurgicale en deux zones par un ruban de couleur. Zone 1 est étiqueté "Clean" et contient des fournitures stérilisées; Zone 2 est étiqueté "Dirty" et contient des matériaux utilisés.
- Avant la chirurgie d'animal, préparer une suspension de cellules pour l'injection intracrânienne. Cellules de récolte d'une confluence de 70% T-75 flacon par traitement à la trypsine et de compter les cellules via hémocytomètre comme dans l'étape 1.2, et faire une suspension de cellules à une densité de 1,0 x 10 5 cellules / ul dans une solution saline équilibrée de Hanks sans Ca 2+ et Mg2 + (HBSS).
- Anesthésier les souris avec une injection intraperitoneale de 200 ul de mélange contenant 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg de xylazine dans une solution saline à 0,9%. Pour confirmer anesthésie appropriée, pincer le bout de la souris. Si la souris est complètement sous anesthésie, la souris ne devrait pas répondre au stimulus.
- Administrer 0,1 mg / kg de buprénorphine par injection sous-cutanée à soulager la douleur post-opératoire.
- Rasez le haut de la tête de l'animal à l'aide de tondeuses et propre avec un applicateur coton-tige trempé dans une solution de chlorhexidine à 2%. Appliquer une pommade oculaire à maintenir une lubrification adéquate pendant la chirurgie.
- Faire une incision sagittale environ 1 cm de long sur l'os pariéto-occipitale l'aide d'un scalpel stérile. Pour visualiser le bregma, essuyez la surface du crâne avec un applicateur coton-tige imbibé d'une solution de peroxyde d'hydrogène à 3%.
- Percer le crâne avec une aiguille 25 G stérile pour faire un petit trou de 3 mm à la droite de la bregma et juste derrière la suture coronale.
- Pour veiller à ce que intracrânienne site d'injection est à une profondeur de 3 mm du crâne, couper 3 mm hors de l'extrémité pointue d'une pointe de pipette 20 ul aide de ciseaux et d'insérer une seringue dans l'embout de pipette.
- Insérer la seringue perpendiculairement au trou précédemment créée, et injecter lentement le sus des cellules tumoralespension contenant 3,0 x 10 5 cellules dans 3 ul HBSS, sur une période de 1 min. Laissez l'aiguille en place pendant une minute, puis retirer lentement l'aiguille.
- Badigeonner le crâne avec le coton-tige trempé dans l'applicateur 3% de peroxyde d'hydrogène et la solution de chlorhexidine à 2%. Séchez la surface du crâne avec le coton-applicateur à bout. Découpez la cire osseuse stérile d'environ 3 mm 3 en taille et en fixer la cire d'os sur le côté de la fin de la coton-applicateur à bout. Appliquez la cire osseuse pour couvrir le trou avec le coton-applicateur à bout.
- Dessinez le chaque côté du cuir chevelu ainsi que sur le crâne à l'aide de pinces, et l'agrafer pour fermer la plaie. Nettoyer la plaie avec un coton-tige trempé dans une solution de chlorhexidine à 2%.
- Surveiller toutes les souris post-opératoire jusqu'à ce qu'ils deviennent ambulatoire et de conserver une activité normale. Typiquement, le temps de récupération est d'environ 30 min. Ne retournez pas les souris à la cage avec les autres animaux jusqu'à ce qu'ils aient complètement récupéré de l'anesthésie.
- Vaporisez une quantité généreuse de désinfectant (solution de diméthyle de chlorure d'ammonium à 0,05%) sur une serviette en papier propre. Utilisez la serviette en papier imbibé de désinfectant pour essuyer soigneusement la feuille noire, cônes de nez et diviseur intérieur de la chambre d'imagerie où les animaux seront en contact avec l'appareil. Essuyez soigneusement toutes les surfaces avec une serviette en papier sec. Répétez cette fois de plus et attendre 5 min.
- Initialisation de la station d'imagerie comme dans l'étape 1.14.1.
- Anesthésier les souris avec un mélange de 300 ul contenant 200 ul de kétamine / xylazine et 100 pl de luciférine (D-luciférine, sel de potassium 150 mg / kg) par injection intraperitoneale.
- Attendre 10 minutes après l'injection et de confirmer si les souris sont complètement sous anesthésie en pinçant la queue. Pour configurer le système d'imagerie, sélectionnez "luminescent", "Auto" temps d'exposition, et binning "Medium". Placez les souris sur la stati d'imageriele et cliquez sur le bouton "Acquérir" pour démarrer l'image. Assurez-vous que le temps après l'injection est compatible avec chaque session d'imagerie.
- Après l'image est acquise avec succès, une fenêtre d'image et de la palette d'outils devraient apparaître. Cliquez sur "Outils de ROI" et sélectionnez "automatique" de l'icône de cercle. Pour définir ROI, encercler la zone de signal sur l'image, puis prendre des mesures de ROI comme unité de photons / s / SR / cm 2.
- Prendre les souris hors de la chambre de formation d'image et surveiller les souris jusqu'à ce qu'ils deviennent ambulant et conserver une activité normale. Typiquement temps de récupération est d'environ 15 min. Ne retournez pas les souris à la cage avec les autres animaux jusqu'à ce qu'ils aient complètement récupéré de l'anesthésie.
- Surveiller la croissance tumorale par imagerie par bioluminescence deux fois par semaine jusqu'à ce que les animaux présentent les symptômes suivants: perte de poids (perte de plus de 20% par rapport au poids avant l'implantation), inappétence (anorexie complète pendant 24 heures), et le manque de purposefu soutenuel réponse à des stimuli douce (de faible tentative de se lever), date à laquelle ils doivent être euthanasiés. Euthanasier animaux présentant ces symptômes en utilisant une chambre de CO 2 suivie d'une dislocation cervicale.
- La place souris dans la chambre de l'euthanasie (ne pas surpeuplé la chambre) et afflux compressés CO 2 pour 5-6 min. Observez que tous les animaux sont inconscience et ne respire pas après environ 5 min.
- Prenez les souris hors de la chambre. Assurez-vous que le cœur ne bat pas en sentant la poitrine entre votre pouce et l'index et vérifier qu'il n'y a pas de réflexe de clignement.
- Retenez la souris dans une position couchée sur une surface plane et de saisir l'arrière du cou à la base du crâne avec une main et base de la queue avec votre pouce et l'index de l'autre main.
- Retenez la tête et tirez rapidement la queue arrière. Assurez-vous que le crâne est séparée de la première vertèbre cervicale en utilisant votre pouce et l'index.
- Normealize valeurs de luminescence pour chaque jour contre les lectures correspondantes obtenues au premier jour de l'imagerie par bioluminescence comme à l'étape 2.3 (figure 3A).
- Pour l'analyse statistique, de générer des courbes de survie à l'aide de l'estimateur de Kaplan-Meier 12 et comparer les différences entre les courbes de survie en utilisant un test du log-rank 13.
Representative Results
GL261 cellules ont été infectées avec des lentivirus contenant la luciférase tel que décrit ci-dessus dans les étapes 1. In vitro imagerie par bioluminescence montre robuste expression à des niveaux similaires dans le témoin positif U87.luc lignée cellulaire de glioblastome humain de la luciférase (figure 1). Comme prévu, les cellules non infectées GL261 démontrent aucune expression fond de la luciférase. Cette étape est simple, mais essentiel pour effectuer avant de poursuivre des études en utilisant la lignée cellulaire infectée pour confirmer l'expression de la luciférase stable.
Expression de la luciférase après l'implantation intracrânienne.
Avant l'implantation intracrânienne, nous avons démontré aucune différence dans le taux de croissance in vitro de GL261.luc par rapport aux cellules de GL261 (figure 2). Pour la croissance intracrânienne et l'analyse de survie, les cellules ont été injectées dans le brains de souris C57BL / 6 que par le protocole de l'étape 3. La croissance tumorale chez les souris portant des tumeurs GL261.luc été analysés en série pour l'imagerie par bioluminescence en utilisant le protocole et l'étape 4 ont montré une croissance tumorale détectable (Figure 3A). Les souris portant des tumeurs rapidement et uniformément devenues moribondes GL261.luc et ont été euthanasiés. Surtout, il n'y a aucune différence dans la survie globale entre GL261.luc et GL261 tumeur animaux portant (figure 3B). In vivo l'imagerie par bioluminescence peut donc être utilisé pour surveiller la réponse aux traitements de glioblastome expérimentales. La croissance tumorale rapide et fiable et la survie globale à court peuvent produire de grandes quantités de données dans un relativement court laps de temps.
Figure 1. L'activité de luciférase dans des cellules GL261.luc. U87.luc, cellules GL261.luc et GL261 (contrôle négatif) ont été étalées à des densités de1,0 x 10 6, 5,0 x 10 5, 2,5 x 10 5, 1,0 x 10 5, 5,0 x 10 4 et 2,5 x 10 4 cellules / puits de gauche à droite. Luminescence (photons / s / sr / cm 2) a été mesurée par la station d'imagerie de lumières. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. expression de la luciférase n'a aucune incidence sur la prolifération des cellules GL261. GL261.luc cellules ne provoquent pas un différence de prolifération MTS comme démontré par analyse de prolifération cellulaire. Le graphique montre multiplication, par rapport au jour 1, tel que déterminé par la comparaison de la valeur moyenne d'absorbance (moyenne ± SEM) au point de thespecified à la valeur moyenne au jour 1 de temps (valeurs -test t non appariés pour les comparaisonsentre chaque lignée cellulaire: P = 0,7796) 14. Les barres d'erreur représentent les valeurs moyennes (moyenne ± SEM) à partir d'échantillons en quadruple sur chaque jour. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. luciférase expression affecte pas la dose sur la croissance in vivo de la tumeur et la survie des animaux. (A) la surveillance de la bioluminescence démontre la croissance progressive de la tumeur intracrânienne GL261.luc dans C57BL / 6. (B) de Kaplan-Meier analyse de survie montre aucune différence dans la survie globale pour les souris implantées avec des cellules intracrânienne GL261 (trait plein) ou GL261.luc (ligne pointillée).S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
GL261 cellules de gliome murin, lorsqu'il est implanté par voie intracrânienne dans immunocompétentes syngénique souris C57BL / 6, offrent plusieurs avantages par rapport aux modèles de xénogreffe d'animaux de gliome humain. Beaucoup de tumeurs xénogreffées poussent comme des lésions encapsulés qui ne récapitulent pas exactement la maladie humaine invasive. En revanche, GL261 tumeur démontre non seulement l'invasion dans le cerveau adjacent, mais aussi la néovascularisation, figures de mitose, et une nécrose profonde 7. Plus important encore lorsque l'on étudie l'immunologie tumorale ou des stratégies immunothérapeutiques 15, 16, les souris C57BL / 6 conserve un système immunitaire intact 8. Des études antérieures ont montré une expression robuste de la cytokine immunosuppressive TGF-β et des tumeurs intracrâniennes contenir des cellules T-réglementaires immunosuppresseurs glioblastome humain semblables à 9, 10.
La technique simple décrite ici permet une expression stable de la luciférase par les cellules GL261. Nous avons récemment rapporté Similaire in vitro et in vivo de la croissance des cellules par rapport aux cellules GL261.luc de GL261, en plus des caractéristiques histologiques de la tumeur et les cellules immunitaires similaires infiltrer 17. Les cellules expriment de manière stable la luciférase GL261.luc qui catalyse l'oxydation de la luciférine de substrat pour convertir l'énergie chimique photons et donc lumière détectable. Luciferin peut être administré sans danger aux animaux et traverse la barrière hémato-encéphalique après l'injection intrapéritonéale ou intraveineuse. Chez les petits animaux de recherche tels que les souris, la bioluminescence peut être détectée à l'extérieur d'une manière non-invasive 11. Par conséquent, la croissance tumorale peut être évaluée en série sans avoir besoin de sacrifice des animaux ou coûteux IRM ou tomodensitométrie.
Les étapes critiques dans le protocole impliquent, non seulement la transduction lentivirale, mais aussi vérification de l'expression stable de la luciférase in vitro avant de commencer toutes les expériences in vivo. La perte de transduction peut require infection lentivirus répétition. L'introduction d'un gène de résistance à un antibiotique dans le vecteur d'expression peut également être utilisé pour sélectionner pour l'expression de la luciférase. Technique méticuleuse est nécessaire pour l'implantation intracrânienne de placer reproductible un nombre important de cellules dans une localisation anatomique précise pour permettre une comparaison des différents groupes de traitement. Une différence majeure entre l'étude en cours et des études antérieures de cellules exprimant la luciférase GL261 est l'utilisation d'une technique main libre pour l'implantation de cellules par rapport à l'utilisation d'un cadre stéréotaxique 18. Nous avons déjà démontré des résultats d'implantation cohérentes avec la technique de 19 main libre. L'avantage de la technique de la main libre est la possibilité d'effectuer des analyses à haut débit de différents agents de traitement. Dans nos mains, nous pouvons implanter environ 60 animaux en 1 h.
Après avoir maîtrisé la technique, les futures applications de la technique sont illimitées. Comme GL261 demonstrAtes élevés mitoses et la croissance rapide de la tumeur similaire à glioblastome humain, les traitements anti-prolifératifs peuvent être évalués. De même, les thérapies anti-invasives et anti-angiogéniques peuvent être utilisés comme les tumeurs du GL261 sont invasifs et angiogénique. La prudence devrait être utilisé pour évaluer l'effet des agents chimiothérapeutiques, visant des cibles humaines. Par rapport aux études précédentes utilisant des xénogreffes de glioblastome humain exprimant la luciférase 20, cela serait considéré comme une limitation de notre modèle. En outre, l'effet des stratégies d'immunothérapie de la croissance de la tumeur peut être étudiée dans le modèle xénogreffé GL261.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechonology | LUCK-100 | Store away from light |
| Living Image Software | Caliper Life Sciences | Contact for Quote | none |
| Xenogen Lumina | Caliper Life Sciences | Contact for Quote | none |
| 24-well; Standard tissue culture; flat-bottom | Falcon | 353047 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | none |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | Contact for Quote | none |
| 96 well Assay Plate, Black Plate, Clear bottom with Lid, Tissue culture Tretaed | Coster | 3603 | none |
| Ketaset | Pfizer | NDC 0856-2013-01 | Control substance |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | 23076-35-9 | none |
| 28G Needle (with syringe) | Fisher | 22-004-270 | AKA Insulin Syringe |
| 2% Chlorhexidine | Fisher | NC9756995 | AKA “Nolvasan” |
| 3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H312P-4 | Store away from light |
| Ophthalmic Ointment | Cardinal Health | 1272830 | AKA “Akwa Tears” |
| 25G 1 1/2 needle | BD Becton Dickinson | 305127 | none |
| Disposable Scalpels | Feather | 2975 | No. 21 |
| Gauze | Fisher | 22028563 | Autoclave before use |
| Heating Pad | Dunlap | HP950 | none |
| Skin Stapler, Staples, Remover | Stoelting | 59020 | none |
| PDI Alchol Prep Pads | Fisher | 23-501-711 | none |
| Reflex 7 mm Wound Clips 100 pack | Brain Tree Scientific, INC | 203 1000 | Autoclave before use |
| Reflex 7 mm Wound Clip Applier | Brain Tree Scientific, INC | 204 1000 | Autoclave before use |
| Reflex 7 mm Wound Clip Remover | Brain Tree Scientific, INC | 205 1000 | none |
| Single Ended Round Tip Swab with Wood handle | Qosmedix | 10107 | Autoclave before use |
| Hanks' Balanced Salt Solution without Ca2+ and Mg2+ (HBSS) | Gibco | 14170-112 | none |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 80300 | none |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2961 | none |
| Bone Wax | Harvard Apparatus | 599864 | none |
References
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