Protocol
Alle procedurer, der er beskrevet nedenfor, er blevet gennemgået og godkendt af Institutional Animal Brug og pleje Udvalg på Northwestern University og er blevet udført under steriliserede forhold.
1. Ændring af GL261 celler med ildflueluciferase udtrykke Reporter
BEMÆRK: HIV-1-baserede lentivirusvektorer udtrykker ildflue-luciferase (Fluc) under kontrol af milten fokus-dannende virus (SFFV) promotor. Den optiske reportergenet er blevet klonet ind i vektoren plasmid pHRSIN-CSGW-dlNotI.
- Oprethold 293-T-celler i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og GL261 celler i RPMI-medium suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 95 % luft og 5% kuldioxid (CO 2).
- Når 293-T-celle-kultur til 80% konfluens i en T-75-kolbe, vaskes cellerne en gang med phosphate saltopløsning (PBS) uden Ca2 + og Mg2 +, inkuberes cellerne med 3 ml trypsin (0,05%) ved 37 ° C i 5 minutter, tritureres med en 5 ml pipette ved at holde kolben lidt skrå og indsamle alle de celler fra bunden af kolben. Overfør 3 ml trypsiniseret cellesuspension i en 15 ml konisk rør, og der tilsættes 7 ml af kød RPMI-medium (i alt 10 ml af cellesuspensionen).
- Bland cellesuspensionen godt med en 5 ml pipette. Tag 100 pi af cellesuspensionen fra røret og tælle antallet af celler under anvendelse af hæmocytometer. For at gøre dette, bland 100 pi af cellesuspensionen med 300 pi trypan blå opløsning og indsæt 2 pi af blandingen i et hæmocytometer. Tæl antallet af de celler uden blåfarvning fra fire separate visninger under et mikroskop. Gennemsnit cellen nummer fra hver visning, da dette antal udgør 10 4 celler / ml.
- I mellemtiden centrifugeres røret med cellesuspensionen ved 300 xg i 7 min. Aspirere medierne og resuspenderes cellepellets med frisk RPMI-medium til at lave en GL261 cellesuspension på tæthed på 1,0 x 10 6 / ml. Frø 2,5 x 10 6 celler GL261 med 2,5 ml RPMI-medium i en T-175 kolbe med 27,5 ml DMEM (dag 1).
- Efter 24 timer udskiftes mediet med 20 ml frisk DMEM (dag 2).
- At producere lentivirusvektoren, bland 54 pi transfektionsreagens med 2 ml serumfrit DMEM i 5 minutter. Tilsæt 3 ug gag-pol, 3 ug vesikulær stomatitis virus G-kappe (VSV-G), og 4,5 ug Fluc (pSIN-Fluc) i DMEM med transfektionsreagens, og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur. Drop hele DNA blandingen i 293-T-kolbe (T-175) og inkuberes ved 37 ° C i en befugtet kammer indeholdende 95% luft og 5% CO2 i 48 timer (dag 2).
- Der tilsættes 10 ml frisk DMEM ved 24 timer efter transfektion (samlet volumen på 293-T-celle dyrkningsmedium bør være ca. 30 ml) (dag 3).
- Du opdeler GL261 celler i enPlade med 24 brønde, vaske cellerne én gang med PBS uden Ca2 + og Mg2 +, inkuberes cellerne med 5 ml trypsin (0,05%) ved 37 ° C i 5 minutter, tritureres med en 5 ml pipette ved at holde kolben let skråtstillede , indsamle alle cellerne fra bunden af kolben, og tælle celler via hæmocytometer som i trin 1.2. I mellemtiden, centrifugeres røret ved 300 x g i 7 min. Aspirere medierne og resuspenderes cellepellets med frisk RPMI-medium til at lave en GL261 cellesuspension på tæthed på 2,5 x 10 4 / ml. Seed 2,5 x 10 4 celler GL261 med 1 ml RPMI-medium i en 24-brønds plade (dag 3).
- Saml 30 ml af supernatanten med lentiviral 10 ml pipette fra 293-T-kolbe (T-175) ved 48 timer efter transfektion og overføre supernatanten i 50 ml konisk rør. Aspirer 30 ml lentiviral supernatant via en 50 ml sprøjte, gennem et 0,22 um sprøjtefilter, udportionerer virussupernatanten i 1 ml alikvoter (dag 4).
- Udskift 1 ml af RPMI medium i GL261 cellepladen (24 brønde) med 1 ml af lentiviral supernatant og inkuberes ved 37 ° C i et fugtigt kammer (dag 4).
- Efter 48 timer af lentiviral infektion, at erstatte mediet med 1 ml frisk RPMI (dag 6).
- Efter 24 timer, gentages lentiviral infektion af GL261 celler (dag 7).
- Efter 2. 48 timers af lentiviral infektion, erstatte mediet med 1 ml frisk RPMI (dag 9).
- Fortsætte med at vokse luciferase modificeret GL261 celler (som henvises til som GL261.luc celler) og udvide cellekulturen til en T-75-kolbe.
- Når GL261.luc cellekultur når 70% konfluens i en T-75-kolbe, høste cellerne ved trypsinbehandling og tæller efter hæmocytometer som i trin 1.2. Plade GL261.luc cellen i en 24-brønds plade ved afgangseksamen tætheder (1,0 x 10 6, 5,0 x 10 5, 2,5 x 10 5, 1,0 x 10 5, 5,0 x 10 4, 2,5 x 10 4 celler / brønd) og Der inkuberes ved 37 ° C i en humidiceret kammer indeholdende 95% luft og 5% CO2 i 3 timer.
- Mål cellulære luciferaseaktivitet i forhold til luciferase modificeret U-87 MG (U87.luc) celler under anvendelse af bioluminescens imaging (figur 1).
- Start billedet softwaren (klik ikonet på skrivebordet), og initialisere billeddannende system (klik på knappen "Formatér"). Initialisering begynder automatisk og kan tage flere minutter for systemet check-up og kameraet til at køle ned til -90 ° C.
- 25 pi af luciferin (D-Luciferin kaliumsalt, 150 mg / kg) i hver brønd.
- Inkubér cellerne med luciferin i 1 min ved stuetemperatur og billede pladen i 10 sek. For at opsætte billedbehandlingssystem, skal du vælge "Luminescent", "10 sec" eksponeringstid, og "Medium" binning. Placer 24 brønde på den billeddannende stationen og klik på knappen "Acquire" for at starte billede.
- Når billedet er lykkedes erhvervet, vil du se et billede vindue og værktøj paLette på skærmen. Klik på "ROI (regioner af interesse) Funktioner" og vælg 6 x 4 fra ikonet slids. Opret 6 x 4 spalter til at dække det område signalet på billedet af den 24-brønds plade og klik på fanen målinger (blyant ikon). Overhold et vindue med en tabel over ROI målinger som enhed af fotoner per sekund per steradian pr kvadrat cm (fotoner / sek / sr / cm2).
- Brug U87.luc celler, der tidligere modificeret med samme lentivirus her anvendes til GL261 ændring 11, som en kontrol for at vurdere luciferaseaktivitet i transducerede GL261.luc celler.
2. In vitro-proliferationsassay
- Når GL261 og GL261.luc cellekulturer nå op på 70% konfluens i en T-75-kolbe, høste begge cellelinier ved trypsinisering og tæller som i trin 1.2, og plade celler i en 96-brønds plade med en tæthed på 1500 celler i 80 pi RPMI medium pr brønd med en multikanalpipette at minimere tid og pipetteringsfejl. Seed hver cellelinie i 20 brønde i alt. For at begrænse fordampningen i brøndene befolket af celler, fylde tomme brønde med 100 pi frisk RPMI-medium.
- Vurdere cellulær proliferation ved anvendelse af en kolorimetrisk celleproliferationsassay. Vi bruger MTS celleproliferationsassayet. Ved hjælp af en multi-kanal pipette, tilsættes 20 pi MTS reagens i hver brønd på 96-brønds plade, der indeholder celler.
- Inkubér pladen ved 37 ° C i en befugtet kammer indeholdende 95% luft og 5% CO2 i 3 timer. Mål absorbans ved 490 nm under anvendelse af en mikropladelæser. Dette gentages på dag 1, 2, 4 og 7, efter udpladning. At normalisere absorbansværdier, er værdierne af hver dag, divideret med de tilsvarende aflæsninger opnået på dag 1 (figur 2).
3. tumorcelleimplantation
Bemærk: Autoklavér alt udstyr. Forbered kirurgiske område ved sprøjtning desinfektionsmiddel (2% klorhexidin opløsning) og tildækkes med absorbent gardiner. For at opretholde sterile betingelser, slid sterile kirurgiske handsker under operationen, og opdele kirurgiske område i to områder af farve tape. Område 1 er mærket "Clean" og indeholder steriliseret forsyninger; Område 2 er mærket "Dirty" og indeholder brugte materialer.
- Forud for dyr kirurgi, forberede en celle suspension til intrakraniel injektion. Harvest celler fra en 70% sammenflydende T-kolbe 75 ved trypsinisering og tælle celler via hæmocytometer som i trin 1.2, og gøre en cellesuspension ved en densitet på 1,0 x 10 5 celler / ul i Hanks Balanced Salt Solution uden Ca2 + og Mg2 + (HBSS).
- Bedøver mus med intraperitoneal injektion af 200 pi blanding indeholdende 100 mg / kg af ketamin og 10 mg / kg xylazin i 0,9% saltvand. For at bekræfte korrekt bedøvelse, knivspids tåen af musen. Hvis musen er helt under anæstesi, bør musen ikke reagerer på stimulus.
- Administrer 0,1 mg / kg buprenorphin via subkutan injektion til at lindre post-operative smerter.
- Barbere toppen af hovedet af dyrene ved hjælp af klippere og rent med en bomulds-spids applikator dyppet i 2% klorhexidin løsning. Anvend øjensalve at opretholde tilstrækkelig smøring under operationen.
- Lav en sagittal snit ca. 1 cm lang over parieto-nakkebenet anvendelse af en steril skalpel. For at visualisere bregma, tørre overfladen af kraniet med en bomulds-spids applikator gennemvædet med en 3% brintoverilte løsning.
- Bor kraniet med en steril 25-G kanyle til at gøre et lille hul 3 mm til højre for bregma og lige bag koronale sutur.
- For at sikre, at intrakranial injektionsstedet er til en dybde på 3 mm fra kraniet, skær 3 mm fra den spidse ende af en 20 pi pipettespids med en saks og indsætte en sprøjte ind i pipettespidsen.
- Sæt sprøjten vinkelret på hullet tidligere oprettede, og langsomt injicere tumorcellens suspension indeholdende 3,0 x 10 5 celler i 3 pi HBSS, i løbet af 1 min periode. Lad nålen på plads i et minut, og træk derefter langsomt ud nålen.
- Svaber kraniet med bomuld-tip applikator dyppet i 3% hydrogenperoxid og 2% chlorhexidin opløsning. Tør overfladen af kraniet med bomuld-tip applikator. Klip den sterile knogle voks ca 3mm 3 i størrelse og fastgøre knoglen voks på enden side af bomuld-tip applikator. Påfør knoglen voks til at dække hullet med bomuld-tip applikator.
- Tegn hver side af hovedbunden sammen over kraniet med pincet, og hæfte til at lukke såret. Rense såret med en bomuld tip dyppet i 2% chlorhexidin opløsning.
- Overvåg alle mus postoperativt indtil de bliver ambulant og fastholde normal aktivitet. Typisk, restitutionstid er cirka 30 minutter. Må ikke returnere mus til buret med andre dyr, indtil de fuldt ud har genvundet fra anæstesi.
- Spray en generøs mængde af desinfektionsmiddel (0,05% dimethylammoniumchlorid opløsning) på en ren papirserviet. Brug desinfektionsmiddel-gennemblødt papirserviet til grundigt at tørre den sorte plade, næse kegler og divider inde i billedbehandling kammer, hvor dyrene vil være i kontakt med enheden. Grundigt Tør alle overflader med en ren, tør papirserviet. Gentag denne gang mere og vente 5 min.
- Initialiser den billeddannende station som i trin 1.14.1.
- Bedøver musen med en 300 pi blanding indeholdende 200 pi Ketamin / Xylazin og 100 pi luciferin (D-Luciferin kaliumsalt, 150 mg / kg) ved intraperitoneal injektion.
- Vent 10 minutter efter injektion og bekræfte, hvis musene er helt under anæstesi ved at klemme halen. For at opsætte billedbehandlingssystem, skal du vælge "Luminescent", "Auto" eksponeringstid, og "Medium" binning. Placer mus på den billeddannende statipå og klik på knappen "Acquire" for at starte billede. Sørg for, at tiden efter injektion er i overensstemmelse med hver imaging session.
- Når billedet er lykkedes erhvervet, skal vises et billede vindue og værktøjspaletten. Klik "ROI Tools" og vælg "auto" fra ikonet cirkel. For at definere ROIs, omringe området for signalet på billedet, og derefter tage målinger af ROI som enhed af fotoner / sek / SR / cm2.
- Tag musene ud af afbildningskammeret og overvåge musene, indtil de bliver ambulant og fastholde normal aktivitet. Typisk restitutionstid er ca 15 min. Må ikke returnere mus til buret med andre dyr, indtil de fuldt ud har genvundet fra anæstesi.
- Overvåg tumorvækst ved bioluminescens imaging to gange om ugen, indtil dyrene følgende symptomer: vægttab (tab af mere end 20% i forhold til vægten før implantation), appetitløshed (komplet anoreksi i 24 timer), og manglen på vedvarende purposeful reaktion på skånsom stimuli (svag forsøg på at komme op), på hvilket tidspunkt de skal aflives. Aflive dyr med disse symptomer ved hjælp af en CO 2 kammer efterfulgt af cervikal dislokation.
- Placer mus ind i eutanasi kammer (ikke overfyldte kammeret) og tilgangen komprimeret CO2 i 5-6 min. Bemærk at alle dyr er bevidstløshed og ikke trækker vejret efter ca. 5 min.
- Tag musene ud af kammeret. Sørg for, at hjertet ikke slår ved at føle brystet mellem tommel- og pegefinger og kontrollere, at der ikke er nogen blink refleks.
- Begrænse mus i bugleje på en flad overflade og gribe bagsiden af halsen ved foden af kraniet med den ene hånd og haleroden med tommel- og pegefinger på den anden side.
- Begrænse hovedet og hurtigt trække halen bagud. Sørg for, at kraniet er adskilt fra den første halshvirvel ved hjælp af din tommelfinger og pegefinger.
- NormAlize luminescens værdier for hver dag mod tilsvarende aflæsninger opnået ved den første dag i bioluminescens imaging som i trin 2.3 (figur 3A).
- Til statistisk analyse, generere overlevelseskurver hjælp af Kaplan-Meier estimator 12 og sammenligne forskellene mellem overlevelseskurverne bruger log-rank test 13.
Representative Results
GL261 celler blev inficeret med luciferase indeholdende lentivirus, som beskrevet ovenfor i trin 1. In vitro bioluminescens imaging viser robust luciferaseekspression ligner niveauer i den positive kontrol U87.luc human glioblastoma-cellelinie (figur 1). Som forventet inficerede GL261 celler demonstrerer ingen baggrund luciferaseekspression. Dette trin er enkle, men alligevel kritisk at udføre forud for yderligere undersøgelser under anvendelse af den inficerede cellelinje at bekræfte stabil luciferaseekspression.
Luciferaseekspression efter intrakraniel implantation.
Før intrakraniel implantation, vi viste ingen forskel i vitro vækst i GL261.luc sammenlignet med GL261 celler (figur 2). For intrakraniel vækst og overlevelse analyse blev celler injiceret i brains af C57BL / 6 mus som per protokol trin 3. tumorvækst i mus, der bærer tumorer GL261.luc blev serielt analyseret for bioluminescens imaging under anvendelse af protokol trin 4 og demonstrerede detekterbar tumorvækst (figur 3A). Mus med GL261.luc tumorer hurtigt og konsekvent blev døende og blev aflivet. Det er vigtigt, er der ingen forskel i den samlede overlevelse mellem GL261.luc og GL261 tumorbærende dyr (figur 3B). In vivo bioluminescens imaging kan derfor anvendes til at monitorere respons på eksperimentelle glioblastom behandlinger. Hurtig pålidelige tumorvækst og kort samlet overlevelse kan give store mængder af data i en relativt kort tid.
Figur 1. Luciferaseaktivitet i GL261.luc celler. U87.luc, GL261.luc og GL261 (negativ kontrol) celler blev udpladet ved densiteter på1,0 x 10 6, 5,0 x 10 5, 2,5 x 10 5, 1,0 x 10 5, 5,0 x 10 4 og 2,5 x 10 4 celler / brønd fra venstre til højre. Luminescens (foton / sek / sr / cm2) blev målt ved lumina imaging stationen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Luciferaseekspression påvirker ikke GL261 celleproliferation. GL261.luc celler ikke forårsage en forskel i proliferation, hvilket fremgår af MTS celleproliferationsassay. Grafen viser fold stigning i forhold til dag 1, som bestemt ved at sammenligne den gennemsnitlige absorbansværdi (gennemsnit ± SEM) ved de specificerede tidspunkt til den gennemsnitlige værdi på dag 1 (uparrede t-test for sammenligninger værdiermellem hver cellelinie: P = 0,7796) 14. Fejl søjler repræsenterer de gennemsnitlige værdier (gennemsnit ± SEM) fra firedobbelte prøver på hver dag. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Luciferaseekspression dosis ikke indflydelse på in vivo tumorvækst og dyrs overlevelse. (A) Bioluminescens overvågning viser progressiv vækst i intrakraniel GL261.luc tumor i C57BL / 6 mus. (B) Kaplan-Meier overlevelse analyse viser ingen forskel i den samlede overlevelse for mus implanteret intrakranielt med enten GL261 (fuldt optrukket linie) eller GL261.luc celler (stiplet linie).Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
GL261 murine gliomaceller, når de implanteres intrakranielt i syngene immunokompetente C57BL / 6-mus, tilbyder flere fordele i forhold til humane gliom xenograft dyremodeller. Mange af xenotransplanterede tumorer vokse som indkapslede læsioner, der ikke nøjagtigt rekapitulere invasiv sygdom hos mennesker. I modsætning hertil GL261 tumor viser ikke kun invasion i tilstødende hjernen, men også neovaskularisering, mitotiske tal, og dyb nekrose 7. Vigtigst når man studerer tumorimmunologi eller immunterapeutiske strategier 15, 16, C57BL / 6 mus bevarer et intakt immunsystem 8. Tidligere undersøgelser har vist robust ekspression af det immunosuppressive cytokin TGF-β og intrakranielle tumorer indeholder immunosuppressive T-regulatoriske celler svarende til human glioblastoma 9, 10.
Den enkle her beskrevne teknik muliggør stabil ekspression af luciferase fra GL261 celler. Vi har for nylig rapporteret SimiLAR in vitro og in vivo væksten af celler GL261.luc sammenlignet med GL261 celler, foruden lignende tumor histologiske karakteristika og immuncelle infiltrere 17. GL261.luc celler stabilt udtrykker luciferase, som katalyserer oxidationen af substratet luciferin konvertere kemisk energi til fotoner og således detekterbar lys. Luciferin kan administreres sikkert til dyr og krydser blodhjernebarrieren efter intraperitoneal eller intravenøs injektion. I små forsøgsdyr såsom mus, kan bioluminescens detekteres eksternt på en ikke-invasiv måde 11. Derfor kan tumorvækst serielt vurderes uden behov for aflivning af dyr eller dyre MRI eller CT-billeddannelse.
De kritiske trin i protokollen indebærer, ikke kun den lentivirale transduktion, men også kontrol af stabil ekspression af luciferase in vitro inden påbegyndelsen af in vivo forsøg. Tab af transduktion kan vandskravenere gentagelse lentivirus-infektion. Indførelse af et antibiotisk resistensgen i ekspressionsvektoren kan også anvendes til at selektere for luciferaseekspression. Omhyggelig teknik er nødvendig for intrakraniel implantation til reproducerbart et sammenhængende antal celler i en præcis anatomisk stedet for at muliggøre sammenligning af forskellige behandlingsgrupper. En væsentlig forskel mellem den nuværende undersøgelse og tidligere undersøgelser af luciferase udtrykker GL261 celler er anvendelsen af en fri hånd teknik til implantering celler sammenlignet med anvendelsen af et stereotaktisk ramme 18. Vi har tidligere demonstreret konsistente implantation resultater med den frie hånd teknik 19. Fordelen ved den frie hånd teknik er evnen til at udføre high throughput analyser af forskellige behandlingsmidler. I vores hænder, kan vi implantere cirka 60 dyr i 1 time.
Efter mastering teknikken, de fremtidige anvendelser af teknikken er ubegrænsede. Som GL261 demonstration indATES forhøjede mitose og vækst hurtige tumor ligner humant glioblastom, kan antiproliferative behandlinger evalueres. Ligeledes kan anti-invasive og antiangiogene terapier anvendes som GL261 tumorer er invasiv og angiogen. Der bør udvises forsigtighed ved vurderingen af effekten af kemoterapeutika rettet mod menneskelige mål. Sammenlignet med tidligere undersøgelser med humane glioblastom xenotransplantater udtrykker luciferase 20, ville dette blive betragtet som en begrænsning af vores model. Desuden kan virkningen af immunterapeutiske strategier for tumorvækst blive undersøgt i GL261 xenotransplanteret model.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechonology | LUCK-100 | Store away from light |
| Living Image Software | Caliper Life Sciences | Contact for Quote | none |
| Xenogen Lumina | Caliper Life Sciences | Contact for Quote | none |
| 24-well; Standard tissue culture; flat-bottom | Falcon | 353047 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | none |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | Contact for Quote | none |
| 96 well Assay Plate, Black Plate, Clear bottom with Lid, Tissue culture Tretaed | Coster | 3603 | none |
| Ketaset | Pfizer | NDC 0856-2013-01 | Control substance |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | 23076-35-9 | none |
| 28G Needle (with syringe) | Fisher | 22-004-270 | AKA Insulin Syringe |
| 2% Chlorhexidine | Fisher | NC9756995 | AKA “Nolvasan” |
| 3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H312P-4 | Store away from light |
| Ophthalmic Ointment | Cardinal Health | 1272830 | AKA “Akwa Tears” |
| 25G 1 1/2 needle | BD Becton Dickinson | 305127 | none |
| Disposable Scalpels | Feather | 2975 | No. 21 |
| Gauze | Fisher | 22028563 | Autoclave before use |
| Heating Pad | Dunlap | HP950 | none |
| Skin Stapler, Staples, Remover | Stoelting | 59020 | none |
| PDI Alchol Prep Pads | Fisher | 23-501-711 | none |
| Reflex 7 mm Wound Clips 100 pack | Brain Tree Scientific, INC | 203 1000 | Autoclave before use |
| Reflex 7 mm Wound Clip Applier | Brain Tree Scientific, INC | 204 1000 | Autoclave before use |
| Reflex 7 mm Wound Clip Remover | Brain Tree Scientific, INC | 205 1000 | none |
| Single Ended Round Tip Swab with Wood handle | Qosmedix | 10107 | Autoclave before use |
| Hanks' Balanced Salt Solution without Ca2+ and Mg2+ (HBSS) | Gibco | 14170-112 | none |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 80300 | none |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2961 | none |
| Bone Wax | Harvard Apparatus | 599864 | none |
References
- Clark, A. J., et al. Neurosurgical management and prognosis of patients with glioblastoma that progresses during bevacizumab treatment. Neurosurgery. 70 (2), 361-370 (2012).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
- Grossman, S. A., et al. Survival of patients with newly diagnosed glioblastoma treated with radiation and temozolomide in research studies in the United States. Clin Cancer Res. 16 (8), 2443-2449 (2010).
- Sughrue, M. E., et al. Immunological considerations of modern animal models of malignant primary brain tumors. J Transl Med. 7 (84), (2009).
- Ausman, J. I., Shapiro, W. R., Rall, D. P. Studies on the chemotherapy of experimental brain tumors: development of an experimental model. Cancer Res. 30 (9), 2394-2400 (1970).
- Zagzag, D., Zhong, H., Scalzitti, J. M., Laughner, E., Simons, J. W., Semenza, G. L. Expression of hypoxia-inducible factor 1alpha in brain tumors: association with angiogenesis, invasion, and progression. Cancer. 88 (11), 2606-2618 (2000).
- Cha, S., et al. Dynamic, contrast-enhanced perfusion MRI in mouse gliomas: correlation with histopathology. Magn Reson Med. 49 (5), 848-855 (2003).
- Ksendzovsky, A., et al. Investigation of immunosuppressive mechanisms in a mouse glioma model. J Neurooncol. 93 (1), 107-114 (2009).
- Biollaz, G., et al. Site-specific anti-tumor immunity: differences in DC function, TGF-beta production and numbers of intratumoral Foxp3+ Treg. Eur J Immunol. 39 (5), 1323-1333 (2009).
- El Andaloussi, A., Han, Y., Lesniak, M. S. Prolongation of survival following depletion of CD4 + CD25+ regulatory T cells in mice with experimental brain tumors. J Neurosurg. 105 (3), 430-437 (2006).
- Dinca, E. B., et al. Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy. J. Neurosurg. 107 (3), 610-616 (2007).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Non-parametric estimation from incomplete observations. J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).
- Peto, R., Peto, J. Asymptotically efficient rank invariant procedures. J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185207 (1972).
- Armitage, P., Berry, G., Matthews, J. N. S. Statistical Methods in Medical Research. , 4th ed, Blackwell Science. Oxford. (2001).
- Newcomb, E. W., et al. The combination of ionizing radiation and peripheral vaccination produces long-term survival of mice bearing established invasive GL261 gliomas. Clin Cancer Res. 12 (15), 4730-4737 (2006).
- Pellegatta, S., et al. Neurospheres enriched in cancer stem-like cells are highly effective in eliciting a dendritic cell-mediated immune response against malignant gliomas. Cancer Res. 66 (21), 10247-10252 (2006).
- Clark, A. J., et al. Stable luciferase expression does not alter immunologic or in vivo growth properties of GL261 murine glioma cells. J Transl Med. 12, 345-34 (2014).
- Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. J Vis Exp. (57), e3403 (2011).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J Vis Exp. (41), (2010).
- Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J Vis Exp. (67), (2012).
