Protocol
Todos os procedimentos descritos abaixo foram revistos e aprovados pelo Institutional Uso de Animais e Cuidados Comitê da Universidade Northwestern e foram realizadas em condições esterilizadas.
1. Modificação de células GL261 com Firefly luciferase Expressando Reporter
NOTA: lentivirais baseados em HIV-1 expressam a luciferase do pirilampo (Fluc) sob o controlo do promotor de baço formadoras de focos de vírus (SFFV). O gene repórter óptica foi clonado no vector plasmídeo pHRSIN-CSGW-dlNotI.
- Manter a 293-T as células em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro a 10% de bovino fetal (FBS) e células GL261 em meio RPMI suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 95 % de ar e 5% de dióxido de carbono (CO 2).
- Quando a cultura de células 293-T atinge 80% de confluência num frasco de T-75, lavar as células uma vez com pHsolução salina de tampão osphate (PBS) sem Ca2 + e Mg2 +, incubar as células com 3 ml de tripsina (0,05%) a 37 ° C durante 5 minutos, tritura-se com uma pipeta de 5 mL, mantendo o balão ligeiramente inclinada e recolher todas as células a partir do fundo do balão. Transferir a 3 ml de suspensão de células tripsinizadas em um tubo de 15 ml, e adiciona 7 ml de meio RPMI carne (um total de 10 ml da suspensão de células).
- Misture bem a suspensão de células com uma pipeta de 5 mL. Tome 100 ul da suspensão de células a partir do tubo e contar o número de células utilizando um hemocitómetro os. Para fazê-lo, misturar 100 ul da suspensão de células com 300 ul de solução de azul de tripano e inserir 2 ul da mistura em um hemocitómetro. Contar o número de células sem coloração azul a partir de quatro pontos de vista distintos, sob um microscópio. Em média, o número de células de cada ponto de vista, como esse número representa 10 4 células / ml.
- Enquanto isso, o tubo de centrífuga contendo a suspensão de células a 300 xg por 7 min. Aspirar os meios de comunicação e ressuspender as peletes de células com meio RPMI fresco para fazer uma suspensão de células a uma densidade de GL261 1,0 x 10 6 / ml. Semente 2,5 x 10 6 células GL261 com 2,5 ml de meio RPMI para um balão T-175, com 27,5 ml de DMEM (dia 1).
- Após 24 horas, substituir o meio com 20 ml de DMEM fresco (dia 2).
- Para produzir o vector lentiviral, misturar o reagente de transfecção de 54 ul com 2 ml de DMEM isento de soro, durante 5 min. Adiciona-se 3 ug de gag-pol, 3 ug de vírus da estomatite vesicular envelope G (VSV-G), e 4,5 ug de Fluc (pSIN-Fluc) em DMEM com o reagente de transfecção, e incubar durante 20 min à temperatura ambiente. Gota a totalidade da mistura de DNA para dentro do balão 293-T (T-175) e incuba-se a 37 ° C numa câmara humidificada contendo 95% de ar e 5% de CO 2 durante 48 horas (dia 2).
- Adicionar 10 ml de DMEM fresco às 24 h após transfecção (volume total de 293-T meio de cultura celular deve ser, aproximadamente, 30 ml) (3 dias).
- Para dividir células GL261 em umPlaca de 24 poços, lave as células uma vez com PBS, sem Ca2 + e Mg2 +, incubar as células com 5 ml de tripsina (0,05%) a 37 ° C durante 5 minutos, tritura-se com uma pipeta de 5 mL, mantendo o balão ligeiramente inclinada , recolher todas as células do fundo do frasco, e contagem de células através de hemocitómetro, como no passo 1.2. Enquanto isso, o tubo de centrifugação a 300 xg durante 7 minutos. Aspirar os meios de comunicação e ressuspender as peletes de células com meio RPMI fresco para fazer uma suspensão de células GL261 a densidade de 2,5 x 10 4 / ml. Semente de 2,5 x 10 4 GL261 células com 1 ml de meio RPMI numa placa de 24 poços (dia 3).
- Recolha de 30 ml de sobrenadante a 10 ml de lentivírus com uma pipeta a partir do balão de 293-T (T-175) em 48 h após transfecção e transferir o sobrenadante para tubo de 50 ml. Aspirar o sobrenadante 30 ml de lentivírus através de uma seringa de 50 ml, através de um filtro de seringa de 0,22 um, e alíquota do sobrenadante viral em alíquotas de 1 ml (dia 4).
- Substitua os 1 ml de RForma PMI em placa de células GL261 (24 poços) com 1 ml de sobrenadante a lentiviral e incubar a 37 ° C numa câmara humidificada (dia 4).
- Após 48 horas de infecção lentiviral, substituir o meio com 1 ml de RPMI fresco (dia 6).
- Após 24 horas, repetir a infecção lentiviral das células GL261 (dia 7).
- Após a 2 ª 48 hr de infecção lentiviral, substituir o meio com 1 ml de RPMI fresco (dia 9).
- Continuar a crescer as células de luciferase modificada GL261 (para ser referido como células GL261.luc) e expandir a cultura de células de um frasco T-75.
- Quando a cultura de células GL261.luc atinge 70% de confluência num frasco de T-75, colher as células por tripsinização e contagem por hemacitómetro como no passo 1.2. Placa da célula GL261.luc em uma placa de 24 poços a densidades de graduação (1,0 x 10 6, 5,0 x 10 5, 2,5 x 10 5, 1,0 x 10 5, 5,0 x 10 4, 2,5 x 10 4 células / cavidade) e incubar a 37 ° C num humidicâmara ficada contendo 95% de ar e 5% de CO 2 durante 3 h.
- Medir celular actividade de luciferase relativa a luciferase modificada U-87 MG (U87.luc) células utilizando imagem de bioluminescência (Figura 1).
- Inicie o software de imagem (ícone na área de trabalho, clique) e inicializar o sistema de imagem (clique em "Inicializar" botão). Inicialização começará automaticamente e pode levar alguns minutos para o sistema de check-up ea câmera para arrefecer a -90 ° C.
- Adicionar 25 ul de luciferina (sal de potássio, D-luciferina 150 mg / kg) em cada poço.
- Incubam-se as células com luciferina, durante 1 min à temperatura ambiente e a imagem da placa durante 10 segundos. Para configurar o sistema de imagem, selecione "luminescentes", "10 segundos" tempo de exposição, e binning "Medium". Colocar a placa de 24 poços na estação de imagens e clicar no botão "adquirir" para iniciar a imagem.
- Depois que a imagem é adquirida com sucesso, você verá uma janela de imagem e ferramenta de palette na tela. Clique em "ROI (regiões de interesse) Ferramentas" e selecione 6 x 4 a partir do ícone de fenda. Criar 6 x 4 fendas para cobrir a área de sinal na imagem da placa de 24 poços e clique na guia medições (ícone do lápis). Observe uma janela com uma tabela de medidas de ROI como unidade de fótons por segundo por esterradiano por metro quadrado cm (fótons / seg / sr / cm 2).
- As células usam U87.luc, previamente modificado com o mesmo lentivírus utilizado aqui para a modificação GL261 11, como um controlo para avaliar a actividade da luciferase em células GL261.luc transduzidas.
2. Ensaio de Proliferação In Vitro
- Quando as culturas de células e GL261 GL261.luc atingir 70% de confluência num frasco de T-75, a colheita das linhas de células por tripsinização e ambos contam como no passo 1.2, e células da placa para uma placa de 96 poços a uma densidade de 1500 células 80 ul de meio RPMI por poço utilizando uma pipeta de canais múltiplos e para minimizar o tempo de erro de pipetagem. Seed cada linha celular total de 20 poços em. Para limitar a evaporação nas cavidades povoadas por células, encher poços vazios com 100 ul de meio RPMI fresco.
- Avaliar a proliferação celular utilizando um ensaio de proliferação celular colorimétrico. Aqui usamos o ensaio de proliferação celular MTS. Usando uma pipeta de multi-canal, adicionar 20 ul de reagente MTS em cada poço da placa de 96 poços que contêm as células.
- Incubar a placa a 37 ° C numa câmara humidificada contendo 95% de ar e 5% de CO 2 durante 3 h. Medir a absorvância a 490 nm utilizando um leitor de microplacas. Isto é repetido nos dias 1, 2, 4, e 7, após o plaqueamento. Para normalizar os valores de absorção, os valores de cada dia são divididas pelas leituras correspondentes obtidos no dia 1 (Figura 2).
3. Tumor Implantação celular
Nota: Autoclave todo o equipamento. Prepare a área cirúrgica por pulverização de uma (solução de clorexidina a 2%) desinfetante e cubra com absorbent cortinas. A fim de manter condições estéreis, usar luvas cirúrgicas estéreis durante a cirurgia, e dividir a área cirúrgica em duas áreas de fita cor. Área 1 é rotulado de "Clean" e contém suprimentos esterilizados; Área 2 é rotulado como "sujo" e contém materiais utilizados.
- Antes da cirurgia animal, preparar uma suspensão de células para a injeção intracraniana. Colheita de células confluentes a partir de um 70% de T-75 balão por tripsinização e contagem de células através de hemocitómetro, como no passo 1.2, e fazer uma suspensão de células a uma densidade de 1,0 x 10 5 células / ml em solução salina equilibrada de Hanks sem Ca 2+ e Mg2 + (HBSS).
- Anestesiar ratos com injecção intraperitoneal de 200 ul de mistura contendo 100 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg de xilazina em 0,9% de solução salina. Para confirmar anesthetization adequada, aperte a ponta do mouse. Se o mouse é completamente sob anestesia, o mouse não deve responder ao estímulo.
- Administrar 0,1 mg / kg de buprenorfina por via de injecção subcutânea para aliviar a dor pós-operatória.
- Raspar a parte superior da cabeça dos animais usando clippers e limpo, com um aplicador de algodão-ponta mergulhado em solução de clorexidina a 2%. Aplicar pomada para manter a lubrificação adequada durante a cirurgia.
- Faça uma incisão sagital cerca de 1 cm de comprimento sobre o osso parieto-occipital utilizando um bisturi estéril. Para visualizar a bregma, limpar a superfície do crânio com um aplicador de algodão-ponta embebida em uma solução de peróxido de hidrogénio a 3%.
- Perfurar o crânio com uma agulha estéril de 25-G para fazer um pequeno buraco de 3 mm a direita do bregma e apenas atrás da sutura coronal.
- Para garantir que no local da injecção intracraniana é até uma profundidade de 3 mm do crânio, cortar 3 mm de folga da extremidade pontiaguda de uma ponta de pipeta 20 ul usando uma tesoura e inserir uma seringa para a ponta da pipeta.
- Inserir a seringa perpendicularmente ao buraco criado anteriormente, e injecte lentamente a sus células tumoraispensões contendo 3,0 x 10 5 células em 3 ul de HBSS, ao longo de um período de 1 min. Deixe a agulha no lugar por mais um minuto, e em seguida, puxe lentamente para fora da agulha.
- Swab o crânio com aplicador de algodão-tip embebido em 3% de peróxido de hidrogénio e a solução de clorexidina a 2%. Seque a superfície do crânio com o aplicador de algodão-ponta. Cortar a cera de osso estéril cerca de 3 mm 3 em tamanho e anexar a cera de osso no lado da extremidade do aplicador de algodão-ponta. Aplique a cera de osso para cobrir o buraco com o aplicador de algodão-ponta.
- Desenhar a cada lado do couro cabeludo em conjunto sobre o crânio com a pinça, e grampos para fechar a ferida. Limpar a ferida com um algodão-tip embebido em solução de clorexidina a 2%.
- Monitorar todos os ratos pós-operatório até que se tornem ambulante e manter a atividade normal. Normalmente, o tempo de recuperação é de aproximadamente 30 min. Não devolva os ratos para a gaiola com outros animais até que eles se recuperaram totalmente da anestesia.
- Borrife uma quantidade generosa de desinfectante (solução de cloreto de amónio dimetil 0,05%) em uma toalha de papel limpa. Use o papel toalha encharcada de desinfetante para limpar completamente a folha de preto, cones do nariz e divisor dentro da câmara de imagem onde os animais estarão em contacto com o dispositivo. Limpe completamente todas as superfícies com uma toalha de papel limpo e seco. Repita esta mais uma vez e esperar 5 min.
- Inicializar a estação de imagens como no passo 1.14.1.
- Anestesiar o rato com uma mistura de 300 ul contendo 200 ul de cetamina / xilazina e 100 ul de luciferina (sal de potássio, D-luciferina 150 mg / kg) por injecção intraperitoneal.
- Esperar 10 min após a injecção e confirmar se os ratos estão completamente sob anestesia por beliscar a cauda. Para configurar o sistema de imagem, selecione "luminescentes", vez "Auto" exposição e binning "Medium". Colocar os ratinhos no stati imagiologiaem e clique no botão "Adquirir" para iniciar a imagem. Assegure-se que o tempo após a injecção é consistente com cada sessão de imagem.
- Depois que a imagem é adquirida com sucesso, uma janela de imagem e paleta de ferramentas deve aparecer. Clique em "Ferramentas" e selecione ROI "auto" do ícone do círculo. Para definir ROIs, cercar a área do sinal na imagem, e em seguida, tomar medidas do ROI como unidade de fótons / seg / SR / cm2.
- Tome os ratos para fora da câmara de imagem e monitorar os ratos até que se tornem ambulante e manter a atividade normal. Normalmente o tempo de recuperação é de aproximadamente 15 min. Não devolva os ratos para a gaiola com outros animais até que eles se recuperaram totalmente da anestesia.
- Monitorizar o crescimento do tumor por imagem de bioluminescência duas vezes por semana até os animais apresentam os seguintes sintomas: perda de peso (perda de mais de 20% em relação ao peso antes da implantação), inapetência (anorexia completa durante 24 h), e falta de purposefu sustentadal resposta a estímulos suave (fraca tentativa de levantar-se), momento em que eles devem ser sacrificados. Eutanásia animais com estes sintomas usando uma câmara de CO 2, seguida por deslocação cervical.
- Coloque os ratos para a câmara de eutanásia (não devem ser lotados na câmara) e influxo comprimido CO 2 por 5-6 min. Observe que todos os animais são inconsciência e não respirar após cerca de 5 min.
- Tome os ratos para fora da câmara. Certifique-se de que o coração não está batendo, sentindo o peito entre o polegar eo indicador e verificar que não há reflexo de piscar.
- Restringir o rato em uma posição de bruços sobre uma superfície plana e agarrar a parte de trás do pescoço, na base do crânio com uma mão e a base da cauda com o polegar e o dedo indicador da outra mão.
- Contenha o cabeça e rapidamente puxar a cauda para trás. Certifique-se de que o crânio é separado da primeira vértebra cervical usando o polegar eo dedo indicador.
- Normavalores de luminescência alize para cada dia contra as leituras correspondentes obtidos no primeiro dia de imagem de bioluminescência como no passo 2.3 (Figura 3A).
- Para a análise estatística, gerar curvas de sobrevivência utilizando o estimador de Kaplan-Meier 12 e comparar as diferenças entre as curvas de sobrevivência utilizando um teste de log-rank 13.
Representative Results
GL261 células foram infectadas com lentivírus contendo luciferase como descrito acima nos passos 1. In vitro imagem de bioluminescência robusta demonstra a expressão de luciferase em níveis semelhantes aos do controlo positivo U87.luc linha celular de glioblastoma humano (Figura 1). Como esperado, as células não infectadas GL261 demonstrar nenhuma expressão fundo da luciferase. Este passo é simples, mas crítico para executar antes de mais estudos utilizando a linha celular infectada para confirmar a expressão de luciferase estável.
A expressão de luciferase após a implantação intracraniana.
Antes de implantação intracraniana, que não demonstrou nenhuma diferença na taxa de crescimento in vitro de células em comparação com GL261.luc GL261 (Figura 2). Para o crescimento intracraniana e análise de sobrevivência, as células foram injectadas no brains de ratinhos C57BL / 6, conforme o protocolo passo 3. O crescimento do tumor em ratinhos portadores de tumores GL261.luc foi serialmente analisados para imagem de bioluminescência usando o protocolo passo 4 e demonstraram um crescimento tumoral detectável (Figura 3A). Os ratinhos portadores de tumores GL261.luc rapidamente e tornou-se de forma consistente e moribundos foram eutanizados. É importante notar, não há qualquer diferença na sobrevivência global entre GL261.luc e GL261 animais portadores de tumor (Figura 3B). In vivo, a bioluminescência de imagem, por conseguinte, pode ser utilizado para monitorizar a resposta ao tratamento de glioblastoma experimentais. O crescimento do tumor de confiança rápida e curta sobrevida global pode produzir grandes quantidades de dados em um período relativamente curto de tempo.
Figura 1. A actividade de luciferase em células GL261.luc. U87.luc, células GL261.luc e GL261 (controlo negativo) foram semeadas a densidades de1,0 x 10 6, 5,0 x 10 5, 2,5 x 10 5, 1,0 x 10 5, 5,0 x 10 4, e 2,5 x 10 células / cavidade 4 da esquerda para a direita. Luminescência (fótons / seg / sr / cm 2) foi medido pela estação de imagens Lumina. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Expressão de Luciferase não afecta a proliferação de células GL261. GL261.luc células não causam um diferença na proliferação como demonstrado pela MTS ensaio de proliferação celular. O gráfico mostra o aumento de vezes, em relação ao dia 1, tal como determinado comparando o valor médio de absorvância (média ± SEM) no ponto de tempo thespecified ao valor médio no dia 1 (t -test valores desemparelhados para comparaçõesentre cada linha celular: P = 0,7796) 14. As barras de erro representam os valores médios (média ± SEM) a partir de amostras em quadruplicado em cada dia. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. a expressão de luciferase dose não afetar em no crescimento do tumor in vivo e sobrevivência animal. (A) o monitoramento bioluminescência demonstra o crescimento progressivo do tumor GL261.luc intracraniana em camundongos C57BL / 6. (B) análise de sobrevivência de Kaplan-Meier demonstra nenhuma diferença na sobrevida global para os ratos implantados intracranially com a utilização de células GL261 (linha sólida) ou GL261.luc (linha a tracejado).Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
GL261 células de glioma de murino, quando implantadas intracranianamente em imunocompetentes singeneicos C57BL / 6, oferecem várias vantagens em relação aos modelos de glioma de xenoenxerto em animais humanos. Muitos tumores de xenoenxerto cresce como lesões encapsuladas que não recapitulam exacta da doença humana invasiva. Em contraste, tumor GL261 não só demonstra invasão cerebral adjacente, mas também a neovascularização, figuras mitóticas, necrose 7 e profunda. O mais importante quando se estuda imunologia tumor ou estratégias imunoterapêuticas 15, 16, a C57BL / 6 do mouse mantém um sistema imunológico intacto 8. Estudos anteriores demonstraram expressão robusta da citoquina imunossupressora de TGF-β e tumores intracranianos contêm células T-reguladoras imunossupressores semelhantes ao glioblastoma humano 9, 10.
A técnica simples descrito aqui permite a expressão estável de luciferase por células GL261. Nós recentemente relataram simiLar in vitro e in vivo o crescimento de células em comparação com as células GL261.luc GL261, para além das características histológicas semelhantes de tumor e células imunitárias infiltrar 17. Células GL261.luc expressar estavelmente luciferase, que catalisa a oxidação do substrato luciferina converter energia química em fotões de luz e portanto detectável. Luciferina pode ser administrado com segurança a animais e atravessa a barreira hemato-encefálica após injecção intraperitoneal ou intravenosa. Em pequenos animais de pesquisa, tais como murganhos, a bioluminescência podem ser detectados externamente de forma não-invasiva 11. Portanto, o crescimento do tumor pode ser avaliada em série, sem a necessidade de sacrifício do animal ou dispendiosa imagiologia MRI ou CT.
Os passos críticos no protocolo envolvem, não só a transdução de lentivírus, mas também a verificação da expressão estável de luciferase in vitro antes de iniciar quaisquer experiências in vivo. Perda de transdução pode require infecção por lentivírus de repetição. Introdução de um gene de resistência a antibiótico no vector de expressão também pode ser utilizado para seleccionar para expressão da luciferase. Técnica meticulosa é necessária para a implantação intracraniana de colocar de forma reprodutível um número consistente de células numa localização anatómica precisa para permitir a comparação de grupos de tratamento diferentes. Uma das principais diferenças entre o presente estudo e estudos anteriores de células que expressam luciferase GL261 é a utilização de uma técnica de mão livre para a implantação de células em comparação com a utilização de uma moldura estereotáxica 18. Temos anteriormente demonstrado resultados consistentes com a implantação técnica de mão livre 19. A vantagem da técnica de mão livre é a capacidade de realizar análises de alto rendimento de agentes de tratamento diferentes. Em nossas mãos, nós podemos implantar cerca de 60 animais em 1 hora.
Depois de dominar a técnica, as futuras aplicações da técnica são ilimitadas. Como GL261 demonstrates elevados mitoses e o crescimento rápido do tumor semelhante ao glioblastoma humano, os tratamentos anti-proliferativos podem ser avaliadas. Do mesmo modo, as terapias anti-invasivas e anti-angiogénicas podem ser utilizadas como os tumores GL261 são invasivos e angiogénico. O cuidado deve ser usado para avaliar o efeito de agentes quimioterápicos que visam alvos humanos. Em comparação com estudos anteriores utilizando xenoenxertos de glioblastoma humano que expressam luciferase 20, isso seria considerado uma limitação do nosso modelo. Além disso, o efeito de estratégias imunoterapêuticas de crescimento do tumor podem ser estudados no modelo de xenoenxerto GL261.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechonology | LUCK-100 | Store away from light |
| Living Image Software | Caliper Life Sciences | Contact for Quote | none |
| Xenogen Lumina | Caliper Life Sciences | Contact for Quote | none |
| 24-well; Standard tissue culture; flat-bottom | Falcon | 353047 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | none |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | Contact for Quote | none |
| 96 well Assay Plate, Black Plate, Clear bottom with Lid, Tissue culture Tretaed | Coster | 3603 | none |
| Ketaset | Pfizer | NDC 0856-2013-01 | Control substance |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | 23076-35-9 | none |
| 28G Needle (with syringe) | Fisher | 22-004-270 | AKA Insulin Syringe |
| 2% Chlorhexidine | Fisher | NC9756995 | AKA “Nolvasan” |
| 3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H312P-4 | Store away from light |
| Ophthalmic Ointment | Cardinal Health | 1272830 | AKA “Akwa Tears” |
| 25G 1 1/2 needle | BD Becton Dickinson | 305127 | none |
| Disposable Scalpels | Feather | 2975 | No. 21 |
| Gauze | Fisher | 22028563 | Autoclave before use |
| Heating Pad | Dunlap | HP950 | none |
| Skin Stapler, Staples, Remover | Stoelting | 59020 | none |
| PDI Alchol Prep Pads | Fisher | 23-501-711 | none |
| Reflex 7 mm Wound Clips 100 pack | Brain Tree Scientific, INC | 203 1000 | Autoclave before use |
| Reflex 7 mm Wound Clip Applier | Brain Tree Scientific, INC | 204 1000 | Autoclave before use |
| Reflex 7 mm Wound Clip Remover | Brain Tree Scientific, INC | 205 1000 | none |
| Single Ended Round Tip Swab with Wood handle | Qosmedix | 10107 | Autoclave before use |
| Hanks' Balanced Salt Solution without Ca2+ and Mg2+ (HBSS) | Gibco | 14170-112 | none |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 80300 | none |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2961 | none |
| Bone Wax | Harvard Apparatus | 599864 | none |
References
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