Protocol
Todos los procedimientos descritos a continuación se han revisado y aprobado por el Institutional Animal Uso y Comité de Cuidado de la Universidad Northwestern y se han realizado en condiciones estériles.
1. Modificación de las células GL261 con el reportero de luciferasa de luciérnaga Expresando
NOTA: los vectores lentivirales basados en VIH-1 expresan la luciferasa de luciérnaga (Fluc) bajo el control del promotor de virus de enfoque de formación de bazo (SFFV). El gen indicador óptico ha sido clonado en el plásmido vector pHRSIN-CSGW-dlNotI.
- Mantener 293-T células en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y GL261 células en medio RPMI suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 95 % de aire y 5% de dióxido de carbono (CO 2).
- Cuando el cultivo de células 293-T alcanza el 80% de confluencia en un matraz T-75, se lavan las células una vez con phsolución salina tamponada con osphate (PBS) sin Ca2 + y Mg2 +, incubar las células con 3 ml de tripsina (0,05%) a 37 ° C durante 5 min, se tritura con una pipeta de 5 ml manteniendo el matraz ligeramente inclinada y recoger todas las células desde el fondo del matraz. Transferir el 3 ml de suspensión celular tripsinizada en un tubo cónico de 15 ml, y añadir 7 ml de medio RPMI carne (un total de 10 ml de la suspensión celular).
- Mezclar la suspensión de células bien con una pipeta de 5 ml. Tomar 100 l de la suspensión celular del tubo y contar el número de las células utilizando un hemocitómetro. Para ello, se mezclan 100 l de la suspensión celular con 300 l de solución de azul de tripano e inserte 2 l de la mezcla en un hemocitómetro. Cuente el número de las células sin tinción con azul de cuatro vistas separadas bajo un microscopio. Promedio, el número de células de cada punto de vista, ya que este número representa 10 4 células / ml.
- Mientras tanto, centrifugar el tubo que contiene la suspensión celular a 300 g durante 7 min. Aspirar los medios de comunicación y resuspender los sedimentos celulares con medio RPMI fresco para hacer una suspensión celular GL261 a una densidad de 1,0 x 10 6 / ml. Semilla de 2,5 x 10 6 células GL261 con 2,5 ml de medio RPMI en un matraz T-175 con 27,5 ml de DMEM (día 1).
- Después de 24 horas, sustituya el medio con 20 ml de DMEM fresco (día 2).
- Para producir el vector lentiviral, mezclar el reactivo de transfección 54 l con 2 ml de DMEM libre de suero durante 5 min. Añadir 3 g de gag-pol, 3 g de virus de la estomatitis vesicular G envolvente (VSV-G), y 4,5 g de Fluc (pSIN-Fluc) en el DMEM con reactivo de transfección, y se incuba durante 20 min a TA. Caída de toda la mezcla de ADN en 293-T matraz (T-175) y se incuba a 37 ° C en una cámara humidificada que contiene 95% de aire y 5% de CO 2 durante 48 horas (día 2).
- Añadir 10 ml de DMEM fresco a las 24 horas después de la transfección (volumen total de 293-T medio de cultivo celular debe ser de aproximadamente 30 ml) (día 3).
- Para dividir las células GL261 en unPlaca de 24 pocillos, se lavan las células una vez con PBS sin Ca2 + y Mg2 +, incubar las células con 5 ml de tripsina (0,05%) a 37 ° C durante 5 min, se tritura con una pipeta de 5 ml manteniendo el matraz ligeramente inclinado , recoger todas las células de la parte inferior del frasco, y contar las células a través de hemocitómetro como en el paso 1.2. Mientras tanto, Centrifugar el tubo a 300 xg durante 7 min. Aspirar los medios de comunicación y resuspender los sedimentos celulares con medio RPMI fresco para hacer una suspensión celular GL261 a una densidad de 2,5 x 10 4 / ml. Semilla de 2,5 x 10 4 células GL261 con 1 ml de medio RPMI en una placa de 24 pocillos (día 3).
- Recoger 30 ml del sobrenadante con 10 ml lentiviral pipeta del frasco 293-T (T-175) a las 48 h después de la transfección y transferir el sobrenadante a 50 ml de tubo cónico. Aspirar el sobrenadante 30 ml lentiviral a través de una jeringa de 50 ml, a través de un filtro de jeringa de 0,22 m, y alícuota del sobrenadante viral en alícuotas de 1 ml (día 4).
- Reemplace las 1 ml de RMedio PMI en placa celular GL261 (24 pocillos) con 1 ml del sobrenadante lentiviral y se incuba a 37 ° C en una cámara humidificada (día 4).
- Después de 48 h de la infección lentiviral, sustituir el medio con 1 ml de RPMI fresco (día 6).
- Después de 24 horas, repita la infección lentiviral de las células GL261 (día 7).
- Después de la hora de la infección lentiviral 2º 48, sustituir el medio con 1 ml de RPMI (día 9).
- Continuar para crecer las células GL261 luciferasa modificado (que se denominará como células GL261.luc) y expandir el cultivo celular a un matraz T-75.
- Cuando el cultivo celular GL261.luc llega a 70% de confluencia en un matraz T-75, recoger las células por tripsinización y contar por hemocitómetro como en el paso 1.2. Placa de la célula GL261.luc en una placa de 24 pocillos a densidades que se gradúan (1,0 x 10 6, 5,0 x 10 5, 2,5 x 10 5, 1,0 x 10 5, 5,0 x 10 4, 2.5 x 10 4 células / pocillo) y incubar a 37 ° C en un humidicámara cado que contiene 95% de aire y 5% de CO 2 durante 3 horas.
- Medir la actividad luciferasa celular en relación con luciferasa U-87 MG (U87.luc) células por medio de imágenes de bioluminiscencia (Figura 1) modificada.
- Inicie el software de imagen (haga clic en el icono en el escritorio) e inicializar el sistema de imagen (haga click en "Initialize"). Inicialización comenzará automáticamente y puede tardar varios minutos para que el sistema de facturación y la cámara enfriar a -90 ° C.
- Añadir 25 l de luciferina (sal de potasio de D-luciferina, 150 mg / kg) en cada pocillo.
- Se incuban las células con luciferina durante 1 min a TA y la imagen de la placa durante 10 s. Para configurar el sistema de imagen, seleccione "luminiscentes", "10 segundos" el tiempo de exposición, y hurgar en la basura "Medium". Coloque la placa de 24 pocillos en la estación de imagen y haga clic en el botón "Adquirir" para comenzar a imagen.
- Después de que la imagen se adquirió con éxito, usted verá una ventana de la imagen y la herramienta paLette en la pantalla. Haga clic en "ROI (regiones de interés) Herramientas" y seleccione 6 x 4 desde el icono de hendidura. Crear 6 x 4 ranuras para cubrir el área de la señal en la imagen de la placa de 24 pocillos y haga clic en la pestaña mediciones (icono de lápiz). Observar una ventana con una tabla de mediciones de ROI como unidad de fotones por segundo por estereorradián por cm cuadrado (fotones / s / sr / cm 2).
- Las células utilizan U87.luc, modificados previamente con el mismo lentivirus utilizado aquí para la modificación GL261 11, como control para evaluar la actividad de luciferasa en las células transducidas GL261.luc.
2. In Vitro Ensayo de proliferación
- Cuando los cultivos de células GL261 y GL261.luc alcanzan 70% de confluencia en un matraz T-75, cosechar las dos líneas celulares mediante tripsinización y contar como en el paso 1.2, y células de la placa en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1500 células en 80 l de medio RPMI por pocillo usando una pipeta multicanal para minimizar el tiempo y el error de pipeteo. Seed cada línea celular en 20 pozos totales. Para limitar la evaporación en los pocillos pobladas por células, llenar pocillos vacíos con 100 l de medio RPMI fresco.
- Evaluar la proliferación celular utilizando un ensayo de proliferación celular colorimétrico. Aquí se utiliza el ensayo de proliferación celular MTS. Usando una pipeta multicanal, añadir 20 l de reactivo MTS a cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contiene células.
- Incubar la placa a 37 ° C en una cámara húmeda que contiene 95% de aire y 5% de CO 2 durante 3 horas. Medir la absorbancia a 490 nm usando un lector de microplacas. Esto se repite en los días 1, 2, 4, y 7, después de la siembra. Para normalizar los valores de absorbancia, los valores de cada día están divididas por las lecturas correspondientes obtenidos en el día 1 (Figura 2).
3. Implantación de la célula tumoral
Nota: Autoclave todo el equipo. Preparar área quirúrgica por pulverización de una (solución de clorhexidina al 2%) desinfectantes y cubrir con absorbencamisetas oscuras. Con el fin de mantener las condiciones estériles, use guantes quirúrgicos estériles durante la cirugía, y dividir el área quirúrgica en dos áreas de la cinta de color. Área 1 tiene la etiqueta "limpio" y contiene suministros esterilizados; Zona 2 tiene la etiqueta "sucio" y contiene materiales utilizados.
- Antes de la cirugía animal, preparar una suspensión de células para la inyección intracraneal. Cosecha de células confluentes un 70% T-75 matraz por tripsinización y contar las células a través de hemocitómetro como en el paso 1.2, y hacer una suspensión celular a una densidad de 1,0 x 10 5 células / l en solución salina equilibrada de Hanks sin Ca 2+ y Mg 2+ (HBSS).
- Anestesiar ratones con inyección intraperitoneal de 200 l que contiene mezcla de 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilazina en 0.9% de solución salina. Para confirmar la anestesia adecuada, apriete la punta del ratón. Si el ratón es completamente bajo la anestesia, el ratón no responde al estímulo.
- Administrar 0,1 mg / kg de buprenorfina por vía subcutánea para aliviar el dolor post-operatorio.
- Afeitarse la parte superior de la cabeza de los animales utilizando tijeras y limpio, con un aplicador de algodón-tip humedecido en solución de clorhexidina al 2%. Aplicar pomada para los ojos para mantener una lubricación adecuada durante la cirugía.
- Haga una incisión sagital aproximadamente 1 cm de longitud sobre el hueso parietooccipital utilizando un bisturí estéril. Para visualizar el bregma, limpie la superficie del cráneo con un aplicador de algodón de punta empapado en una solución de peróxido de hidrógeno al 3%.
- Perforar el cráneo con una aguja de 25 G estéril para hacer un pequeño agujero de 3 mm a la derecha de la bregma y justo detrás de la sutura coronal.
- Para asegurarse de que el sitio de inyección intracraneal es a una profundidad de 3 mm en el cráneo, corte 3 mm fuera de la punta de una punta de pipeta 20 l con unas tijeras e insertar una jeringa en la punta de pipeta.
- Inserte la jeringa perpendicular al agujero creado previamente, e inyectar lentamente el SUS células tumoralespensión que contiene 3,0 x 10 5 células en 3 l HBSS, durante un periodo de 1 min. Deje la aguja en su lugar por un minuto, y luego tire lentamente la aguja.
- Limpie la calavera con aplicador de algodón-tip humedecido en peróxido de hidrógeno al 3% y la solución de clorhexidina al 2%. Seque la superficie del cráneo con el aplicador de algodón de punta. Cortar la cera de hueso estéril aproximadamente 3 mm 3 en tamaño y colocar la cera de hueso en el lado extremo del aplicador de algodón de punta. Aplique la cera de hueso para cubrir el agujero con el aplicador de algodón de punta.
- Dibuje la cada lado del cuero cabelludo a más de cráneo con unas pinzas y grapas para cerrar la herida. Limpie la herida con una punta de algodón humedecido en solución de clorhexidina al 2%.
- Supervisar todos los ratones después de la operación hasta que se convierten ambulante y mantener la actividad normal. Por lo general, el tiempo de recuperación es de aproximadamente 30 min. No devuelva los ratones a la jaula con otros animales hasta que se hayan recuperado totalmente de la anestesia.
- Rocíe una generosa cantidad de desinfectante (solución de cloruro de dimetil amonio 0,05%) en una toalla de papel limpia. Utilice la toalla de papel desinfectante empapados para limpiar a fondo la hoja de negro, conos de ojiva y el divisor dentro de la cámara de imágenes donde los animales estarán en contacto con el dispositivo. Limpie completamente todas las superficies con una toalla de papel limpia y seca. Repita esto una vez más y esperar 5 minutos.
- Inicialice la estación de imagen como en el paso 1.14.1.
- Anestesiar al ratón con una mezcla de 300 l que contiene 200 l de ketamina / xilazina y 100 l de luciferina (sal de potasio de D-luciferina, 150 mg / kg) por inyección intraperitoneal.
- Espere 10 minutos después de la inyección y confirmar si los ratones son completamente bajo anestesia pellizcando la cola. Para configurar el sistema de imagen, seleccione "luminiscentes", tiempo de exposición "Auto", y hurgar en la basura "Medium". Coloca los ratones en el Stati imágenesy haga clic en el botón "Adquirir" para comenzar a imagen. Asegúrese de que el tiempo después de la inyección es consistente con cada sesión de imágenes.
- Después de que la imagen se adquirió con éxito, debería aparecer una ventana de imagen y la paleta de herramientas. Haga clic en "Herramientas de ROI" y seleccione "auto" en el icono de círculo. Para definir regiones de interés, rodear el área de la señal en la imagen, y luego tomar medidas del ROI como unidad de fotones / seg / sr / cm2.
- Tome los ratones fuera de la cámara de formación de imágenes y supervisar los ratones hasta que se convierten ambulante y retener la actividad normal. Normalmente el tiempo de recuperación es de aproximadamente 15 min. No devuelva los ratones a la jaula con otros animales hasta que se hayan recuperado totalmente de la anestesia.
- Monitorear el crecimiento del tumor por imágenes de bioluminiscencia dos veces a la semana hasta que los animales presentan los siguientes síntomas: pérdida de peso (pérdida de más de 20% con respecto al peso antes de la implantación), inapetencia (anorexia completa para 24 hr), y la falta de purposefu sostenidal respuesta a estímulos suaves (débil intento de levantarse), momento en el que deben ser sacrificados. La eutanasia a los animales con estos síntomas utilizando una cámara de CO 2 seguido por dislocación cervical.
- Coloque los ratones en la cámara de la eutanasia (hacerlo no estaba abarrotada de la cámara) y entrada de comprimidos de CO2 durante 5-6 min. Observe que todos los animales son la inconsciencia y no respira después de aproximadamente 5 minutos.
- Tome los ratones fuera de la cámara. Asegúrese de que el corazón no está latiendo al sentir el pecho entre el pulgar y el índice y compruebe que no hay reflejo de parpadeo.
- Restringir el ratón en una posición boca abajo sobre una superficie plana y captar la parte posterior del cuello en la base del cráneo con una mano y base de la cola con el pulgar y el dedo índice de la otra mano.
- Restringir la cabeza y tirar rápidamente la cola hacia atrás. Asegúrese de que el cráneo está separada de la primera vértebra cervical con el dedo pulgar y el dedo índice.
- Normalos valores de luminiscencia alize para cada día contra las lecturas correspondientes obtenidos en el primer día de imágenes de bioluminiscencia como en el paso 2.3 (Figura 3A).
- Para el análisis estadístico, generar curvas de supervivencia utilizando el estimador de Kaplan-Meier 12 y comparar las diferencias entre las curvas de supervivencia mediante una prueba de log-rank 13.
Representative Results
GL261 células fueron infectadas con lentivirus que contiene luciferasa como se describió anteriormente en los pasos 1. In vitro imágenes de bioluminiscencia demuestra robusta expresión de luciferasa similar a los niveles en el control positivo U87.luc línea celular de glioblastoma humano (Figura 1). Como era de esperar, las células no infectadas GL261 demuestran ninguna expresión fondo luciferasa. Este paso es simple pero fundamental para llevar a cabo antes de que otros estudios utilizando la línea celular infectado para confirmar la expresión de luciferasa estable.
La expresión de luciferasa después de la implantación intracraneal.
Antes de la implantación intracraneal, se demostró ninguna diferencia en la tasa de crecimiento in vitro de GL261.luc comparación con las células GL261 (Figura 2). Para el crecimiento intracraneal y el análisis de supervivencia, las células se inyectan en el brains de C57BL / 6 ratones según el protocolo el paso 3. El crecimiento del tumor en ratones portadores de tumores GL261.luc se analizó en serie para formación de imágenes de bioluminiscencia utilizando protocolo de paso 4 y demostraron el crecimiento del tumor detectable (Figura 3A). Los ratones portadores de tumores GL261.luc rápida y consistentemente se convirtieron moribundo y se sacrificaron. Es importante destacar que no hay diferencia en la supervivencia global entre GL261.luc y tumor GL261 teniendo animales (Figura 3B). In vivo, por tanto, imágenes de bioluminiscencia se puede utilizar para monitorizar la respuesta a los tratamientos experimentales de glioblastoma. El crecimiento del tumor fiable rápida y corta supervivencia global pueden producir grandes cantidades de datos en un período relativamente corto de tiempo.
Figura 1. La actividad de luciferasa en las células GL261.luc U87.luc, las células GL261.luc y GL261 (control negativo) se sembraron a densidades de.1.0 x 10 6, 5,0 x 10 5, 2,5 x 10 5, 1,0 x 10 5, 5,0 x 10 4, y 2,5 x 10 4 células / pocillo de izquierda a derecha. Luminiscencia (fotones / s / sr / cm 2) se midió por la estación de imágenes lumina. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La expresión de luciferasa no afecta a la proliferación celular GL261. GL261.luc células no causan una diferencia en la proliferación como se demuestra por ensayo de proliferación celular MTS. El gráfico muestra veces mayor, con relación al día 1, como se determina comparando el valor medio de absorbancia (media ± SEM) en el punto de tiempo thespecified al valor normal en el día 1 (valores de t-test no apareados para las comparacionesentre cada línea celular: P = 0,7796) 14. Las barras de error representan los valores medios (media ± SEM) a partir de muestras por cuadruplicado en cada día. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. La expresión de luciferasa dosis no afecta sobre el crecimiento in vivo del tumor y la supervivencia animal. (A) el seguimiento bioluminiscencia demuestra el crecimiento progresivo del tumor intracraneal GL261.luc en ratones C57BL / 6. (B) el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier demuestra ninguna diferencia en la supervivencia general para los ratones implantados intracranealmente con células GL261 (línea continua) o GL261.luc (Linea discontinua).Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Células de glioma murino GL261, cuando se implanta intracranealmente en inmunocompetentes singénica C57BL / 6 ratones, ofrecen varias ventajas en comparación con los modelos de xenoinjerto animales de glioma humano. Muchos de los tumores xenoinjertados crecer como lesiones encapsuladas que no recapitulan con precisión la enfermedad humana invasiva. Por el contrario, tumor GL261 no sólo demuestra la invasión en el cerebro adyacente, sino también la neovascularización, mitosis y necrosis profunda 7. Lo más importante en el estudio de la inmunología tumoral o estrategias inmunoterapéuticas 15, 16, el ratón C57BL / 6 retiene un sistema inmunológico intacto 8. Estudios anteriores han demostrado sólida expresión de la citoquina inmunosupresora TGF-β y tumores intracraneales contener células T reguladoras inmunosupresores similares a glioblastoma humano 9, 10.
La técnica simple descrito aquí permite la expresión estable de la luciferasa por las células GL261. Recientemente hemos informado de similar in vitro e in vivo el crecimiento de las células GL261.luc comparación con las células GL261, además de las características histológicas del tumor y similares de células inmunes infiltrarse 17. Células expresan de forma estable GL261.luc luciferasa que cataliza la oxidación de la luciferina sustrato convertir la energía química a los fotones de luz y por lo tanto detectable. Luciferina puede administrarse con seguridad a animales y cruza la barrera hematoencefálica después de la inyección intraperitoneal o intravenosa. En los pequeños animales de investigación tales como ratones, la bioluminiscencia se puede detectar externamente de una manera no invasiva 11. Por lo tanto, el crecimiento del tumor puede evaluarse en serie sin la necesidad de sacrificio de animales o costoso IRM o TC.
Los pasos críticos en el protocolo implican, no sólo la transducción lentiviral, sino también la verificación de la expresión estable de luciferasa in vitro antes de comenzar cualquier experimentos in vivo. Pérdida de transducción puede REQUIre infección lentivirus repetición. Introducción de un gen de resistencia a los antibióticos en el vector de expresión también se podría utilizar para seleccionar para la expresión de luciferasa. Se requiere una técnica meticulosa para la implantación intracraneal para colocar de manera reproducible un número constante de células en una localización anatómica precisa para permitir la comparación de los diferentes grupos de tratamiento. Una diferencia importante entre el presente estudio y en estudios previos de células que expresan luciferasa GL261 es el uso de una técnica de manos libres para la implantación de células en comparación con el uso de un marco estereotáctico 18. Hemos demostrado anteriormente los resultados de implantación consistentes con la técnica de manos libres 19. La ventaja de la técnica de mano libre es la capacidad de realizar análisis de alto rendimiento de diferentes agentes de tratamiento. En nuestras manos, podemos implantar unos 60 animales en la 1 h.
Después de dominar la técnica, las futuras aplicaciones de la técnica son ilimitadas. Como demonstr GL261ates elevados mitosis y rápido crecimiento del tumor similar al glioblastoma humano, tratamientos anti-proliferativos pueden ser evaluados. Del mismo modo, las terapias anti-invasivos y anti-angiogénicos pueden ser utilizados como los tumores GL261 son invasivos y angiogénico. Se debe tener precaución cuando se evalúa el efecto de los agentes quimioterapéuticos dirigidos a blancos humanos. En comparación con estudios previos utilizando xenoinjertos de glioblastoma humano que expresan luciferasa 20, esto sería considerado una limitación de nuestro modelo. Además, el efecto de las estrategias inmunoterapéuticas del crecimiento del tumor puede ser estudiada en el modelo xenoinjertado GL261.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechonology | LUCK-100 | Store away from light |
| Living Image Software | Caliper Life Sciences | Contact for Quote | none |
| Xenogen Lumina | Caliper Life Sciences | Contact for Quote | none |
| 24-well; Standard tissue culture; flat-bottom | Falcon | 353047 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | none |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | Contact for Quote | none |
| 96 well Assay Plate, Black Plate, Clear bottom with Lid, Tissue culture Tretaed | Coster | 3603 | none |
| Ketaset | Pfizer | NDC 0856-2013-01 | Control substance |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | 23076-35-9 | none |
| 28G Needle (with syringe) | Fisher | 22-004-270 | AKA Insulin Syringe |
| 2% Chlorhexidine | Fisher | NC9756995 | AKA “Nolvasan” |
| 3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H312P-4 | Store away from light |
| Ophthalmic Ointment | Cardinal Health | 1272830 | AKA “Akwa Tears” |
| 25G 1 1/2 needle | BD Becton Dickinson | 305127 | none |
| Disposable Scalpels | Feather | 2975 | No. 21 |
| Gauze | Fisher | 22028563 | Autoclave before use |
| Heating Pad | Dunlap | HP950 | none |
| Skin Stapler, Staples, Remover | Stoelting | 59020 | none |
| PDI Alchol Prep Pads | Fisher | 23-501-711 | none |
| Reflex 7 mm Wound Clips 100 pack | Brain Tree Scientific, INC | 203 1000 | Autoclave before use |
| Reflex 7 mm Wound Clip Applier | Brain Tree Scientific, INC | 204 1000 | Autoclave before use |
| Reflex 7 mm Wound Clip Remover | Brain Tree Scientific, INC | 205 1000 | none |
| Single Ended Round Tip Swab with Wood handle | Qosmedix | 10107 | Autoclave before use |
| Hanks' Balanced Salt Solution without Ca2+ and Mg2+ (HBSS) | Gibco | 14170-112 | none |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 80300 | none |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2961 | none |
| Bone Wax | Harvard Apparatus | 599864 | none |
References
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