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Medicine

ग्लयोब्लास्टोमा के लिए एक असुरक्षित पशु मॉडल की bioluminescence इमेजिंग

Published: January 15, 2016 doi: 10.3791/53287
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3
1Department of Neurological Surgery, University of California San Francisco, 2Department of Neurological Surgery, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 3Biochemistry and Molecular Genetics, Northwestern University Feinberg School of Medicine

Protocol

नीचे वर्णित सभी प्रक्रियाओं की समीक्षा की और नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु उपयोग और देखभाल समिति ने मंजूरी दे दी है और निष्फल शर्तों के तहत किया गया है, की गई है।

जुगनू luciferase व्यक्त रिपोर्टर के साथ GL261 कोशिकाओं के 1. संशोधन

नोट: एचआईवी-1-आधारित lentiviral वैक्टर तिल्ली फोकस के गठन वायरस (SFFV) प्रमोटर के नियंत्रण के तहत जुगनू luciferase (Fluc) व्यक्त करते हैं। ऑप्टिकल पत्रकार जीन वेक्टर प्लाज्मिड pHRSIN-CSGW-dlNotI में क्लोन किया गया है।

  1. 95 से युक्त एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% FBS और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक RPMI माध्यम में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और GL261 कोशिकाओं के साथ पूरक Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में 293-टी कोशिकाओं को बनाए रखें % हवा और 5% कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ 2)।
  2. 293-टी सेल संस्कृति एक टी -75 फ्लास्क में 80% confluency तक पहुँच जाता है, पीएच के साथ एक बार कोशिकाओं को धोनेosphate बफर खारा सीए 2 + और ​​Mg2 + बिना (पीबीएस), फ्लास्क थोड़ा तिरछी धारण करके एक 5 मिलीलीटर विंदुक के साथ 5 मिनट, Triturate के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्रिप्सिन (0.05%) के 3 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को सेते हैं और सभी कोशिकाओं को इकट्ठा कुप्पी के नीचे से। एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में trypsinized सेल निलंबन के 3 एमएल हस्तांतरण, और मांस RPMI मध्यम (सेल निलंबन के 10 मिलीलीटर की कुल) के 7 मिलीलीटर जोड़ें।
  3. एक 5 मिलीलीटर विंदुक के साथ अच्छी तरह से सेल निलंबन मिलाएं। ट्यूब से सेल निलंबन के 100 μl ले लो और hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की संख्या गिनती। ऐसा करने के लिए trypan नीले समाधान के 300 μl के साथ सेल निलंबन के 100 μl मिश्रण और एक hemocytometer में मिश्रण के 2 μl डालें। एक खुर्दबीन के नीचे चार अलग-अलग विचारों से नीले धुंधला बिना कोशिकाओं की संख्या की गणना। इस संख्या 10 4 कोशिकाओं / एमएल का प्रतिनिधित्व के रूप में, प्रत्येक दृश्य से सेल नंबर औसत।
  4. इस बीच, 30 पर सेल निलंबन युक्त ट्यूब अपकेंद्रित्र7 मिनट के लिए 0 XG। मीडिया Aspirate और 1.0 x 10 6 / एमएल के घनत्व में एक GL261 सेल निलंबन बनाने के लिए ताजा RPMI माध्यम से सेल छर्रों resuspend। 27.5 मिलीलीटर DMEM (1 दिन) के साथ एक टी-175 फ्लास्क में RPMI मीडिया के 2.5 मिलीलीटर के साथ बीज 2.5 x 10 6 GL261 कोशिकाओं।
  5. 24 घंटे के बाद, 20 मिलीलीटर ताजा DMEM (2 दिन) के साथ मध्यम जगह।
  6. , Lentiviral वेक्टर उत्पादन 5 मिनट के लिए 2 मिलीलीटर सीरम मुक्त DMEM के साथ 54 μl अभिकर्मक अभिकर्मक मिश्रण करने के लिए। अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ DMEM में Fluc (pSIN-Fluc) के 3 झूठ पोल के माइक्रोग्राम, vesicular stomatitis वायरस जी लिफाफा (VSV जी) के 3 ग्राम, और 4.5 माइक्रोग्राम जोड़ें, और आरटी पर 20 मिनट के लिए सेते हैं। 293-टी कुप्पी (टी 175) में पूरे डीएनए मिश्रण ड्रॉप और 48 घंटा (2 दिन) के लिए 95% हवा और 5% सीओ 2 से युक्त एक humidified कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  7. (3 दिन) (लगभग 30 मिलीग्राम होना चाहिए 293-टी सेल संस्कृति के माध्यम से की कुल मात्रा) अभिकर्मक के बाद 24 घंटा पर ताजा DMEM के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  8. एक में GL261 कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए24 अच्छी तरह से थाली, थोड़ा तिरछी कुप्पी धारण करके एक 5 मिलीलीटर विंदुक के साथ 5 मिनट, Triturate के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्रिप्सिन (0.05%) के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को सेते हैं, सीए 2 + और ​​Mg2 + बिना पीबीएस के साथ कोशिकाओं को एक बार धोने कुप्पी के नीचे से सभी कोशिकाओं को इकट्ठा, और 1.2 चरण में के रूप में hemocytometer के माध्यम से कोशिकाओं की गिनती। इस बीच, 7 मिनट के लिए 300 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र। मीडिया Aspirate और 2.5 x 10 4 / एमएल के घनत्व में एक GL261 सेल निलंबन बनाने के लिए ताजा RPMI माध्यम से सेल छर्रों resuspend। बीज 24 अच्छी तरह से थाली में RPMI मीडिया के 1 मिलीलीटर (3 दिन) के साथ 2.5 x 10 4 GL261 कोशिकाओं।
  9. 48 घंटा निम्नलिखित अभिकर्मक में 293-टी कुप्पी (टी 175) से 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ lentiviral तैरनेवाला की 30 मिलीलीटर लीजिए और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण। महाप्राण 30 मिलीलीटर lentiviral 0.22 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से एक 50 मिलीलीटर सिरिंज के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला, और 1 मिलीलीटर aliquots (4 दिन) में वायरल सतह पर तैरनेवाला विभाज्य।
  10. आर के 1 मिलीलीटर को बदलेंLentiviral सतह पर तैरनेवाला के 1 मिलीलीटर और साथ GL261 सेल प्लेट (24 अच्छी तरह से) में पीएमआई मध्यम एक humidified कक्ष (4 दिन) में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  11. Lentiviral संक्रमण के 48 घंटे के बाद, ताजा RPMI के 1 मिलीलीटर (6 दिन) के साथ मध्यम जगह।
  12. 24 घंटे के बाद, GL261 कोशिकाओं (7 दिन) की lentiviral संक्रमण दोहराएँ।
  13. Lentiviral संक्रमण के 2 एन डी 48 घंटे के बाद, ताजा RPMI के 1 मिलीलीटर (दिन 9) के साथ मध्यम जगह।
  14. (GL261.luc कोशिकाओं के रूप में करने के लिए भेजा जा सकता है) luciferase संशोधित GL261 कोशिकाओं के विकास और एक टी -75 फ्लास्क सेल संस्कृति का विस्तार करने के लिए आगे बढ़ें।
  15. GL261.luc सेल संस्कृति एक टी -75 फ्लास्क में 70% confluency तक पहुँच जाता है, trypsinization द्वारा कोशिकाओं फसल और 1.2 चरण में के रूप में hemocytometer द्वारा गिनती। स्नातक होने के घनत्व में 24 अच्छी तरह से थाली में GL261.luc सेल प्लेट (1.0 x 10 6 5.0 x 10 5, 2.5 x 10 5, 1.0 x 10 5, 5.0 10 x 4, 2.5 x 10 4 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) और एक humidi में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते3 घंटे के लिए 95% हवा और 5% सीओ 2 से युक्त fied चैम्बर।
  16. सेलुलर luciferase गतिविधि रिश्तेदार को मापने bioluminescence इमेजिंग (चित्रा 1) का उपयोग कर यू-87 एमजी (U87.luc) कोशिकाओं संशोधित luciferase करने के लिए।
    1. छवि सॉफ्टवेयर शुरू (डेस्कटॉप पर आइकन पर क्लिक करें) और इमेजिंग प्रणाली को प्रारंभ (क्लिक बटन "प्रारंभ")। आरंभीकरण स्वचालित रूप से शुरू हो जाएगा और सिस्टम चेक-अप और -90 डिग्री सेल्सियस तक नीचे शांत करने के लिए कैमरे के लिए कई मिनट लग सकते हैं।
    2. प्रत्येक कुएं में luciferin के 25 μl (डी luciferin पोटेशियम नमक, 150 मिलीग्राम / किग्रा) जोड़ें।
    3. 10 सेकंड के लिए थाली आरटी पर 1 मिनट के लिए luciferin और छवि के साथ कोशिकाओं को सेते हैं। इमेजिंग प्रणाली स्थापित करने के लिए, "Luminescent", "10 सेकंड" जोखिम समय है, और "मध्यम" binning का चयन करें। इमेजिंग स्टेशन पर 24 अच्छी तरह से थाली प्लेस और छवि शुरू करने के लिए "अधिग्रहण" बटन पर क्लिक करें।
    4. छवि सफलतापूर्वक हासिल कर लिया है, के बाद आप एक छवि खिड़की और उपकरण देहात देखेंगेस्क्रीन पर lette। "रॉय (हित के क्षेत्रों) उपकरण" क्लिक करें और भट्ठा चिह्न से 6 एक्स 4 का चयन करें। 24 अच्छी तरह से थाली की छवि पर संकेत के क्षेत्र को कवर किया और माप टैब (पेंसिल आइकन) पर क्लिक करने के लिए 6 एक्स 4 slits बनाएँ। वर्ग सेमी (फोटॉनों / सेक / / एसआर 2 सेमी) प्रति steradian प्रति प्रति सेकंड फोटॉनों की इकाई के रूप में रॉय के माप का एक मेज के साथ एक खिड़की का निरीक्षण करें।
    5. उपयोग U87.luc कोशिकाओं, पहले से transduced GL261.luc कोशिकाओं में luciferase गतिविधि का आकलन करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में, GL261 संशोधन 11 के लिए यहां इस्तेमाल किया ही lentivirus के साथ संशोधित।

इन विट्रो प्रसार परख 2.

  1. GL261 और GL261.luc सेल संस्कृतियों एक टी -75 फ्लास्क में 70% confluency तक पहुँचते हैं, trypsinization द्वारा सेल लाइनों दोनों फसल और 1.2 चरण में के रूप में गिनती, और 1500 कोशिकाओं के घनत्व में कम से एक 96 अच्छी तरह से थाली में थाली कोशिकाओं अच्छी तरह से समय और pipetting त्रुटि को कम करने के लिए एक multichannel पिपेट का उपयोग प्रति RPMI माध्यम से 80 μl। एसईएड 20 कुओं की कुल में प्रत्येक कोशिका लाइन। कोशिकाओं की आबादी कुओं में वाष्पीकरण सीमित करने के लिए, ताजा RPMI माध्यम के 100 μl के साथ खाली कुओं भरें।
  2. एक वर्णमिति सेल प्रसार परख का उपयोग सेलुलर प्रसार का आकलन करें। यहाँ हम एमटीएस सेल प्रसार परख का उपयोग करें। एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग करना, सेल शामिल हैं कि 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में एमटीएस अभिकर्मक के 20 μl जोड़ें।
  3. 3 घंटे के लिए 95% हवा और 5% सीओ 2 से युक्त एक humidified कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं। एक microplate रीडर का उपयोग कर 490 एनएम पर absorbance के उपाय। यह चढ़ाना के बाद, 7 दिन 1, 2, 4 में दोहराया है, और है। Absorbance के मूल्यों को सामान्य करने के लिए, प्रत्येक दिन के मूल्यों दिन 1 (चित्रा 2) पर प्राप्त इसी रीडिंग के आधार पर विभाजित कर रहे हैं।

3. ट्यूमर कोशिका आरोपण

नोट: सभी उपकरणों आटोक्लेव। एक कीटाणुनाशक (2% chlorhexidine समाधान) छिड़काव द्वारा शल्य चिकित्सा क्षेत्र को तैयार है और absorben के साथ कवरटी पर्दे। बाँझ की स्थिति बनाए रखने के लिए सर्जरी के दौरान बाँझ सर्जिकल दस्ताने पहनते हैं, और रंग टेप से दो क्षेत्रों में शल्य चिकित्सा के क्षेत्र को विभाजित करने के लिए आदेश में। क्षेत्र एक "स्वच्छ" लेबल और निष्फल आपूर्ति शामिल है; क्षेत्र 2 "गंदा" लेबल है और सामग्री का इस्तेमाल होता है।

  1. पशु शल्य चिकित्सा के लिए पहले, intracranial इंजेक्शन के लिए एक सेल निलंबन तैयार करते हैं। एक 70% मिला हुआ टी -75 फ्लास्क trypsinization द्वारा और 1.2 चरण में के रूप में hemocytometer के माध्यम से कोशिकाओं की गिनती, और 2 + सीए बिना हैंक्स बैलेंस्ड नमक के घोल में 1.0 x 10 5 कोशिकाओं / μl के घनत्व पर एक सेल निलंबन बनाने के लिए और से हार्वेस्ट कोशिकाओं 2 मिलीग्राम + (HbSS)।
  2. 0.9% खारा में xylazine के ketamine के 100 मिलीग्राम / किग्रा और 10 मिलीग्राम / किग्रा युक्त 200 μl मिश्रण की intraperitoneal इंजेक्शन के साथ चूहों anesthetize। उचित anesthetization पुष्टि करने के लिए, माउस के पैर के अंगूठे चुटकी। माउस पूरी तरह से संज्ञाहरण के तहत है, तो माउस उत्तेजना का जवाब नहीं देना चाहिए।
  3. 0.1 मीटर से प्रशासनचमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से ग्राम / किलो buprenorphine पोस्ट ऑपरेटिव दर्द को दूर करने के लिए।
  4. 2% chlorhexidine समाधान में डूबा हुआ एक कपास टिप applicator के साथ कतरनी और स्वच्छ का उपयोग जानवरों के सिर के ऊपर दाढ़ी। सर्जरी के दौरान पर्याप्त स्नेहन बनाए रखने के लिए आंख मरहम लागू करें।
  5. एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग parieto पश्चकपाल हड्डी पर लगभग 1 सेमी लंबे समय से एक बाण चीरा। पर्वबिन्दु कल्पना करने के लिए, एक 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान में भिगो एक कपास टिप applicator के साथ खोपड़ी की सतह पोंछे।
  6. शीर्षस्थान के अधिकार के लिए और बस के राज्याभिषेक सिवनी के पीछे एक छोटा सा छेद 3 मिमी बनाने के लिए एक बाँझ 25-जी सुई के साथ खोपड़ी ड्रिल।
  7. इंट्राक्रेनियल इंजेक्शन साइट खोपड़ी से 3 मिमी की गहराई तक है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, कैंची का उपयोग कर एक 20 μl विंदुक टिप के अंत बताया बंद 3 मिमी में कटौती और विंदुक टिप में एक सिरिंज डालें।
  8. पहले बनाया छेद के लंबवत सिरिंज डालें, और धीरे-धीरे ट्यूमर सेल SUS इंजेक्षनएक 1 मिनट की अवधि में 3 μl HBSS में 3.0 x 10 5 कोशिकाओं से युक्त पेंशन। एक मिनट के लिए जगह में सुई छोड़ दें, और फिर धीरे धीरे सुई बाहर खींच।
  9. 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड में डूबा हुआ कपास की नोक applicator और 2% chlorhexidine समाधान के साथ खोपड़ी झाड़ू। कपास की नोक applicator के साथ खोपड़ी की सतह सूखी। आकार में 3 लगभग 3 मिमी बाँझ हड्डी मोम बाहर कट और कपास टिप applicator के अंत पक्ष पर हड्डी मोम देते हैं। कपास की नोक applicator के साथ छेद को कवर करने के लिए हड्डी मोम लागू करें।
  10. संदंश का उपयोग खोपड़ी पर एक साथ खोपड़ी के प्रत्येक पक्ष ड्रा, और प्रधान घाव को बंद करने के लिए। 2% chlorhexidine समाधान में डूबा हुआ एक कपास की नोक के साथ घाव को साफ करें।
  11. वे चलनक्षम बनने तक के बाद operatively सभी चूहों पर नजर रखने और सामान्य गतिविधि बरकरार रहती है। आमतौर पर, वसूली समय लगभग 30 मिनट है। वे पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद किया है जब तक अन्य जानवरों के साथ पिंजरे में चूहों वापस नहीं है।

  1. एक साफ कागज तौलिया पर कीटाणुनाशक के एक उदार राशि (0.05% डाइमिथाइल अमोनियम क्लोराइड समाधान) का छिड़काव करें। अच्छी तरह से जानवरों डिवाइस के साथ संपर्क में हो जाएगा, जहां इमेजिंग कक्ष के अंदर काली चादर, नाक शंकु और विभक्त पोंछने के लिए कीटाणुनाशक लथपथ कागज तौलिया का उपयोग करें। अच्छी तरह से एक साफ, सूखे कागज तौलिया के साथ सभी सतहों पोंछे। इस बार फिर दोहराना और 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  2. कदम 1.14.1 में के रूप में इमेजिंग स्टेशन को प्रारंभ।
  3. Intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा अक्स / xylazine के 200 μl और luciferin के 100 μl (डी luciferin पोटेशियम नमक, 150 मिलीग्राम / किग्रा) युक्त 300 μl मिश्रण के साथ माउस anesthetize।
  4. इंजेक्शन के बाद 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें और चूहों की पूंछ pinching द्वारा संज्ञाहरण के तहत पूरी तरह से कर रहे हैं, तो इस बात की पुष्टि। इमेजिंग प्रणाली स्थापित करने के लिए, "Luminescent", "ऑटो" जोखिम समय है, और "मध्यम" binning का चयन करें। इमेजिंग संयुक्त पर चूहों की जगहऔर पर छवि शुरू करने के लिए "अधिग्रहण" बटन पर क्लिक करें। इंजेक्शन के बाद समय प्रत्येक इमेजिंग सत्र के साथ संगत है कि सुनिश्चित करें।
  5. छवि सफलतापूर्वक हासिल कर लिया है, के बाद एक छवि खिड़की और उपकरण पट्टी दिखाई देनी चाहिए। "आरओआई उपकरण" क्लिक करें और चक्र चिह्न से "ऑटो" चयन करें। ROIs को परिभाषित करने के लिए, छवि पर संकेत के क्षेत्र में घिरा हुआ है, और फिर एसआर फोटॉनों / सेक / / 2 सेमी की इकाई के रूप में रॉय के माप ले।
  6. इमेजिंग कक्ष से बाहर चूहों ले लो और वे चलनक्षम हो जब तक चूहों पर नजर रखने और सामान्य गतिविधि बरकरार रहती है। आमतौर पर वसूली समय लगभग 15 मिनट है। वे पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद किया है जब तक अन्य जानवरों के साथ पिंजरे में चूहों वापस नहीं है।
  7. जानवरों निम्नलिखित लक्षण मौजूद जब तक सप्ताह में दो बार bioluminescence इमेजिंग द्वारा ट्यूमर के विकास की निगरानी करें: वजन घटाने (दाखिल करने से पहले वजन के 20% से अधिक रिश्तेदार की हानि), inappetance (24 घंटे के लिए पूरा आहार), और निरंतर purposefu की कमीवे euthanized किया जाना चाहिए, जो समय पर कोमल उत्तेजनाओं (को पाने के लिए कमजोर प्रयास), एल प्रतिक्रिया। ग्रीवा अव्यवस्था के बाद एक सीओ 2 कक्ष का उपयोग कर इन लक्षणों के साथ जानवरों euthanize।
    1. प्लेस इच्छामृत्यु के चेंबर में चूहों (भीड़ नहीं चैम्बर करते हैं) और प्रवाह को 5-6 मिनट के लिए सीओ 2 संकुचित। सभी जानवरों को बेहोशी और बाद में लगभग 5 मिनट साँस लेने में नहीं हैं कि ध्यान से देखें।
    2. चैम्बर के बाहर चूहों ले लो। दिल अपने अंगूठे और तर्जनी के बीच सीने में महसूस कर रही द्वारा पिटाई नहीं है कि यह सुनिश्चित नहीं है और कोई झपकी पलटा है कि वहाँ की जाँच करें।
    3. एक सपाट सतह पर एक प्रवण स्थिति में माउस को नियंत्रित करना और अपने अंगूठे और दूसरे हाथ की पहली उंगली के साथ पूंछ के एक हाथ से खोपड़ी के आधार पर गर्दन के पीछे और आधार समझ।
    4. सिर को नियंत्रित करना और जल्दी से पिछड़े पूंछ खींच। खोपड़ी है कि अपने अंगूठे और पहली उंगली का उपयोग कर पहली ग्रीवा बांस से अलग कर दिया जाता है सुनिश्चित करें।
  8. आदर्श2.3 कदम (चित्रा 3) के रूप में bioluminescence इमेजिंग के पहले दिन प्राप्त इसी रीडिंग के खिलाफ एक दिन के लिए Alize luminescence मूल्यों।
  9. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, कापलान-मायर आकलनकर्ता 12 का उपयोग कर अस्तित्व घटता पैदा करते हैं और एक लॉग-पद की परीक्षा 13 का उपयोग कर अस्तित्व घटता के बीच मतभेद की तुलना करें।

Representative Results

GL261 कोशिकाओं 1. इन विट्रो bioluminescence इमेजिंग मानव ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन U87.luc सकारात्मक नियंत्रण में स्तरों के समान मजबूत luciferase अभिव्यक्ति (चित्रा 1) दर्शाता चरणों में ऊपर वर्णित के रूप luciferase lentivirus युक्त से संक्रमित थे। जैसी कि उम्मीद थी, असंक्रमित GL261 कोशिकाओं कोई पृष्ठभूमि luciferase अभिव्यक्ति प्रदर्शित करता है। यह कदम अभी तक पूर्व के स्थिर luciferase अभिव्यक्ति पुष्टि करने के लिए संक्रमित कोशिका लाइन का उपयोग कर आगे की पढ़ाई करने के लिए प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण सरल है।

Intracranial आरोपण के बाद luciferase अभिव्यक्ति।

Intracranial आरोपण से पहले, हम GL261 कोशिकाओं (चित्रा 2) की तुलना में GL261.luc के इन विट्रो विकास दर में कोई अंतर का प्रदर्शन किया। इंट्राक्रेनियल विकास और अस्तित्व के विश्लेषण के लिए, कोशिकाओं बीआर में इंजेक्ट किया गयाGL261.luc ट्यूमर असर चूहों में कदम 3. ट्यूमर के विकास को प्रोटोकॉल के अनुसार C57BL / 6 चूहों की ains क्रमानुसार प्रोटोकॉल कदम 4 का उपयोग bioluminescence इमेजिंग के लिए विश्लेषण किया और पता लगाने योग्य ट्यूमर के विकास (चित्रा 3) का प्रदर्शन किया गया था। तेजी से और लगातार GL261.luc ट्यूमर असर चूहों मरणासन्न हो गया और euthanized थे। महत्वपूर्ण बात है, GL261.luc और जानवरों असर GL261 ट्यूमर (चित्रा 3 बी) के बीच समग्र अस्तित्व में कोई अंतर नहीं है। Vivo में bioluminescence इमेजिंग इसलिए प्रयोगात्मक ग्लियोब्लास्टोमा उपचार के लिए प्रतिक्रिया पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। रैपिड विश्वसनीय ट्यूमर के विकास और लघु समग्र अस्तित्व के समय की एक अपेक्षाकृत छोटी राशि में डेटा की बड़ी मात्रा में उपज कर सकते हैं।

आकृति 1
GL261.luc कोशिकाओं में चित्रा 1. luciferase गतिविधि। U87.luc, GL261.luc और GL261 (नकारात्मक नियंत्रण) कोशिकाओं के घनत्व पर चढ़ाया गयाएक्स 10 6 1.0, 5.0 x 10 5, 2.5 x 10 5, 1.0 x 10 5, 5.0 10 x 4, और 2.5 x 10 4 कोशिकाओं / अच्छी तरह से सही करने के लिए छोड़ दिया है। Luminescence (फोटोन / सेक / / एसआर 2 सेमी) Lumina इमेजिंग स्टेशन द्वारा मापा गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. luciferase अभिव्यक्ति GL261 सेल प्रसार को प्रभावित नहीं करता। GL261.luc कोशिकाओं को एक कारण नहीं है प्रसार में अंतर एमटीएस सेल प्रसार परख द्वारा प्रदर्शन के रूप में। औसत absorbance के मूल्य की तुलना द्वारा निर्धारित रूप ग्राफ दिन 1 के सापेक्ष गुना वृद्धि हुई है, पता चलता है, (1 दिन में औसत मूल्य के लिए thespecified समय बिंदु पर तुलना के लिए unpaired टी -Test मूल्यों (± SEM मतलब है)प्रत्येक कोशिका लाइन के बीच: पी = 0.7796) 14। त्रुटि सलाखों औसत मूल्यों प्रत्येक दिन चार प्रतियों के नमूनों से (± SEM मतलब है) का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. luciferase अभिव्यक्ति में विवो ट्यूमर के विकास और पशु अस्तित्व पर कोई असर नहीं खुराक। (ए) Bioluminescence निगरानी C57BL / 6 चूहों में इंट्राक्रेनियल GL261.luc ट्यूमर के प्रगतिशील विकास को दर्शाता है। (बी) कापलान Meier अस्तित्व विश्लेषण या तो GL261 (ठोस लाइन) या GL261.luc कोशिकाओं के साथ intracranially प्रत्यारोपित चूहों के लिए समग्र अस्तित्व में कोई अंतर को दर्शाता है (धराशायी रेखा)।यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

Syngeneic असुरक्षित C57BL / 6 चूहों में प्रत्यारोपित intracranially जब GL261 murine तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं, मानव तंत्रिकाबंधार्बुद जेनोग्राफ्ट पशु मॉडलों की तुलना में कई लाभ प्रदान करते हैं। Xenografted ट्यूमर से कई सटीक रूप से आक्रामक मानव रोग पुनरावृत्ति नहीं है कि समझाया घावों के रूप में विकसित। इसके विपरीत, GL261 ट्यूमर न केवल आसन्न मस्तिष्क में आक्रमण को दर्शाता है, लेकिन यह भी neovascularization, mitotic आंकड़े, और गहरा नेक्रोसिस 7। सबसे महत्वपूर्ण बात यह ट्यूमर इम्यूनोलॉजी या immunotherapeutic रणनीतियों 15, 16, C57BL 6 / माउस एक अक्षुण्ण प्रतिरक्षा प्रणाली को 8 को बरकरार रखे हुए अध्ययन करते। पिछले अध्ययनों प्रतिरक्षादमनकारी साइटोकाइन TGF-β के मजबूत अभिव्यक्ति से पता चला है और intracranial ट्यूमर मानव ग्लियोब्लास्टोमा 9, 10 के लिए इसी तरह प्रतिरक्षादमनकारी टी नियामक सेल होते हैं।

यहाँ वर्णित सरल तकनीक GL261 कोशिकाओं द्वारा luciferase की स्थिर अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है। हमने हाल ही में सिमी की सूचना दी हैइन विट्रो में और GL261 कोशिकाओं की तुलना में GL261.luc कोशिकाओं के vivo विकास में लोकप्रिय है, इसी तरह के ट्यूमर histologic विशेषताओं और प्रतिरक्षा सेल के अलावा 17 घुसपैठ। GL261.luc कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक फोटॉनों और इसलिए पता लगाने योग्य प्रकाश में रासायनिक ऊर्जा में परिवर्तित सब्सट्रेट luciferin के ऑक्सीकरण उत्प्रेरित जो luciferase व्यक्त करते हैं। Luciferin सुरक्षित रूप से जानवरों को दिलाई और intraperitoneal या नसों में इंजेक्शन के बाद रक्त मस्तिष्क बाधा पार किया जा सकता है। चूहों जैसे छोटे अनुसंधान पशुओं में, bioluminescence एक गैर आक्रामक तरीके से 11 में बाहर से पता लगाया जा सकता है। इसलिए, ट्यूमर के विकास को क्रमानुसार पशु बलि या महंगा एमआरआई या सीटी इमेजिंग के लिए आवश्यकता के बिना मूल्यांकन किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम किसी भी इन विवो प्रयोगों की शुरुआत से पहले इन विट्रो में, lentiviral पारगमन, लेकिन यह भी luciferase की स्थिर अभिव्यक्ति का सत्यापन न केवल शामिल है। पारगमन की हानि requi सकता हैदोहराने lentivirus के संक्रमण फिर से। अभिव्यक्ति वेक्टर में एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन का परिचय भी luciferase अभिव्यक्ति के लिए चयन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सावधानीपूर्वक तकनीक reproducibly अलग उपचार समूहों की तुलना की अनुमति के लिए एक सटीक शारीरिक स्थान में कोशिकाओं के अनुरूप एक नंबर करने के लिए जगह intracranial आरोपण के लिए आवश्यक है। वर्तमान अध्ययन और luciferase व्यक्त GL261 कोशिकाओं के पिछले अध्ययनों के बीच एक बड़ा अंतर यह है कि एक स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम 18 के उपयोग की तुलना में कोशिकाओं को दाखिल करने के लिए एक मुक्त हाथ तकनीक का इस्तेमाल होता है। हम पहले से मुक्त हाथ तकनीक 19 के साथ संगत कर आरोपण परिणामों का प्रदर्शन किया है। मुक्त हाथ तकनीक का लाभ विभिन्न उपचार एजेंटों के उच्च throughput विश्लेषण प्रदर्शन करने की क्षमता है। हमारे हाथ में है, हम एक घंटे में लगभग 60 जानवरों प्रत्यारोपण कर सकते हैं।

तकनीक माहिर के बाद, तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोगों असीम हैं। GL261 demonstr के रूप मेंAtes ऊंचा mitoses और मानव ग्लियोब्लास्टोमा के लिए इसी तरह तेजी से ट्यूमर के विकास, विरोधी proliferative उपचार का मूल्यांकन किया जा सकता है। GL261 ट्यूमर आक्रामक और वाहिकाजनक के रूप में इसी तरह, विरोधी आक्रामक और विरोधी वाहिकाजनक उपचारों का इस्तेमाल किया जा सकता है। मानव लक्ष्य के उद्देश्य से एजेंटों के प्रभाव का आकलन करते समय सावधानी से किया जाना चाहिए। Luciferase 20 व्यक्त मानव ग्लियोब्लास्टोमा xenografts उपयोग पिछले अध्ययनों की तुलना में, यह हमारे मॉडल की एक सीमा पर विचार किया जाएगा। इसके अलावा, ट्यूमर के विकास की immunotherapeutic रणनीतियों के प्रभाव GL261 xenografted मॉडल में अध्ययन किया जा सकता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
D-Luciferin, Potassium Salt Gold Biotechonology LUCK-100 Store away from light
Living Image Software Caliper Life Sciences Contact for Quote none
Xenogen Lumina Caliper Life Sciences Contact for Quote none
24-well; Standard tissue culture; flat-bottom Falcon 353047
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay  Promega G3582 none
Synergy 2 Multi-Mode Reader BioTek Contact for Quote none
96 well Assay Plate, Black Plate, Clear bottom with Lid, Tissue culture Tretaed Coster 3603 none
Ketaset Pfizer NDC 0856-2013-01 Control substance
Xylazine Sigma-Aldrich 23076-35-9 none
28G Needle (with syringe)  Fisher   22-004-270 AKA Insulin Syringe
2% Chlorhexidine Fisher NC9756995 AKA “Nolvasan”
3% Hydrogen Peroxide Fisher H312P-4 Store away from light
Ophthalmic Ointment Cardinal Health 1272830 AKA “Akwa Tears”
25G 1 1/2 needle BD Becton Dickinson 305127 none
Disposable Scalpels Feather 2975 No. 21
Gauze Fisher 22028563 Autoclave before use
Heating Pad Dunlap HP950 none
Skin Stapler, Staples, Remover Stoelting 59020 none
PDI Alchol Prep Pads Fisher 23-501-711 none
Reflex 7 mm Wound Clips 100 pack Brain Tree Scientific, INC 203 1000 Autoclave before use
Reflex 7 mm Wound Clip Applier Brain Tree Scientific, INC 204 1000 Autoclave before use
Reflex 7 mm Wound Clip Remover Brain Tree Scientific, INC 205 1000 none
Single Ended Round Tip Swab with Wood handle Qosmedix 10107 Autoclave before use
Hanks' Balanced Salt Solution without Ca2+ and Mg2+ (HBSS) Gibco 14170-112 none
Hamilton Syringe Hamilton 80300 none
FuGENE 6 Transfection Reagent Promega E2961 none
Bone Wax Harvard Apparatus 599864 none

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References

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चिकित्सा अंक 107 असुरक्षित पशु माउस ग्लियोब्लास्टोमा इंट्राक्रेनियल जेनोग्राफ्ट, GL261
ग्लयोब्लास्टोमा के लिए एक असुरक्षित पशु मॉडल की bioluminescence इमेजिंग
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Clark, A. J., Fakurnejad, S., Ma,… More

Clark, A. J., Fakurnejad, S., Ma, Q., Hashizume, R. Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma. J. Vis. Exp. (107), e53287, doi:10.3791/53287 (2016).

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