Abstract
Адаптивного иммунитета регулируется динамического взаимодействия между Т-клетками и антиген-представляющих клеток ("БТР") называют «иммунологических синапсов». В этих интимных межклеточных интерфейсов дискретные суб-кластеры сотовой МНС / Ag-TCR, F-актина, адгезия и сигнальные молекулы образуют и быстро переделывать. Такая динамика, как считается, критические детерминанты как эффективность и качество иммунных ответов, которые развиваются, и поэтому защитных против патологического иммунитета. Современное понимание иммунологических синапсов с физиологической БТР ограничивается неадекватности получаемой разрешением изображения. Хотя искусственные модели подложки (например, плоские липидных бислоев) предлагают превосходное разрешение и чрезвычайно ценный инструмент, они по своей природе не физиологическая, а упрощенное. Сосудистые и лимфатические эндотелиальные клетки превратились в важную периферических тканей (или стромальных) отсеке "полу-профессииаль БТР. Эти бронетранспортеры (которые выражают большую часть молекулярных машин профессионального БТР) имеют уникальную особенность формирования практически плоскую поверхность клеток и легко transfectable (например, с флуоресцентным белком журналистами). В этом основной подход к осуществлению эндотелиальные клетки в качестве нового и физиологический "плоской модели сотовых APC 'для улучшения изображений и опроса основных антигенных обрабатывает сигнализацию будут описаны.
Introduction
Т-лимфоциты являются филиал адаптивной иммунной системы характеризуется способностью эффективно распознавать пептид антигена (АГ), связанного с главным комплексом гистосовместимости (МНС) молекул через их Т-клеточных рецепторов (TCR) 1. Наивные лимфоциты мигрируют конструктивно и сканирования »профессиональные Ag представляющих клеток (АПК»; например, дендритные клетки) в лимфатических узлах, в то время как память / эффекторные Т-клетки должны эффективно обследовать чрезвычайно широкий спектр БТР и потенциальных целевых клеток в периферических тканях.
В следующем мин первоначального признания родственных Ag на БТР, лимфоциты арестовать их миграции и начинают формировать специализированные интимную интерфейс клетка-клетка называется "иммунологическое синапсов» (IS). Устойчивый (т.е. 30-60 мин) контакты должны усиливать и поддерживать сигнализации 2-7. Новые исследования определить, что в есть, это непрерывное образование и быстрое гemodeling дискретных субклеточном сигнализации микро-кластеров (т.е., содержащих МНС / Ag-TCR, F-актин, адгезию и сигнальные молекулы), которые определяют силу и качество в результате иммунных ответов 2-7. Тем не менее, динамические данные и механизм регулирования этого процесса полностью понял 8,9. Это связано в основном с техническими проблемами, связанными с неправильной топологии поверхностей APC и плохо контролируемой ориентации плоскостей взаимодействия клетка-клетка, вопросов, которые глубоко ограничивают необходимую пространственно-временной обработки изображений подходов 8-10 (Figure1A).
Рисунок 1. Физиологическая Planar сотовый APC Модель изображений иммунологии Synapse Dynamics. Схема иллюстрирует традиционный изображений иммунологической синапса между Т-клетки и профес NAL APC (А) и Т-клеток и традиционный плоский липидов модель бислой APC (В) по сравнению с этой новой модели эндотелиальной плоской APC (C). Профессиональные БТР обеспечить физиологические иммунологические синапсы, но предлагают мало ориентированный интерфейс клетка-клетка (т.е., по отношению к оптимальной плоскости изображения ху, разрешение ~ 0,2 мкм), что резко компрометирует пространственное (г визуализации самолет разрешения ~ 1 мкм) и временная (т.е. в связи с необходимостью многократно сканировать всех плоскостях изображений г) разрешение изображения. Двухслойные модели имеют плоскую топологию, что обеспечивает оптимальную пространственно-временной изображения разрешением, но также сильно упрощенной, не физиологические и жесткой. Это эндотелия модель сотового сочетает в себе плоскую топологию липидного бислоя с физиологической подложки классического APC, чтобы доставить оптимального пространственное и временное разрешение изображений в физиологическом обстановке.м / файлы / ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Предыдущие исследования частично обойдена эти препятствия путем разработки моделей плоскую подложку (т.е. липидных бислоев и поверхностей покрытых антителами), которые обеспечивают оптимальную пространственно-временной разрешение (т.е. с помощью фиксации поверхность активации Т-клеток в единый план, параллельной оптимальной визуализации ху Плоскость) 11-15 (Фигура 1В). Эти модели способствовали важные идеи в субклеточных / молекулярной динамики, которые контролируют антигенный сигнализации в Т-клетках, в том числе открытие динамического актина / TCR сигнализации микро-кластеров 7,11-14. Тем не менее, такие модели изначально упрощать, а также жесткой (исключающее развитие / изучение 3-мерных топологических особенностей) (рис 1B). Таким образом, остается неясным, как связать такие выводы PHYsiologic клетка-клетка иммунный надзор.
Хотя до сих пор изучено недостаточно, сосудистой и лимфатические эндотелиальные клетки возникают, как большой (т.е. больше, чем в цифрах всех профессиональных БТР, на ~ 1000 раз) периферической отсеке "полу-профессиональной" БТР 16-18. Эти клетки экспрессируют MHC-I-, MHC-II- и множество молекул со-стимуляторов (например, CD40, LFA3, ICOSL, 4-1ВВ, OX40L, TL1A, PD-L1, но не CD80 и CD86) и стратегически расположенный на границе кровь-ткань, где они служат специализированные функции дозорных 16-18. Предыдущие исследования показали, что эндотелиальные клетки могут эффективно повторно стимулировать эффекторной / память, но не наивным, Т-клетки 19-25. Таким образом, эндотелиальные клетки, вероятно, играют уникальную роль в эффекторной APC фазе адаптивных иммунных реакций в пределах периферических тканях, таких как локального воздействия на активацию Т-клеток, дифференцировки, памяти и толерантности 16,17,26. Крически, при выращивании в пробирке, эндотелиальные клетки образуют практически плоские поверхности клеток и легко transfectable (например, с флуоресцентным белком журналистами). Эти особенности идеально подходят для высокой пространственно-временной разрешающей способностью топологических динамики при межклеточных взаимодействий 19,27. Таким образом, эндотелиальные клетки может служить физиологический "плоской сотовой APC» модели отчетливо подходит для изучения субклеточных / молекулярные механизмы ремоделирования, которые управляют распознавания антигенов и регулируют ответов (рис 1в) 19,20.
Ранее установлено, комплементарные методы визуализации (в том числе трансфекции эндотелии клеток с флуоресцентными производителей белка мембраны плазмы и цитозоле) для изучения деталей лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия при адгезии и трансэндотелиальной миграции 27, показали, что лейкоциты активно зондировать поверхность эндотелии динамического вставкад втягивание субмикронных масштабах, актин-богатых цилиндрические выступы (~ 200-1000 нм в диаметре и глубиной) называется invadosome, как выступы (то есть, "ILPs ') 27,28. Эти подходы изображений были расширены наряду с созданием протоколов, чтобы воспользоваться функцией эндотелия APC развивать первые методы пространственно-временной высокой разрешающей способностью в Т-клеток-эндотелиальной иммунологической синапса Как сообщалось 19,20 и далее описанных здесь. Центральный вывод, производный от этого романа плоской модели APC сотовой том, что Т-клеточные ILPs функционировать как в поощрении начального обнаружения Ag и в поддержании последующее сигнализации. В самом деле, массивы нескольких ILPs (которые были стабилизированы и начисленных в ответ на начальный поток кальция) Показать обогащение TCR и молекул наводящий активного сигнального такой ПКС-Q, ZAP-70, фосфотирозина и HS1. Таким образом, ILPs-видимому, представляют собой трехмерную физиологическую эквивалентную ТКР сигнализации микрокластеры видели в плоских моделей двухслойных. Этот подход, таким образом, чутко показывает / отчеты молекулярные и архитектурные (и подразумеваемые биомеханические) динамика не иначе обнаруживается.
Метод, описанный в данном документе должны быть полезными для преодоления разрыва между профессиональной APC и искусственных моделей APC субстрата для того, чтобы укрепить нашу способность допросить основные механизмы адаптивного иммунного ответа. В то время как здесь акцент делается на активацию CD4 + Th1-типа эффектора / ячейки памяти, это основной подход можно легко модифицировать для изучения широкий спектр типов Т-клеток и AGS, как описано ниже.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты, описанные в этом протоколе проводятся с первичных человеческих Т-клеток и коммерчески доступных первичных человеческих эндотелиальных клеток (кожная или легких микрососудистой ECS) Любой протокол исследования с участием человека должны быть одобрена этическим комитетом и письменное информированное согласие должно быть дано от каждый донор крови. Эксперименты, проведенные с помощью этого протокола были утверждены IRB из медицинского центра Beth Israel дьяконица.
1. Подготовка человека CD4 + Th1 Эффектор / Т-клетки памяти
- Применить жгут на руку донора, протрите вену с алкоголем, и вставьте иглу. Медленно привлечь 15 мл крови в вакуумные с использованием ЭДТА в качестве антикоагулянта. Когда кровь была составлена, развязать жгут перед удалением иглы. Сразу оказать давление на раны стерильной марлей, когда игла удаляется.
- Передача кровь на 50 мл пробирку. Добавить RPMI-1640 при комнатной температуре в 1: 1 разбавления (конечный объем 30 мл). Тщательно наложить разбавленнойд крови на двух 50 мл пробирок, содержащих 15 мл предварительно отфильтрованного лимфоцитов изоляции средой, такой как Ficoll-Пак при комнатной температуре.
- Центрифуга градиент при КТ в течение 30 мин при 1200 х г в роторе Бакет. В то время как центрифугирование подготовки Т-клеток среду (500 мл RPMI-1640, 50 мл FCS, 5 мл пенициллина / стрептомицина).
- При удалении 50 мл пробирку из центрифуги, наблюдать четыре слоя: гранулы эритроцитов в нижней части, в Пак, слой клеток, который содержит лейкоциты (в том числе лимфоцитов) и плазму. Осторожно удалите белый слой клеток крови с пипетки Пастера и передачи в 50 мл Сокол трубки.
- Промыть белый слой клеток крови путем добавления RT RPMI-1460 (до 20 мл) и центрифугировали при комнатной температуре в течение 5 мин при 1200 х г в. Ресуспендируют белых кровяных клеток в 1 мл среды Т-клеток. Добавьте 5 мкл 1 мл клеточной суспензии в 250 мкл среды Т-клеток в 1,5 мл центрифужную пробирку и осторожно перемешать вверх и вниз с помощью пипетки.
- Добавить 25 мкл разбавленныхд клеточной суспензии до 25 мкл 0,4% трипанового синего. Добавить 10 мкл смеси в каждую сторону от стандартного гемоцитометра.
- Поместите гемоцитометр на малой мощности светового микроскопа. Использование цели 10X подсчитать количество живых клеток, которые исключены синий краситель трипанового и присутствуют в средней площади с обеих сторон гемоцитометре.
- Для расчета концентрации клеток, умножьте среднем 2 квадратов по 100 (коэффициент разбавления), а затем умножить на 10, чтобы дать 4 число клеток / мл.
- Регулировка конечной концентрации 0,5 × 10 6 клеток / мл в Т-клеточной среде. Добавить конечной концентрации 1 мкг / мл каждого из бактериальных суперантигенам стафилококковый энтеротоксин В (SEB) и токсин синдрома токсического шока 1 (TSST) к клеткам. Культура в течение 72 ч (37 ° С и 5% CO 2), чтобы расширить популяцию клеток CD4 + Т.
- Пелле Т-клетки (1200 XG, 5 мин) и ресуспендируют в 0,5 х 10 6 клеток / мл в Т-клеточной среде сДобавление человеческого IL-15 (20 нг / мл). Передача лимфоцитов к T150 колбу. Продолжать расширять / разбить ячейки в полном среднесрочной IL-15 каждый час 24-48 при необходимости (на основе цвета СМИ, то есть, всякий раз, когда средства массовой информации оказывается от розового до светло-желтого) после этого. Поддерживать результате популяции лимфоцитов на срок до 15 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: По дизайну, этот протокол будет активировать и расширить специально подмножество CD4 + Т-клеток, которые реагируют на SEB и TSST, а затем вести их в сторону Th1-подобный фенотип эффектор / память. Другие лейкоциты не выживают и растут в этих условиях, например, что за шагом 1,10 клетки будет по меньшей мере 95% CD4 +, CD45RO + Т-клеток 19, как легко оценена с помощью проточной цитометрии. При желании, дальнейшей очистки может быть легко достигнуто путем коммерчески доступного антитела / магнитного бисера, основанных положительных или отрицательных комплектов отбора.
2. Начиная первичных человеческих эндотелиальных клеток культуры
<ол>3. Генеральный дробление и расширение эндотелиальных клеток
- Рост клеток до ~ 90-95 конфлюентности. Это может занять 2-5 дней. Для расщепления,удалить средства массовой информации и промыть PBS. Удалить PBS и заменить с минимальным объемом свежего 1x трипсина (0,5 мл для T25 или 1,5 мл для T75). Аккуратно водоворот, чтобы покрыть всю поверхность с трипсином. Выдержите в 37 ° C в течение ~ 5 мин. Монитор отряд клеток из пластины с использованием малой мощности светового микроскопа.
- При большинство клеток появляются округлые или отдельно, добавляют 5 объемов (т.е. по сравнению с объемом трипсина добавленной) из подогретого полной EGM-2 среды и осторожно пипеткой по поверхности колбы, чтобы отделить все ячейки.
- Количество эндотелиальных клеток с помощью гемоцитометра, как описано в 1,6-1,7. Гранул клетки центрифугированием (5 мин, 1200 XG). Удалить супернатант. Регулировка концентрации 0,5 млн клеток на мл добавлением подогретого полной EGM-2 мВ сред.
- Передача аликвоты клеток в соответствующие FN-покрытием блюда или колбах для технического обслуживания. Аккуратно водоворот и поместить в инкубатор. Изменение информации в течение 6-12 ч обшивки. СМИ шоУльд быть изменены примерно каждый 48 ч после этого.
4. эндотелиальных клеток Трансфекцию
ПРИМЕЧАНИЕ: Первичный эндотелиальные клетки невосприимчивыми к трансфекции наиболее распространенных химических и электропорации методов. Трансфекция основе метода ядерно описано ниже позволяет относительно высокой эффективности трансфекции (~ 50-70%). Эффективная альтернативный метод использования инфекции с помощью соответствующих вирусных векторов (см комментарии в таблице материалов).
- Подготовьте T25 или T75 колб (при необходимости) о HLMVECs или HDMVECs до конечной плотности 90-95% confluency.Coat с фибронектином (FN) 20ug / мл в PBS в стерильных условиях либо микроскопа культуральных планшетах, таких как дельта-Т пластин (для шаг 5) или 12 мм круглые покровные стекла помещают внутрь лунку планшета для культивирования клеток в 24-луночный (для стадии 6) с, как описано выше (2.1).
- Добавить 1 мл полной EGM-2 культуральной среде с микроскопом культуры platesor 0,5 мл в каждую лунку 24 и равновесие пластин вувлажненной 37 ° C / 5% CO 2 инкубаторе.
- Урожай и считать эндотелиальные клетки, как в шагах 3.1-3.3.Centrifuge необходимого объема клеток (0,5 млн клеток на образец) при 1200 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Тщательно ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл RT ядерного трансфекции раствора на образце.
- Смешайте 100 мкл клеточной суспензии с 1-5 мкг ДНК. Перевести клеток / подвеска ДНК в сертифицированных кювете; Образец должен покрыть дно кюветы без воздушных пузырьков.
Примечание: Конструкции, направленные YFP или DsRed к клеточной мембране (через N-концевых 20 аминокислот neuromodulin, что содержит сигнал для посттрансляционной пальмитоилирование) были использованы в одиночку (одна мембрана-YFP или мембраной DsRed одна) или совместной трансфекции с цитоплазматическая объемная маркер (например, мембрана-YFP и растворимый DsRed). Многие перестановки флуоресцентный белок маркеров могут быть использованы. - Закройте кювету крышкой. Вставьте кювету склеточной суспензии / ДНК в держатель кювет электропоратора и применять электропорации программы S-005. Возьмите кювету из держателя, как только программа закончена.
- Добавить ~ 500 мкл предварительно уравновешенную питательных сред в кювету и осторожно удалите клеточной суспензии из кюветы с использованием пластиковых пипеток трансфер предоставляется в комплекте ядерной трансфекции.
- Для экспериментов с использованием микроскопа культуры пластины разделить клеточную суспензию из одной реакции в равной степени между двумя блюд, содержащих подогретого СМИ (Шаги 4,2-4,3). Для экспериментов с использованием 24-луночного / плита, разделов одна реакция поровну между 3 скважин.
- Инкубируйте клетки в увлажненной 37 ° C / 5% CO 2 инкубаторе и замены среды 4-6 ч, и снова на 12-16 ч после трансфекции.
5. живых изображений сотовый и анализ
- Подготовка эндотелия
- День 0: Со-трансфекции первичных HLMVECs с мембранного YFP и растворимого DsRed через nucleofeие технологии, как описано в шаге 4 и пластины на живой клеточной культуре изображений пластин.
- День 1: Заменить среды свежей средой, содержащей IFN-gamma (100 нг / мл), чтобы индуцировать экспрессию МНС-II. На 2-й день стимулировать трансфицированных клеток добавлением 20 нг / мл TNF-alpha к существующему сред.
- На 3 день, инкубировать эндотелий с 1 мкг / мл каждого из бактериальных суперантигенам стафилококковый энтеротоксин B (SEB) и токсин синдрома токсического шока 1 (TSST) при 37 ° C в течение 30-60 мин непосредственно перед экспериментами. Пропустите этот шаг для контрольных условиях "-ag '.
- Подготовка Лимфоциты
- Параллельно с шагом 5.1.3, готовят буфер А (без фенолового красного HBSS) с добавлением 20 мМ Hepes, рН 7,4, и 0,5% об / об человеческий сывороточный альбумин предварительно нагревают до 37 ° С. Возьмите образец культивируемых лимфоцитов и определить плотность путем подсчета с помощью гемоцитометра (этап 1.12-1.17).
- Центрифуга 2 млн клеток на образец на 1,200 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре в 15 мл коническую пробирку. Аспирируйте СМИ и осторожно ресуспендируют осадок клеток в 2 мл буфера не такой, что никакая клетка кластеры остаются.
- Удалить свежий аликвоту Фура-2 красителя кальция и ресуспендируют в ДМСО, чтобы концентрация акций в 1 мм.
- Добавить 2 мкл фура-2 маточного раствора к суспензии клеток Т (2 мкМ конечная концентрация), крышка трубки и смешать сразу переворачивая пробирку, чтобы обеспечить равномерное диспергирование красителя. Выдержите в 37 ° C в течение 30 мин.
- Центрифуга, как в шаге 5.2.2. Аспирируйте буфера-А и мягко, но тщательно вновь переместить лимфоцитов в 20-40 мкл свежего буфера-А.
- Настройка изображений живых клеток и сбора
Примечание: Большое разнообразие систем могут быть использованы для получения изображения живых клеток флуоресценции от вертикальных и перевернутых световых микроскопов. Основные требования включают в себя источник света флуоресценции и фильтров, ПЗС-камеры, моторизованные переключение фильтра и жалюзи, подогреваемый этап (или microscОПЕ-стойку с подогревом камера) и программного обеспечения для автоматизированного получения изображений. Для этого протокола высокой числовой апертурой, большим увеличением (т.е., 40х, 63x) масло погружения линзы, необходимое для достижения необходимого пространственного разрешения. Особое внимание должно быть принято в выборе соответствующего источника флуоресценции и линзы для визуализации Фура-2 на основе кальция, поскольку не все совместимы с необходимыми длинами волн возбуждения нм 340/380. Альтернативный подход (совместим со стандартными зеленого и красного наборов флуоресцентных фильтров) может быть использован с не-ratiomentic кальция чувствительных красителей (например, Fluo-4, Род-3), однако они не могут точно количественно поток кальция и только обеспечивают относительное / Количественный считывания.- Включите систему микроскопа (ПК для работы, микроскопом, CCD камеры, фильтра колеса и ксеноновой лампы).
- Откройте обозначенный программного обеспечения.
- Настройте микроскоп / Программное обеспечение для автоматизированного многоканального покадровой съемки. Включить последовательную приобретение объявлениемifferential интерференционный контраст (DIC), стандартный зеленый флуоресцентный, стандартный красный светиться и стандартный возбуждения 340 нм и 380 Фура-2 изображения. Установите интервал для приобретения в течение 10-30 сек и общей длительностью ~ 20-60 мин.
- Установите время экспозиции для Фура-2 изображений.
- Добавить свежий объективный масло и смонтировать микроскопа блюдо, содержащее только 0,5 мл буфера-А на стадии нагрева адаптера и сразу включить, чтобы уравновесить до 37 ° С (будет ~ 2-3 мин).
- Добавить отдыхает фура2 загруженных лимфоцитов установленного микроскопа блюдо камеры с использованием 20 мкл пипетки.
- Включите изображений ярком поле. Выберите светлый путь к окуляров. Используйте грубую ручку фокусировки, чтобы принести цели в контакт с нижней части miscoscope блюдо. Используйте окуляр и мелкий ручку фокусировки, чтобы сфокусироваться на Т-клеток поселились на дно тарелки.
- Используйте элементы управления сценические ху выбрать поле, содержащее, по меньшей мере 10 ячеек. Избежатьпереполненных поля и клеточные скопления, как они будут создавать артефакты визуализации.
- Переход от светлого поля до Дневной источник света. Переход от изображения к окуляра CCD камеры. Установите параметры сбора (например, время экспозиции, усиления детектора и Биннинг). Использование программного обеспечения, приобретают отдыхает Fura2-340 и Fura2-380 изображений (начиная с одинаковым временем экспозиции для каждого, как правило, в диапазоне от ~ 200-1000 мс).
- С помощью методов, описанных в шаге 5.4.1 для расчета Fura2-340 / Fura2-380 для каждого лимфоцита. Выполните повторные итерации регулировки Fura2-340 и Fura2-380 время экспозиции, получения изображений и расчета коэффициентов, пока средние значения не близки к 1.
- Установите время экспозиции для MEM-YFP и DsRed.
- Замените микроскопа блюдо использовали в шаге 5.3.3.1 с miscroscope блюдо с трансфецировали, активированный и провисать лечение (или лечить; контроль) HLMVECs или HDMVECs из клеточной культуры инкубатор (этапы 4.5.1). Используйте одноразовые пипетки передачи для быстрого удаления СМИ, промыть один раз добавлением ~ 1 мл подогретого буферного-A. Аспирируйте, а затем добавить 0,5 мл буфера-А.
- Определить области, в которых ярко люминесцентные положительные трансфектант эндотелиальные клетки присутствуют и выглядят здоровыми с хорошо сформированными межклеточных соединений.
- Отрегулируйте параметры измерения (например, время экспозиции, усиления детектора и Биннинг) для MEM-YFP и DsRed. Убедитесь, что среднее значение интенсивности сигнала флуоресценции в каждом канале падает от 25% до 75% от динамического диапазона детектора.
- Установите время экспозиции для Фура-2 изображений.
- Провести эксперимент изображений живых клеток.
- Используйте автоматизированное программное обеспечение, чтобы начать сканирование изображения и захватить несколько интервалов изображений, чтобы установить базовый уровень.
- Во время приобретения применять ~ 5 мкл концентрированных Фура-2-нагруженных лимфоцитов (от шага 5.2) в центре поля изображения микроскопа блюдо, вставив кончик небольшой объем (Р-5или Р-20) пипетки в СМИ недалеко от центра объектива и выброса медленно.
- Как лимфоциты поселиться в области изображения, сделать тонкую настройку в фокусе, чтобы гарантировать, что интерфейс клеток клеток эндотелий Т (иммунологические синапсы) поддерживаются в фокальной плоскости. С 40 и 63x цели, ~ 10-20 клеток на поле, являются оптимальными. Если меньше клетки наблюдаются в повторите шаг поля изображения 5.3.4.2.
- После того, как требуемый интервал наблюдения эксперимента конкурировали, продолжают визуализации и немедленно пипеткой иономицином непосредственно в miscoscope блюдо (с использованием методики, как в 5.3.4.2) до конечной концентрации 2 мкМ, чтобы вызвать максимальный поток кальция / фура-2 сигнал сигнализации (т.е. , средства калибровки, см анализ 5.4.).
- В качестве альтернативы 5.3.4.4after желаемый интервал наблюдения эксперимента конкурировали, немедленно аспирации буфера A и заменить его 0,5 мл раствора (фиксатором 3,7% формальдегида в PBS) в течение 5 мин приРТ, последующей промывкой три раза PBS. Затем переходите к шагу 6.
- Анализ живых клеток изображений
Примечание: После сохранения полученных файлов, они могут быть проанализированы непосредственно или экспортированы для анализа широкого спектра автономных программных приложений для анализа изображений. ImageJ является особенно ценным, универсальный пакет, который находится в свободном доступе и совместимо практически со всеми пакета программного обеспечения приобретение. Дизайн экспериментов изображений, описанных в шагах 5.1-5.3 даст высокую динамику пространственного и временного разрешения взаимодействий между лимфоцитами и эндотелиальной APC в отсутствие и в присутствии родственного SAg. Почти безграничные анализы возможны при решении визуализации данных динамики морфометрического / сигнальных клеточных. Конкретные цели, описанные в данном Протоколе координационно количественно миграции лимфоцитов и сигнализации (т.е., кинетика и уровни внутриклеточного кальция) потока наряду с динамичнымаль изменения в иммунологической синапса архитектуры с акцентом на особенностях (например, ILPs / Подо-печати). Следующие примеры отдельным стандартом и нестандартные (т.е., разработанный специально для этих экспериментов / вопросов) анализирует.- Измерьте поток кальция лимфоцитов
- Выберите (нм EX-510 нм Е.М. 340) и Fura2-380 (380 нм EX-510 нм Е.М.) изображения начальная Fura2-340, которые были приобретены до добавления лимфоцитов. Используйте их в качестве фоновых изображений и цифровой вычесть их из всех изображений во временном ряду для каждого соответствующего канала.
- Для каждой временной точке создать отношение цифровое изображение фона вычитается Fura2-340 и фоновых вычитается Fura2-380 изображений (например, 340 нм EX-510 нм ЭМ-фон / 380 нм EX-510 нм ЭМ-фон).
- Выберите соответствующее программное обеспечение инструмент для рисования. Нажмите на экране, чтобы нарисовать круглую область Iпроценты (ROI) вокруг каждого лимфоцитов. Это будет генерировать значение отношения пиксела в среднем для каждого лимфоцитов и сроки.
- Участок вычисленное соотношение как функцию времени с использованием соответствующего программного приложения (например, электронную таблицу). Рассчитать усредненную поток кальция для эксперимента путем суммирования значения соотношения всех лимфоцитов в поле и что разделить стоимость на общее количество лимфоцитов в каждый момент времени
- Провести анализ lympocyte отслеживания миграции.
- Анализ Т-клеток миграции клеток с помощью соответствующего программного приложения для отслеживания клеток (например, ImageJ), используя канал DIC от каждого видео. Использование ImageJ сотовый отслеживания плагин, определить в каждом кадре центр тяжести каждой ячейки вручную, нажав на нее в каждом прогрессивный кадр.
- Используйте полученные координаты серийный ху (т.е. следы путей миграции), чтобы рассчитать среднюю скорость (общее расстояние мигрировали / общее интервал уплотнительноее томография) и извилистость (общее расстояние мигрировали / линейное расстояние конец в конец между расположением клеток в первом и последнем изображении).
- Кросс-коррелируют эти параметры с потоком кальция (5.4.1) динамики на основе клеток-за ячейкой.
- Оценить Подо-печати / ILP плотность в IS
- Граф общее количество ILP, образованную в каждом Т-клеток через определенные интервалы (например, 5 мин после добавления Т-клеток). Они могут быть определены дискретная микронных люминесцентные кольца мембраной YFP, что ко-локализуются с темными кругами в цитоплазматической DsRed на эндотелиальных APC на сайте лимфоцитов адгезии.
- Кросс-коррелируют полученные "ILP индексы" с потоком кальция (5.4.1) динамики на основе клеток-за ячейкой.
- Измерьте Подо-печать / ILP жизней.
- Для каждого Подо-печати / НРП в данном IS рассчитать свои жизней как последний момент времени, когда НРП была видна - момент времени, когда что-Подо печати / НРП фантастическиесначала появились. Средняя ИЛП времена жизни и за ЭТО.
- Кросс-соотнести эти жизней с потоком кальция (5.4.1) динамики на основе клеток-за ячейкой.
- Оценить временную связь между начального формирования ЦЛП и потока кальция.
- Для каждого лимфоцитов определить момент времени (кадра), в котором кальция сначала растет выше базового 19.
- Для каждого лимфоцитов определить момент времени, в который появляется первым Подо-печати / НРП.
- Для каждого лимфоцитов расчета "смещение времени" путем вычитания начального потока кальция момент времени от начальной Подо-печати / НРП. Средние значения для всех лимфоцитов в поле. Положительные значения указывают на формирование ИЛП предшествует поток кальция, тогда как отрицательные числа указывают на обратное.
Примечание: Эти эксперименты могут быть легко осуществлены в соответствии с физиологически соответствующего ламинарного потока сдвига с использованием коммерчески доступных параллельных стенок камеры изображений потока, как описано 19.
- Измерьте поток кальция лимфоцитов
6. Исправлена-ячейки изображения и анализ
- Исправлена конечная точка Т-клеток-эндотелиальной является формирование и окрашивание
- Подготовка Т-клеток, как описано в 1. Подготовьте эндотелиальные клетки (- / + SAG), как в шаге 5.1 (трансфекции Шаг 5.1.1 не является обязательным). Возьмите образец культивируемых лимфоцитов и определить плотность путем подсчета с помощью гемоцитометра (раздел 1).
- Передача культуры лимфоцитов объеме, эквивалентном не менее 3 х 10 5 лимфоцитов / образец на 15 мл коническую трубку и центрифуги при 200 мкг в течение 3 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок лимфоцитов в буферном-A (этап 5.2.1) концентрации 6 × 10 5 лимфоцитов / мл.
- Удалить эндотелиальные клетки из клеточной культуры инкубатор и (исходя один образец одновременно) последовательно аспирата материал и замените 0,5 мл суспензии лимфоцитов (3 х 10 5 лимфоцитов / образец) и заменить до 37 ° С яncubator.
- После соответствующих времени инкубации, было отмечено выше, аспирации среды из скважин и добавить достаточное Фиксирующий раствор (3,7% формальдегида в PBS), чтобы полностью покрыть образец (например, в 24-луночного планшета ~ 300-500 мкл). Выдержите при комнатной температуре в течение 5-10 мин.
- Промыть образец 3 раза ЗФР. Пятно добавлением первичного антитела в течение 60 мин при комнатной температуре (см список). Если первичное антитело направлено на внутриклеточного белка, дополнительный этап пермеабилизации должна быть выполнена при добавлении достаточного решение проницаемости (0,01% Тритон Х-100 в PBS), чтобы полностью покрыть образец в течение 1 мин при комнатной температуре. Промыть образец 3 раза ЗФР. Добавить соответствующие вторичные антитела (в некоторых случаях одновременно флуоресцентные фаллоидином) в течение 60 мин при комнатной температуре.
- Установите круглую стеклянную покровное на слайде формирования изображения. Исправлена конечная точка Т-клеток-эндотелиальной является формирование и окрашивание. Для начала место визуализации изображений слайд, содержащий образцы на сцене микроскопа и выберите масло 63xзадача. Применить свежего иммерсионное масло.
- Используйте режим формирования ярко-поля и глазные линзы, чтобы определить местонахождение фокальной плоскости. Переключитесь на эпифлуоресцентной и осмотрите образец с помощью глазных линз. Выберите поле интересов. Переключение в режим лазерной сканирующей.
- Использование режима быстрого сканирования и работы в максимально возможной области индивидуально регулировать мощность лазера и коэффициент усиления для каждого канала, чтобы оптимизировать сигнал таким образом, что, в идеале, удельная интенсивность сигнала достигает, по меньшей мере ~ 25% и не более 75% от динамического диапазона детекторов.
- Использование ручного управления фокус, быстро сканировать через Z-оси и определить верхние и нижние пределы секционирования (как правило, вся информация должна содержаться в толщине ~ 15 мкм). Выбор толщины раздел оси Z. в диапазоне 0,2-1,0 мкм ~.
- Наконец, увеличение / обрезать поля изображения в конкретном регионе интересов и поведения сканирования. В дополнение к очень яркий и конкретный флуоресценции сигнал в образце, приобретая 3D-изображений в высоком разрешении требует итераций сканирования и внесения корректировок в параметры приобретения. Целью является для получения максимального ху и разрешение г-оси, без заметного фото-отбеливание.
- Качественно проанализировать топологию 3D топологии ИС путем проведения цифровой 3D-реконструкция в результате оптических срезов через соответствующее приложение программного обеспечения (например, изображения J). Через подобных приложений количественной оценки распределения сигнала флуоресценции (например, совместная локализация и интенсивность флуоресценции корреляционная линия сканирования анализ Пирсона и ортогональных просматривает).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Подход изображений роман помощью эндотелиальных клеток и сочетая преимущества разрешением плоской липидного бислоя модели с физиологический сложности и деформации профессиональной БТР был разработан (рисунок 1). Рисунок 2 приведены примеры типичных миграции, потока кальция и топологических динамики, наблюдаемой с этим подход. В отсутствие прогиба на эндотелии, SAG-специфических лимфоцитов CD4 + Th1 быстро распространяться, поляризации и с боков мигрировать по поверхности эндотелиальных (фиг.2А) без флюса кальций (не показан). В ~ 5-10 мин эти лимфоцитов инициировать переселение через эндотелий. В присутствии SAG погрузки на эндотелии, лимфоцитах распространяться симметрично с '' жареное яйцо топологии, инициировать устойчивый (т.е. в течение 30-60 мин) внутриклеточного кальция (поток Фигура 2В; Movie 1), во время которого они обладаютмало или вообще не миграции (фиг.2С).
Рисунок 2. Анализ живых клеток активации Т-клеток и миграции и иммунологическая Синапс топологии эндотелиальной БТР. (А) Панели показать пример временных рядов изображений Т миграции клеток эндотелия на в отсутствие прогиба. Верхняя панель показывает DIC изображений. Начальное положение мигрирующего Т-клеток указывает красной пунктирной линией. Нижняя панель показывает инвагинации, сформированные на эндотелии миграции Т-клеток. Стрелки указывают формирование переходных колец (~ 0,5-1 мкм диаметром) флуоресценции мембраной YFP, образующихся в результате генерации Т-клеток из "invadosome выступами" (ILPs) против эндотелиальной поверхности APC (см D). (В) показан пример подобной серии в присутствии SAG-загруженной эндотелия (слева; смотри такжесоответствующий фильм 1) и количественный след динамических изменений в уровнях кальция (справа). Стрелки указывает первоначальное образование ILPs, что коррелирует с началом потока кальция (I) и последующую стабилизацию нескольких ILPs, что коррелирует с высокой потока кальция (II). (C) экспериментов, в А и В были подвергнуты клетки отслеживания анализа. DIC изображения с левой шоу представительных Т миграции клеток путей более продолжительности 10 мин (красные следы). График справа показывает расчетные скорости миграции в отсутствие и в присутствии SAg. (D) Динамический анализ иммунологической топологии синапсов (модифицированный из 19). Принципиальная (я) иллюстрирует чувствительной эндотелиальных клеток / APC 'топологии репортер систему ", состоящую из мембраны, ориентированных-YFP и растворимого цитозольном ППП. Актин-опосредованной ИЛП, которые выступают в поверхности клеток эндотелия генерировать цилиндрической формы впячивания (тип клеточного фут-печать, называется "Подо-печать") гИвинг рост резко изогнутой мембраны, которые появляются как кольца флуоресценции мембраной YFP (т.е. стенки цилиндра смотреть анфас). Цитозоль перемещение и исключение этих локусов на выглядят как темные круги цитозольном ППП. ДВС и флуоресцентные изображения в (II) показывают пример такого анализа в присутствии прогиба (смотри также соответствующие фильм 2). Один первоначальный Подо-печати / НРП развивается в массив из> 20 стабилизировались ILPs в течение 15 мин. Blue Box на 15 мин (III) показан вид с высоким разрешением единой Подо-печати / НРП в результате чего кольцо мембраны-YFP совпадает с областью исключенного цитозольном ППП. Пунктирная линия (IV) показывает количественный анализ линии сканирования интенсивности флуоресценции. Масштабные полоски = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Как ранее установлено, лимфоциты ActivЭли зонд поверхность эндотелия путем расширения актина и HS1 (а cortactin гомолога) -энантиомером и WASp- и SRC-зависимой выступы называют "invadosome, как выступы; (ILPs; каждый ~ 0,5-1 мкм в глубину в диаметре) 27,28. Трансфекция мембраной целевой флуоресценции белка (FP) была продемонстрирована, чтобы обеспечить высокую чувствительность к репортерам субклеточных топологических динамики при клеточной поверхности клеток. Таким образом, было показано, что яркий кольца люминесцентной мембраной-FP указывают мембраны изгиба во Т-клеток эндотелия взаимодействия-в результате Т-клеток ILPs выступов. Это показано здесь, и в предыдущих исследованиях 19,20, что в то время малых кластеров ILPs формы и оборота быстро (т.е., время жизни ~ 10-30 сек) в течение латеральной миграции Т-клеток эндотелия на в отсутствие прогиба (рис 2А ), они становятся весьма стабилизирован (т.е. время жизни ~ 30 мин) и накапливать в плотные массивы в присутствиипрогиба (фиг.2В). Кроме того, анализ ILPs и кинетики инициирования кальция («Смещение времени») показывают, что ILPs предшествовать сигнализации кальция, предполагая, что они помогают в процессе распознавания МНС-II / Ag (рис 2Bii). Кроме того, стабилизируется массивы ILPs образуют соизмеримы с максимальной потока кальция (рис 2Bii). Идея, что кольца флуоресценции мембран соответствуют Т-клеток выступов вождения дискретные пятна инвагинации в эндотелиальных БТР, подтверждается демонстрацией того, что эти кольца во всех случаях коррелируют пространственно и кинетически с зонами перемещенных / исключенного цитоплазме (по данным растворимого DsRed; Рисунок 2D и Фильм 2).
Рисунок 3 приведены примеры основных конечных точек исследования конфокальной микроскопии. После 10 мин совместной инкубации в присутствии провеса, ISS, образованного между Т-клетками и эндотелиальными АРС были обследованы с помощью фиксации, яmmuno флуоресценции окрашивания и конфокальной микроскопии. Эти исследования дают анализ динамики распределения субклеточных критических молекул и сигнализации деятельность в МКС, в частности, применительно к ILPs. В частности, цитоскелета / цитоскелета регулятор (актин, HS1; 3А), презентация антигена / признание (CD3 / МНС-II; 3В) адгезия (ICAM-1, LFA-1, Талин, 3С), и антигенного сигнализации (РКС -Q; Рисунок 3D), как замечается, совместно обогащены Подо-отпечатков / НРП. Цифровой реконструкции конфокальных Серийные сечения Z-стеки обеспечивает дополнительную доказательства, показанным на рис 2D, что клетка-эндотелиальной эндотелия Т имеет дискретный 3-размера архитектура перемежается Т-клеток ILP выступающей на поверхности APC (рис 3Aii, C, III, D). (Рис 3Civ).
Рисунок 3. Пример фиксированной Анализ распределения молекулярной динамики в Т-клетками эндотелиальных клеток иммунологических синапсов. Лимфоциты инкубировали на SAG-загруженной эндотелия в течение 30 мин и фиксируют и окрашивают. В указанных панелей эндотелиальных клеток были предварительно трансфекции выразить мембрана-YFP или -DsRed. (А) представитель изображений показывают актина (I) и ТГ1 (а cortactin гомолог; б) со обогащенный на периферии иммунологического синапса в микро-кластерах, которые коррелируют с центром эндотелиальных флуоресцентных колец мембранного YFP (т.е. " Подо-печать "; Смотрите рисунок 2D), подтверждающий, что Т-клеточные ILPs ответственны за появление Подо отпечатков. Вид сбоку (II. 90 ° проекция) показывает, что ILPs представляют 3-мерное выступ в плоскости изображения Z (модифицированной с 19). (Б) представитель обогащение Т-клеток TCR (I) и endothelial МНС-II (II) в иммунологической синапса, показать дискретный субклеточную разделение на НРП / Подо отпечатков. (С) (I) представитель совместно обогащение ICAM-1 и LFA-1 в Podo отпечатков и ILP, соответственно ИС. (я) Показывает 3-D цифровой реконструкции конфокальной разделов поворачивается на 60 ° (верхние панели) и 90 ° (ортогональное зрения; нижние панели). (II) Показывает увеличенный вид Еп лица. (III) показывает ортогональный вид в поперечном разрезе в штучной упаковке в области (II) (модифицированный из 19). (IV) представитель совместного обогащения Талин (линкер белка integtin / актин) и актина в IS ILPs. (D), представитель совместного обогащения TCR сигнализации молекулы ПКС-Q с актина в IS ILPs. Каждая панель показывает собственная вид лица (нижняя левая часть) и двух различных ортогональных просмотров (90 ° проекция). Далеко слева и справа панели использовать в повторности их, соответствующих соседних панелей, по прогнозам, используя радуги fluorescencШкала интенсивности е (редактировался 19). Масштабные полоски = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Фильм 1:. Живых клеток динамических изображений Т клеточной сигнализации кальция и иммунологическая Синапс Топология Покадровый изображений живых клеток из фура2 загруженной CD4 + Th1-лимфоцитов, взаимодействующих с эндотелий выражения мембрана-YFP и загружается с SAg, соответствующий рисунку 2В. Левая панель показывает внутриклеточные уровни кальция (радужные: холодные цвета, с низким содержанием кальция; теплые цвета с высоким содержанием кальция) в Т-клетки. Правая панель показано мембраной YFP флуоресценции на поверхности эндотелиальных APC, Лимфоциты видно инициировать распространение и формирование ILP (как видно с помощью флуоресцентных колец в MEM-YFP канала, то есть, 'Podo отпечатки; см рисунок 2bi), с последующим индукции устойчивой (30-60 мин) внутриклеточного кальция потока, которое происходит соразмерно с образованием периферических массивов ILPs / Подо отпечатков, аналогичных TCR / актина 'сигнализации микро-кластерный », которые видели в плоских моделей двухслойная APC (рис 2Bii). Интервал между кадрами составляет 20 сек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы смотреть это видео.
Фильм 2: Live-сотовый динамических изображений иммунологических Synapse Топология VIфлуоресцентный Журналисты в эндотелиальных БТР. Покадровый живых клеток изображений CD4 + Th1-лимфоцитов (ДВС, слева), взаимодействующие с эндотелия коэкспрессирующей мембрана-YFP (зеленый) и растворимые в цитозоле DsRed (красный) и загружается с SAg, соответствующий Рисунок 2D. Правая панель показывает слияние ДВС, мембраны и цитоплазмы сигнализации. Объединенные сигналы мембраны и цитоплазмы флуоресценции чутко сообщить формирование и реконструкцию нескольких ~ 0,2-1 мкм масштабные поверхности инвагинации (Подо-печать), которые следуют из массива Т-клетки зондирования с ILP выступов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы смотреть это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В целом, этот протокол описывает методы исследования эндотелиальные клетки, как я) изученных физиологических БТР и II) в качестве нового типа из "плоского клеточной модели APC». Что касается первого, то стал все более и более очевидно, что без гемопоэтических периферических (или «стромальных ') БТР играют важную, без избыточных функций (например, по сравнению с кроветворной БТР) в формировании адаптивных иммунных ответов 16-18. Среди таких «полу-профессиональной" БТР, сосудистой и лимфатической эндотелиальных клеток (которые значительно превосходят численностью профессионального БТР) являются одними из лучших оценили 16-18. Тем не менее, детали сигнальных событий и их сочетании иммунологические синапсы в основном остаются неисследованным. Методы, описанные здесь, обеспечивают основу для продвижения понимания в этой новой области. Например, применение этих подходов к изучению МКС, сформированной на эндотелиальных из разных тканей, которые, как известно, проявляют явное Adaptivе иммунологическая функция (например, печени и лимфатической эндотелий), может быть особенно поучительным.
Примечательно, что этот метод помогает преодолеть разрыв между профессиональными БТР и искусственных моделей APC субстрата для того, чтобы расширить возможности допросить основные механизмы адаптивного иммунного ответа. В то время как плоских подложек APC (т.е., липидного бислоя, антитело-стекла с покрытием) обеспечивают оптимальную визуализацию (которая приведет к многих важных прозрений 7,11-14), такие модели по своей природе ограничены. Кроме того, сведения о динамике физиологических сканирования клетка-клетка до сих пор были глубоко скрыта вопросов, связанных с изображениями ориентацию 8-10. Возможности, обеспеченные в текущем подходе преодолеть это препятствие, чтобы однозначно выявить в противном случае незаметного трехмерную архитектуру субклеточную и быстрое ремоделирование физиологического интерфейса APC-Т-клеток. Они предлагают потенциал для нового понимания антигенной сигнализаторг.
Например, понимание того, что Т-клетки образуют ILPs обогащенные TCR, актина и сигнальных молекул (например, рис 2D, рисунок 3), показывают, что эти скорее представляют собой физиологические 3-мерные счетчик части к плоской TCR сигнализации микро-кластеров, наблюдаемых на искусственный APC подложках 6,7,12-14,29-31. Это означает, что в физиологических условиях, лимфоциты могут использовать ILPs как дискретных субклеточных "объемов 3D-реакции" с "signalosome'-как свойства, которые усиливают и поддерживают сигнализации, концентрируя важных молекул / мероприятия 32,33. Кроме того, наличие значительных биомеханических входов (т.е. приложений клетка-клетка силы) в достопримечательностей, если ИЛП выступ против APC может быть выведено из изображений. Это нетривиально механические силы все чаще рассматриваются в качестве важнейших посредников антигенной сигнализации, а именно как такой силыпроявленная остается неясным 14,34-37.
Общий актуальность этой модели в качестве разумного суррогата профессиональной АРС поддерживается нашей прямой демонстрации того, что подобные массивы ILP можно увидеть в синапсах, образованных на ЭК и ДК (и, в меньшей степени, В-клеток), когда были использованы аналогичные подходы изображений (например, использование одних и тех же производителей флуоресценции и контроля является плоской ориентации плоскости 19). Тем не менее, необходимо учитывать, что относительные биомеханические свойства EC в сравнении с профессиональными APC мембранных поверхностей неизвестны и что различия по этому параметру может повлиять на детали IS топологии и антигенных ответов.
Ключ к подходу, описанному в настоящем документе, тесно связаны с ее преимущества разрешения. Это, в свою очередь, сильно связанные с силой сигнала флуоресценции. Таким образом, важно обратить особое внимание на оптимизации трансфекции и окрашивание fluoresцент журналисты и параметры визуализации / техника (например, время экспозиции, фокус, и т.д ...). Что касается первого, то протокол для живых клеток исследований, которые здесь описаны ограничены трансфекции родового мембраны и цитоплазмы маркеров, которые сообщают топологические изменения в интерфейсе Т-клеток АПК в реальном времени (например, рис 2, Походы в кинотеатр 1, 2). Кроме того, этот протокол может быть легко изменен, чтобы больше сложного анализа по одновременно внедряющих / изображений дальнейших журналистами в эндотелия (например, флуоресцентный белок-тегами MHCI / II и адгезии, со-стимулирующий и со-ингибирующие молекулы и биосенсоры для сигнализации и биомеханические динамика). К сожалению, однако, общее ограничение в том, что лимфоциты, как известно, трудно трансфекции. Это исключает удобное использование флуоресцентных белков (например, привязаны к TCR, РКС-Q и т.д.) в Т-клетках для изображений живых клеток.
В то время кактекущий протокол включает в себя активацию лимфоцитов типа человека эффектор / память CD4 + Th1 через SAg (широко используется модель), существует много широкие возможности. Как было показано ранее 19,20 этот подход легко адаптировать к широкому спектру других параметров, таких как ответы других подмножеств CD4 + и активации CD8 + лимфоцитов ответов убийства. Через изоляции лимфоцитов и эндотелиальных клеток из существующих TCR-трансгенных линий Этот метод также легко адаптировать для изучения ответов на конкретные пептидных антигенов 19,20. Наконец, нынешний подход ограничивается рассмотрением эффектор / Т-клеток памяти. Тем не менее, для трансфекции клеток эндотелия с основным костимуляторных молекул (CD80 / 86, как правило, не экспрессируется на эндотелии) может позволить изучению динамики наивных клеток грунтовочных в этой модели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer stretch latex free tourniquet | BD Biosciences | 367203 | |
| BD alcohol swabs | BD Biosciences | 326895 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok | BD Biosciences | 367861 | K2 EDTA |
| BD Vacutainer Push Button Blood Collection Set | BD Biosciences | 367335 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-1L | |
| Ficoll-Paque | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Bring to RT before use |
| FCS-Optima | Atlanta Biologics | s12450 | Heat inactivated |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| staphylococcal enterotoxin B | Toxin Technology | BT202RED | Stock solution 1mg/ml in PBS |
| toxic shock syndrome toxin 1 | Toxin Technology | TT606RED | Stock solution 1mg/ml in PBS |
| human IL-15 | R&D Systems | 247-IL-025 | Stock solution 50ug/ml in PBS |
| PBS | Life Technologies | 10010-049 | |
| Fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells | Lonza | CC-2543 | Other Human Microvascular ECs can be used, i.e. HLMVECs |
| EGM-2 MV bullet kit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T-4174 | Stock solution 10x, dilute in PBS |
| amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit | Lonza | vpb1003 | Required Kit for step 4 |
| IFN-g | Sigma-Aldrich | I3265 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| TNF-alpha 10ug, human | Life Technologies | PHC3015 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| phenol Red-free HBSS | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP299-100 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-100G | Stock solution 1M in H20 |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | Stock solution 1M in H20 |
| Human Serum albumin | Sigma-Aldrich | A6909-10ml | |
| Immersol 518 F fluorescence free Immersion oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Fura-2 AM 20x50ug | Life Technologies | F1221 | Stock solution 1mM in DMSO |
| pEYFP-Mem (Mem-YFP) | Clontech | 6917-1 | |
| pDsRed-Monomer (Soluble Cytoplasmic DsRed) | Clontech | 632466 | |
| pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed) | Clontech | 632512 | |
| pEGFP-Actin | Clontech | 6116-1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Formaldehyde solution 37% | Fisher Scientific | BP531-500 | Toxic, use fumehood |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-5ML | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Falcon Tissue Culture Treated Flasks T25 | Fisher Scientific | 10-126-9 | |
| Falcon Tissue Culture Treated Flasks T75 | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Corning Cell Culture Treated T175 | Fisher Scientific | 10-126-61 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-85 | 12 mm diameter |
| Falcon Tissue Culture Plates 24-well | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| Delta-T plates | Bioptechs | 04200415B | |
| Wheaton Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8D | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| ICAM1 mouse anti-human | BD Biosciences | 555509 | |
| HS1 mouse anti-human | BD Biosciences | 610541 | |
| Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Purified | ebioscience | BMS102 | |
| Anti-Human CD3 Alexa Fluor® 488 | ebioscience | 53-0037-41 | |
| Anti-MHC Class II antibody | Abcam | ab55152 | |
| Anti-Talin 1 antibody | Abcam | ab71333 | |
| Anti-PKC theta antibody | Abcam | ab109481 | |
| phosphotyrosine (4G10 Platinum) | Millipore | 50-171-463 | |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems | Required electroporator for step 4 | |
| Zeiss Axiovert | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss LSM510 | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss Axiovison Software | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet | NuAIRE | Nu-425-600 | |
| Forma STRCYCLE 37 °C, 5% CO2 Cell culture Incubator | Fisher Scientific | 202370 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EW-02570-02 | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
| Isotemp Waterbath model 202 | Fisher Scientific | 15-462-2 |
References
- von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-cell function and migration. Two sides of the same coin. N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).
- Springer, T. A. Adhesion receptors of the immune system. Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).
- Shaw, A. S., Dustin, M. L. Making the T cell receptor go the distance: a topological view of T cell activation. Immunity. 6 (4), 361-369 (1997).
- Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
- Delon, J., Stoll, S., Germain, R. N. Imaging of T-cell interactions with antigen presenting cells in culture and in intact lymphoid tissue. Immunol Rev. 189, 51-63 (2002).
- Brossard, C., et al. Multifocal structure of the T cell - dendritic cell synapse. Eur J Immunol. 35 (6), 1741-1753 (2005).
- Dustin, M. L. The cellular context of T cell signaling. Immunity. 30 (4), 482-492 (2009).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
- Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J Cell Sci. 123, 309-320 (2010).
- Oddos, S., et al. High-speed high-resolution imaging of intercellular immune synapses using optical tweezers. Biophys J. 95 (10), L66-L68 (2008).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Bunnell, S. C., et al. T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies. J Cell Biol. 158 (7), 1263-1275 (2002).
- Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
- Seminario, M. C., Bunnell, S. C. Signal initiation in T-cell receptor microclusters. Immunol Rev. 221, 90-106 (2008).
- Dustin, M. L. Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies. J Struct Biol. 168 (1), 152-160 (2009).
- Martinelli, R., Carman, C. V. Lymphocyte Endothelilal Interactions. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. , Elsevier. London. (2015).
- Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T lymphocyte-endothelial cell interactions. Annu Rev Immunol. 22, 683-709 (2004).
- Marelli-Berg, F. M., Jarmin, S. J. Antigen presentation by the endothelium: a green light for antigen-specific T cell trafficking? Immunol Lett. 93 (2-3), 109-113 (2004).
- Sage, P. T., et al. Antigen recognition is facilitated by invadosome-like protrusions formed by memory/effector T cells. J Immunol. 188 (8), 3686-3699 (2012).
- Kumari, S., et al. Actin foci facilitate activation of the phospholipase C-gama in primary T lymphocytes via the WASP pathway . eLife. , (2015).
- Marelli-Berg, F. M., et al. Major histocompatibility complex class II-expressing endothelial cells induce allospecific nonresponsiveness in naive T cells. J Exp Med. 183 (4), 1603-1612 (1996).
- Ma, W., Pober, J. S. Human endothelial cells effectively costimulate cytokine production by, but not differentiation of, naive CD4+ T cells. J Immunol. 161 (5), 2158-2167 (1998).
- Perez, V. L., Henault, L., Lichtman, A. H. Endothelial antigen presentation: stimulation of previously activated but not naive TCR-transgenic mouse T cells. Cell Immunol. 189 (1), 31-40 (1998).
- Epperson, D. E., Pober, J. S. Antigen-presenting function of human endothelial cells. Direct activation of resting CD8 T cells. J Immunol. 153 (12), 5402-5412 (1994).
- Shiao, S. L., et al. Human effector memory CD4+ T cells directly recognize allogeneic endothelial cells in vitro and in vivo. J Immunol. 179 (7), 4397-4404 (2007).
- Marelli-Berg, F. M., Okkenhaug, K., Mirenda, V. A two-signal model for T cell trafficking. Trends Immunol. 28 (6), 267-273 (2007).
- Carman, C. V., et al. Transcellular diapedesis is initiated by invasive podosomes. Immunity. 26 (6), 784-797 (2007).
- Carman, C. V. Mechanisms for transcellular diapedesis: probing and pathfinding by 'invadosome-like protrusions'. J Cell Sci. 122 ((Pt 17)), 3025-3035 (2009).
- Dustin, M. L., Tseng, S. Y., Varma, R., Campi, G. T. T cell-dendritic cell immunological synapses. Curr Opin Immunol. 18 (4), 512-516 (2006).
- Saito, T., Yokosuka, T. Immunological synapse and microclusters: the site for recognition and activation of T cells. Curr Opin Immunol. 18 (3), 305-313 (2006).
- Gomez, T. S., et al. HS1 functions as an essential actin-regulatory adaptor protein at the immune synapse. Immunity. 24 (6), 741-752 (2006).
- Burbach, B. J., Medeiros, R. B., Mueller, K. L., Shimizu, Y. T-cell receptor signaling to integrins. Immunol Rev. 218, 65-81 (2007).
- Vicente-Manzanares, M., Sanchez-Madrid, F. Role of the cytoskeleton during leukocyte responses. Nat Rev Immunol. 4 (2), 110-122 (2004).
- Ma, Z., Janmey, P. A., Finkel, T. H. The receptor deformation model of TCR triggering. Faseb J. 22 (4), 1002-1008 (2008).
- Ma, Z., Sharp, K. A., Janmey, P. A., Finkel, T. H. Surface-anchored monomeric agonist pMHCs alone trigger TCR with high sensitivity. PLoS Biol. 6 (2), e43 (2008).
- Groves, J. T. Bending mechanics and molecular organization in biological membranes. Annu Rev Phys Chem. 58, 697-717 (2007).
- Xu, C., et al. Regulation of T cell receptor activation by dynamic membrane binding of the CD3epsilon cytoplasmic tyrosine-based motif. Cell. 135 (4), 702-713 (2008).
