Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

نموذج الخلايا البطانية مستو التصوير المناعية سنبس حيوية

Published: December 24, 2015 doi: 10.3791/53288
Automatic Translation
1, 1
1Department of Medicine, Harvard Medical School - BIDMC

Abstract

وينظم المناعة التكيفية التي كتبها التفاعلات الدينامية بين الخلايا T ومستضد الخلايا ("ناقلات الجنود المدرعة ') يشار إليها باسم" نقاط الاشتباك العصبي المناعية. داخل هذه الواجهات خلية خلية الحميمة مجموعات فرعية الخلوية منفصلة من MHC / حج-TCR، F-الأكتين، التصاق والجزيئات يشير شكل واعادة تشكيلها بسرعة. ويعتقد أن هذه الديناميات أن تكون العوامل الحاسمة من كفاءة ونوعية الاستجابات المناعية التي تقوم بتطوير وبالتالي حماية مقابل حصانة مرضية. الفهم الحالي للنقاط الاشتباك العصبي المناعية مع فيزيولوجي ناقلات الجنود المدرعة محدودة بسبب عدم كفاية القرار تصوير الحصول عليها. رغم أن النماذج الركيزة الاصطناعية (مثل طبقات ثنائية الدهون مستو) توفر قرار ممتاز، وكانت أدوات قيمة للغاية، فهي بطبيعتها غير فيزيولوجي والتبسيط. ظهرت الأوعية الدموية واللمفاوية الخلايا البطانية بمثابة حجرة الأنسجة الطرفية هامة (أو اللحمية) من "شبه مهنةآل ناقلات الجنود المدرعة. هذه ناقلات الجنود المدرعة (التي تعبر عن معظم الآلات الجزيئية المهنية ناقلات الجنود المدرعة) لديها ميزة فريدة من تشكيل سطح الخلية مستو تقريبا وهي transfectable بسهولة (على سبيل المثال، مع الصحفيين بروتين فلوري). هنا إحدى الوسائل الأساسية لتنفيذ الخلايا البطانية كما رواية وفيزيولوجي "مستو نموذج APC الخلوي 'لتحسين التصوير والاستجواب من عمليات إشارات المستضدات الأساسية سوف يمكن وصفها.

Introduction

T الليمفاوية هي فرع من نظام المناعة التكيفية التي تتميز القدرة على التعرف على كفاءة الببتيد المستضد (حج) منضمة إلى رئيسي معقد التوافق النسيجي (MHC) الجزيئات من خلال مستقبلات الخلايا T الخاصة بهم (TCRs) 1. اللمفاويات السذاجة تهاجر بشكل جوهري ومسح "حج تقديم الخلايا المهنية" (ناقلات الجنود المدرعة، على سبيل المثال، والخلايا الجذعية) داخل الغدد الليمفاوية، بينما تحتاج خلايا الذاكرة / T المستجيب لدراسة فعالية مجموعة واسعة جدا من ناقلات الجنود المدرعة والخلايا المستهدفة المحتملة داخل الأنسجة الطرفية.

في دقيقة بعد الاعتراف الأولي وما شابه ذلك حج على APC، الخلايا اللمفية اعتقال هجرتهم والبدء في تشكيل الحميمة واجهة خلية خلية متخصصة تسمى "المشبك المناعي" (IS). أصيب (أي 30-60 دقيقة) هو يطلب من الاتصالات لتضخيم والحفاظ يشير 2-7. دراسات الناشئة تحديد ذلك ضمن IS، هو تشكيل المستمر وص السريعemodeling من الإشارات المنفصلة شبه الخلوية مجموعات صغيرة (أي التي تحتوي على MHC / حج-TCR، F-الأكتين، التصاق والجزيئات يشير) التي تحدد قوة وجودة الناتج الاستجابات المناعية 2-7. ومع ذلك، تفاصيل ديناميكية وآلية تنظيمية لهذه العملية هي غير مفهومة تماما 8،9. هذا نابع إلى حد كبير من التحديات الفنية المرتبطة طبولوجيا عدم انتظام السطوح APC والتوجه سيئة تسيطر الطائرات التفاعل خلية خلية، المسائل التي تحد عميقا في التصوير الزمانية المكانية اللازمة النهج 10/08 (Figure1A).

الشكل 1

الشكل 1. فسيولوجي مستو نموذج APC خلية التصوير المناعية سنبس حيوية. ويوضح التخطيطي التصوير التقليدي للالمشبك المناعي بين الخلايا التائية والمهنيه نال APC (A) والخلايا التائية ومستو الدهون النموذج التقليدي طبقة ثنائية APC (B) بالمقارنة مع هذه البطانية نموذج مستو APC رواية (C). توفر ناقلات الجنود المدرعة المهنية نقاط الاشتباك العصبي المناعية الفسيولوجية ولكن تقدم سيئة موجهة اجهة خلية خلية (أي فيما يتعلق طائرة التصوير س ص المثلى؛ والقرار ~ 0.2 ميكرون)، والذي يعرض للخطر بشكل كبير المكاني (طائرة التصوير ض قرار ~ 1 ميكرون)، والزمانية (أي، بسبب الحاجة لمسح مرارا وتكرارا من خلال جميع الطائرات ض التصوير) قرار من التصوير. نماذج طبقة ثنائية لديها طوبولوجيا مستو الذي يوفر الأمثل القرار التصوير الزمانية المكانية، ولكن أيضا مبسطة للغاية، غير الفسيولوجية وجامدة. هذا النموذج الخلايا البطانية يجمع بين طوبولوجيا مستو من طبقات ثنائية الدهون مع الركيزة الفسيولوجية من APC الكلاسيكية لتقديم الأمثل القرار التصوير المكاني والزماني في وضع فيزيولوجي.م / ملفات / ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

العمل السابق والتحايل جزئيا على هذه العقبات من خلال تطوير نماذج مستو الركيزة (أي طبقات ثنائية الدهون والأسطح المغلفة الأجسام المضادة) التي توفر قرار الزمانية المكانية الأمثل (أي عن طريق تحديد T تنشيط الخلايا السطحية في خطة واحدة التي هي موازية لتصوير س ص الأمثل الطائرة) 11-15 (الشكل 1B). وقد سهلت هذه النماذج معلومات هامة في ديناميات التحت خلوية / الجزيئية التي تتحكم في الإشارات المستضدات في الخلايا T، بما في ذلك اكتشاف الأكتين ديناميكية / TCR يشير-مجموعات الصغيرة 7،11-14. ومع ذلك، فإن التبسيط بطبيعتها مثل هذه النماذج، وكذلك جامدة (النافية للتنمية / دراسة الخصائص الطبوغرافية 3-الأبعاد) (الشكل 1B). ولذلك، فإنه لا يزال غير مؤكد كيفية ربط هذه النتائج إلى فيزsiologic خلية خلية المراقبة المناعية.

وإن كان لا يزال دراسة سلوكه، الأوعية الدموية والخلايا البطانية اللمفاوية آخذة في الظهور كما كبيرة (أي أكبر في أعداد من جميع ناقلات الجنود المدرعة المهنية، التي كتبها ~ 1000 مرات) حجرة الطرفية من "شبه المحترفين ناقلات الجنود المدرعة 16-18. هذه الخلايا تعبر عن MHC-I-، MHC-II- وعدد كبير من الجزيئات المشارك مشجعا (على سبيل المثال، CD40، LFA3، ICOSL، 4-1BB، OX40L، TL1A، PD-L1، ولكن لا CD80 CD86 و) وهي استراتيجيا وضعه في واجهة الأنسجة الدموية التي يعملون فيها وظائف الحارس المتخصصة 16-18. وأظهرت دراسات سابقة أن الخلايا البطانية على نحو فعال إعادة تحفيز المستجيب / الذاكرة، ولكن ليس ساذجا، وخلايا T 19-25. وبالتالي، من المرجح أن يلعب أدوار APC فريدة من نوعها في المرحلة المستجيب من الاستجابات المناعية التكيفية داخل الأنسجة الطرفية، مثل التأثير المحلي على T تنشيط الخلايا، والتمايز، والذاكرة والتسامح 16،17،26 الخلايا البطانية. CRItically، عندما نمت في المختبر، الخلايا البطانية شكل سطوح الخلايا مستو تقريبا وهي transfectable بسهولة (على سبيل المثال، مع الصحفيين بروتين فلوري). هذه الميزات هي مثالية عالية الدقة التصوير الزمانية المكانية لديناميات الطوبوغرافية خلال التفاعلات خلية خلية 19،27. وهكذا الخلايا البطانية قد تكون بمثابة فيزيولوجي "مستو الخلوي APC" النموذجية مناسبة مميزة لدراسة آليات إعادة التحت خلوية / الجزيئية التي تدفع الاعتراف مستضد وتنظيم الاستجابات (الشكل 1C) 19،20.

أنشئت سابقا تقنيات التصوير التكميلية (بما في ذلك ترنسفكأيشن من خلايا بطائن مع صانعي بروتين فلوري من غشاء البلازما والعصارة الخلوية) لدراسة تفاصيل تفاعل الكريات البيض البطانية خلال الالتصاق والهجرة transendothelial 27، أظهرت أن الكريات البيض تسبر بنشاط سطح البطانة التي كتبها ديناميكية الإدراج فيد تراجع من ميكرون نطاق الفرعي، نتوءات أسطواني الأكتين الغنية (~ 200-1،000 نانومتر في القطر والعمق) يطلق مثل invadosome نتوءات (أي، "ILPs ') 27،28. تم زيادة توسيع هذه النهج التصوير جنبا إلى جنب مع إنشاء بروتوكولات للاستفادة من البطانية وظيفة APC لتطوير أساليب الأولى لارتفاع القرار التصوير الزمانية المكانية للT خلايا البطانية المشبك المناعي كما ورد 19،20 وكذلك وصف هذا القانون. وكان من النتائج المركزي المستمدة من هذه مستو رواية الخلوية نموذج APC هو أن T ILPs خلية تعمل سواء في تعزيز الكشف حج الأولي والحفاظ على الإشارات اللاحقة. في الواقع، صفائف ILPs متعددة (التي استقرت والمستحقة في الرد المبدئي تدفق الكالسيوم) عرض تخصيب اليورانيوم في TCR والجزيئات توحي الإشارات النشطة مثل PKC-Q، ZAP-70، فسفوتيروزين وHS1. ولذلك، يبدو ILPs لتمثيل يعادل فيزيولوجي ثلاثي الأبعاد لالجزئي TCR-إشاراتمجموعات ينظر في نماذج طبقة ثنائية مستو. هذا النهج، وبالتالي، يكشف بحساسية / تقارير الديناميات الجزيئية والهندسة المعمارية (والضمنية النشاط الحيوي) لا يمكن كشفها خلاف ذلك.

الطريقة الموضحة في هذه الوثيقة يجب أن يكون مفيدا في سد الفجوة بين APC المهنية والصناعية نماذج الركيزة APC من أجل تعزيز قدرتنا على استجواب الآليات الأساسية من الاستجابات المناعية التكيفية. بينما هنا يتم التركيز على تفعيل CD4 + TH1 من نوع المستجيب / خلية الذاكرة، وهذا النهج الأساسي يمكن تعديلها بسهولة لدراسة مجموعة واسعة من أنواع الخلايا T وقسم الخدمات الزراعية، كما هو مبين أدناه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وتجرى جميع التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول مع خلايا T الإنسان الأساسية والخلايا البشرية الأولية المتاحة تجاريا البطانية يجب الموافقة على (عن طريق الجلد أو الرئتين الاوعية الدموية الدقيقة ECS). أي بروتوكول البحوث التي تجرى على البشر من قبل مجلس المراجعة المؤسسية ويجب تقديم موافقة خطية من علم كل متبرع بالدم. تمت الموافقة على التجارب التي أجريت باستخدام هذا البروتوكول من قبل IRB من مركز بيث إسرائيل ديكونيس الطبي.

1. إعداد CD4 + الإنسان TH1 المستجيب / T خلايا الذاكرة

  1. تطبيق وقف النزف لذراع المانحة، ويمسح عرق مع الكحول، وإدراج إبرة. رسم ببطء 15 مل من الدم إلى vacutainer باستخدام EDTA كما تخثر. عندما تم وضع الدم، فك وقف النزف قبل إزالة الإبرة. تطبيق على الفور الضغط على الجرح بشاش معقم عند إزالة إبرة.
  2. نقل الدم إلى أنبوب 50 مل. إضافة RPMI-1640 في RT بنسبة 1: 1 تخفيف (الحجم النهائي 30 مل) تراكب بعناية مخففد الدم على اثنين من 50 مل أنابيب تحتوي على 15 مل من تصفيتها قبل الخلايا اللمفية المتوسطة العزلة مثل Ficoll-Paque في RT.
  3. أجهزة الطرد المركزي التدرج في RT لمدة 30 دقيقة في 1200 x ج في الدوار الدلو المتأرجح. في حين الطرد المركزي إعداد الخلايا التائية المتوسطة (500 مل من RPMI-1640، 50 مل FCS، 5 مل البنسلين / الستربتومايسين).
  4. على إزالة أنبوب 50 مل من أجهزة الطرد المركزي، ومراقبة أربع طبقات: بيليه من خلايا الدم الحمراء في الجزء السفلي، وpaque، وطبقة من الخلايا التي تحتوي على خلايا الدم البيضاء (بما في ذلك الخلايا الليمفاوية) والبلازما. إزالة بعناية طبقة خلايا الدم البيضاء مع ماصة باستور ونقل في أنبوب فالكون 50 مل.
  5. غسل طبقة خلايا الدم البيضاء عن طريق إضافة RT RPMI-1460 (ما يصل الى 20 مل)، والطرد المركزي في RT لمدة 5 دقائق في 1200 ز س. Resuspend وخلايا الدم البيضاء في 1 مل من الخلايا التائية المتوسطة. إضافة 5 ميكرولتر من تعليق 1 مل الخلية إلى 250 ميكرولتر المتوسطة الخلايا التائية في أنبوب 1.5 مل الطرد المركزي وتخلط بلطف صعودا وهبوطا بواسطة ماصة.
  6. إضافة 25 ميكرولتر تمييعد تعليق خلية إلى 25 ميكرولتر 0.4٪ التريبان الأزرق. إضافة 10 ميكرولتر من الخليط على كل جانب من عدادة الكريات القياسية.
  7. وضع عدادة الكريات على انخفاض المجهر ضوء السلطة. باستخدام الهدف 10X حساب عدد الخلايا التي استبعاد الصبغة الزرقاء التريبان وتكون موجودة في الساحة الأوسط من كلا الجانبين من عدادة الكريات الحية.
  8. لحساب تركيز الخلية، مضاعفة متوسط ​​المربعات 2 100 (عامل تمييع) ثم ضرب من قبل 10 4 إلى إعطاء عدد من خلية / مل.
  9. ضبط التركيز النهائي إلى 0.5 × 10 6 خلية / مل في الخلايا التائية المتوسطة. إضافة تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / مل كل من superantigens بكتيريا المكورات العنقودية المعوي B (SEB) ومتلازمة الصدمة السامة السم 1 (TSST) إلى الخلايا. الثقافة لمدة 72 ساعة (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2) لتوسيع السكان الخلية CD4 + T.
  10. خلايا بيليه T (1200 x ج، 5 دقائق) و resuspend في 0.5 × 10 6 خلية / مل في الخلايا التائية المتوسطة معإضافة البشري IL-15 (20 نانوغرام / مل). نقل الخلايا الليمفاوية إلى قارورة T150. مواصلة توسيع / تقسيم الخلايا في كامل متوسطة IL-15 كل 24-48 ساعة حسب الحاجة (على أساس اللون وسائل الإعلام، أي كلما تتحول وسائل الاعلام من الوردي إلى اللون الأصفر قليلا) بعد ذلك. الحفاظ الناتجة السكان الخلايا اللمفاوية لمدة تصل إلى 15 يوما.
    ملاحظة: حسب التصميم، وهذا البروتوكول تفعيل وتوسيع تحديدا فرعية من الخلايا CD4 + T التي هي رد الفعل لSEB وTSST ومن ثم دفعهم نحو TH1 تشبه النمط الظاهري المستجيب / الذاكرة. خلايا الدم البيضاء الأخرى تفشل في البقاء والنمو في ظل هذه الظروف، ان هذه خطوة 1.10 الخلايا سوف يكون 95٪ على الأقل CD4 +، CD45RO + T الخلايا 19، كما يمكن بسهولة المقررة من قبل التدفق الخلوي. إذا رغبت في ذلك، ويمكن بسهولة أن يتحقق مزيد من التنقية من خلال الأجسام المضادة متاح تجاريا / مغناطيسية حبة مجموعات مختارة إيجابية أو سلبية القائمة.

2. البدء الأولية غشائي الإنسان خلية الثقافة

<رأ>
  • معطف قارورة T25 مع فبرونيكتين (FN) 20 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني في ظروف معقمة. ترك في RT لمدة 30-60 دقيقة. إزالة FN وإضافة 5 مل المتوسطة كاملة (غشائي بصل متوسطة (EBM-2) متوسطة تستكمل مع غشائي متوسط ​​النمو (EGM-2) singlequots). قبل احتضان في 37   ° C ثقافة الخلية الحاضنة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
  • ذوبان الجليد قارورة من الرئة أو الجلد الإنسان الاوعية الدموية الدقيقة الخلايا البطانية المجمدة (HLMVECs أو HDMVECs) في 37 ° C حمام الماء مع الإثارة لطيف عرضية ل~ 2-3 دقيقة. على الفور نقل الخلايا إلى T25 قارورة تحتوي على وسائل الاعلام قبل تحسنت. دوامة بلطف ووضعه في الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
  • تغيير وسائل الاعلام بعد ~ 6/4 ساعة. الاستمرار في تغيير وسائل الاعلام تقريبا كل 48 ساعة (أو عندما يصبح الإعلام الأصفر قليلا) حتى تصل لوحة ~ 90-95٪ confluency.

    • 3. تقسيم العام والتوسع في الخلايا البطانية

    1. تنمو الخلايا إلى ~ 90-95 confluency. وهذا قد يستغرق 2-5 أيام. للتقسيم،إزالة وسائل الإعلام وشطف مع برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني واستبدالها مع حجم الحد الأدنى من 1X الطازجة التربسين (0.5 مل لT25 أو 1.5 مل لT75). دوامة بلطف لتغطية جميع السطح مع التربسين. في احتضان 37 ° C ~ لمدة 5 دقائق. مراقبة المفرزة من الخلايا من لوحة باستخدام المجهر ضوء منخفض الطاقة.
    2. عندما معظم الخلايا تظهر تقريب أو فصل، إضافة 5 الحجم (أي، مقارنة مع حجم التربسين المضافة) من قبل تحسنت الكامل EGM-2 متوسطة وماصة بلطف على سطح القارورة لفصل كل الخلايا.
    3. عد الخلايا البطانية مع عدادة الكريات كما هو موضح في 1،6-1،7. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي (5 دقائق، 1200 x ج). إزالة طاف. ضبط تركيز إلى 0.5 مليون خلية لكل مليلتر بإضافة قبل تحسنت الكامل EGM-2 MV وسائل الإعلام.
    4. نقل aliquots من الخلايا إلى أطباق أو قوارير FN المغلفة المناسبة للصيانة. دوامة بلطف ووضع في الحاضنة. تغيير وسائل الإعلام خلال 6-12 ساعة من الطلاء. شو سائل الإعلاميونيتبول أن تتغير تقريبا كل 48 ساعة بعد ذلك.

    4. غشائي ترنسفكأيشن الخلية

    ملاحظة: الابتدائية الخلايا البطانية الحرارية هي ترنسفكأيشن معظم الطرق الكيميائية شيوعا و electroporation. طريقة القائمة على ترنسفكأيشن النووي هو موضح أدناه يسمح للكفاءة ترنسفكأيشن عالية نسبيا (~ 50-70٪). طريقة بديلة الفعلي هو استخدام العدوى عن طريق ناقلات فيروسية المناسبة (انظر التعليقات في مواد الجدول).

    1. إعداد T25 T75 أو قوارير (حسب الحاجة) من HLMVECs أو HDMVECs إلى الكثافة النهائية من 90-95٪ confluency.Coat مع فبرونيكتين (FN) 20ug / مل في برنامج تلفزيوني في ظروف معقمة إما لوحات ثقافة المجهر مثل دلتا-T لوحات (ل الخطوة 5) أو 12 ملم coverslips الزجاج الدائرية وضعها داخل بئر من 24-جيدا لوحة الثقافة الخلية (للخطوة 6) مع كما هو موضح أعلاه (2.1).
    2. إضافة 1 مل من EGM-2 وسائل الإعلام ثقافة إلى أخرى المجهر platesor 0.5 مل لكل 24 جيدا وتتوازن لوحات فيترطيب 37 ° C / 5٪ CO 2 الحاضنة.
    3. الحصاد وعدد الخلايا البطانية كما هو الحال في 3.1-3.3.Centrifuge الخطوات حجم المطلوب من الخلايا (0.5 مليون خلية لكل عينة) في 1200 x ج لمدة 5 دقائق على RT. resuspend الكرية خلية بعناية في 100 ميكرولتر RT الحل ترنسفكأيشن النووي لكل عينة.
    4. الجمع بين 100 ميكرولتر من تعليق خلية مع 1-5 DNA ميكروغرام. نقل خلية / DNA تعليق في كفيت شهادة. يجب أن تغطي عينة أسفل كفيت دون فقاعات الهواء.
      تم استخدام التركيبات التي تستهدف YFP أو DsRed لغشاء الخلية (من خلال N-محطة 20 الأحماض الأمينية من neuromodulin التي تحتوي على إشارة لpalmitoylation posttranslational) وحدها (غشاء YFP وحدها أو غشاء DsRed وحده) أو transfected المشترك مع ملاحظة: علامة الحجمية حشوية (على سبيل المثال، غشاء YFP وقابل للذوبان DsRed). ويمكن استخدام العديد من التباديل من علامات بروتين فلوري.
    5. إغلاق كفيت مع غطاء. إدراج كفيت معتعليق خلية / الحمض النووي في حامل كوفيت من electroporator وتطبيق برنامج Electroporation للS-005. اتخاذ كفيت من صاحب بمجرد الانتهاء من البرنامج.
    6. إضافة ~ 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام معايرتها قبل الثقافة لكفيت وإزالة بلطف تعليق خلية من كفيت باستخدام الماصات البلاستيكية نقل المنصوص عليها في عدة ترنسفكأيشن النووية.
    7. لإجراء التجارب باستخدام لوحات ثقافة المجهر تقسيم تعليق خلية من رد فعل واحد بالتساوي بين اثنين من الأطباق التي تحتوي على وسائل الاعلام قبل تحسنت (خطوات 4،2-4،3). لإجراء التجارب باستخدام 24 جيد / لوحة، تقسيم رد فعل واحد بالتساوي بين 3 آبار.
    8. احتضان خلايا في ترطيب 37 ° C / 5٪ CO 2 الحاضنة وتغيير وسائل الاعلام 6/4 ساعة، ومرة أخرى في 12-16 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

    5. يعيش التصوير خلية وتحليل

    1. إعداد البطانة Endothelium
      1. اليوم 0: شارك في transfect HLMVECs الابتدائي مع غشاء YFP وقابل للذوبان DsRed عبر nucleofeالتكنولوجيا ction كما هو موضح في الخطوة 4 وطبق على الخلية الحية لوحات ثقافة التصوير.
      2. اليوم 1: استبدال المتوسطة مع المتوسطة الطازجة التي تحتوي على IFN-γ (100 نانوغرام / مل) للحث على MHC-II التعبير. في يوم 2. تحفيز الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل عن طريق إضافة 20 نانوغرام / مل TNF-α الى وسائل الاعلام القائمة.
      3. في يوم 3، واحتضان البطانة مع 1 ميكروغرام / مل كل من superantigens الجرثومي المعوي العنقودية B (SEB) ومتلازمة الصدمة السامة السم 1 (TSST) في 37 ° C لمدة 30-60 دقيقة قبل على الفور إلى التجارب. حذفت هذه الخطوة لظروف السيطرة "-Ag.
    2. إعداد الخلايا اللمفاوية
      1. بالتوازي مع خطوة 5.1.3، وإعداد العازلة A (الفينول الحمراء الخالية HBSS) تستكمل مع 20 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.4 و 0.5٪ ت / ت ألبومين المصل البشري قبل تحسنت إلى 37 ° C. أخذ عينة من الخلايا الليمفاوية مثقف وتحديد كثافة عن طريق العد مع عدادة الكريات (الخطوة 1،12-1،17).
      2. الطرد المركزي 2000000 خلايا لكل عينة في 1،200 x ج لمدة 5 دقائق على RT في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. A بحيث لا تبقى مجموعات الخلايا وسائل الإعلام نضح وبيليه الخلية و resuspend برفق في 2 مل من العازلة.
      3. إزالة قسامة جديدة من FURA-2 صبغ الكالسيوم وresuspend في DMSO لجعل تركيز الأسهم من 1 ملم.
      4. إضافة 2 ميكرولتر من FURA-2 الحل الأسهم إلى تعليق خلية T (2 ميكرومتر تركيز النهائي)، غطاء الأنبوب وتخلط على الفور من قبل قلب الأنبوب لضمان حتى تشتت الصبغة. في احتضان 37 ° C لمدة 30 دقيقة.
      5. الطرد المركزي كما في الخطوة 5.2.2. نضح العازلة-A والخلايا الليمفاوية بلطف ولكن بدقة Resuspend في 20-40 ميكرولتر من الطازجة العازلة-A.
    3. الخلية الحية الإعداد التصوير واكتساب
      ملاحظة: مجموعة واسعة من أنظمة يمكن استخدامها لخلية حية التصوير مضان على المجاهر ضوء تستقيم ومقلوب. وتشمل المتطلبات الأساسية مصدر مضان ضوء والمرشحات، كاميرا CCD، بمحركات تبديل فلتر ومصاريع، مرحلة ساخنة (أو microscغرفة ساخنة مكتب مستشار رئيس الوزراء، ركوب) وبرامج لاكتساب صورة الآلي. لهذا البروتوكول الفتحة العددية العالية، تضخم عالية (أي، 40X، 63X) يطلب من العدسات غمر النفط لتحقيق القرار المكانية اللازمة. يجب توخي الحذر خاصة في اختيار مصدر مضان المناسب والعدسات لتصوير الكالسيوم المستندة FURA-2 وليس كل متوافقة مع موجات المطلوبة 340/380 نانومتر الإثارة. نهج بديل (متوافقة مع معيار مجموعات مرشح مضان الخضراء والحمراء) يمكن استخدامها مع الأصباغ غير ratiomentic الكالسيوم حساسة (مثل فلوو-4، Rhod-3)، رغم أن هذه لا يمكن quantitate بدقة تدفق الكالسيوم وتوفر سوى قريب / قراءات الكمية.
      1. تشغيل نظام المجهر (PC للعملية، المجهر، وكاميرا CCD، عجلة تصفية وزينون مصباح).
      2. فتح برنامج المعين.
      3. انشاء المجهر / برنامج لالأقنية الآلي الوقت الفاصل بين التصوير. تشمل الاستحواذ متتابعة من الإعلاناتعلى النقيض ifferential تدخل (DIC)، مخضر القياسية، يتألق الأحمر القياسية ومستوى 340 و 380 نانومتر الإثارة FURA-2 الصور. تعيين الفاصل الزمني لاقتناء لمدة 10-30 ثانية، وتبلغ مدته ~ 20-60 دقيقة.
        1. تعيين أوقات التعرض لFURA-2 التصوير.
          1. إضافة زيت موضوعي الطازجة وجبل طبق المجهر تحتوي على 0.5 مل من العازلة-A على محول مرحلة التسخين وتتحول على الفور لكي تتوازن إلى 37 ° C (سيستغرق ~ 2-3 دقيقة).
          2. إضافة يستريح الخلايا الليمفاوية Fura2 تحميلها إلى غرفة طبق المجهر شنت باستخدام ماصة 20 ميكرولتر.
          3. بدوره على التصوير حقل مشرق. حدد مسار الضوء إلى العدسات. استخدام مقبض التركيز الخشنة لتحقيق الهدف في اتصال مع الجزء السفلي من الطبق miscoscope. استخدام العدسة ومقبض التركيز بشكل جيد في التركيز على خلايا T استقرت في قاع الطبق.
          4. استخدام الضوابط مرحلة س ص لتحديد حقل يحتوي على 10 على الأقل الخلايا. تجنبمزدحمة على الحقول وكتل الخلايا وهذه سوف تخلق التحف التصوير.
          5. التحول من حقل مشرق لفلوري مصدر الضوء. التحول من تصوير العدسة إلى كاميرا CCD. تعيين المعلمات اقتناء (على سبيل المثال، وقت التعرض، وزيادة كاشف وbinning). باستخدام حصول على برامج يستريح Fura2-340 والصور Fura2-380 (بدءا من وقت التعرض متطابقة لكل منهما، عادة في حدود ~ 200-1،000 ميللي ثانية).
          6. استخدام الأساليب المذكورة في الخطوة 5.4.1 لحساب Fura2-340 / Fura2-380 لكل الخلايا اللمفاوية. أداء التكرار المتكرر لضبط Fura2-340 ومرات التعرض Fura2-380، والحصول على صور واحتساب النسب حتى متوسط ​​قيم قريبة إلى 1.
        2. تعيين أوقات التعرض لم-YFP وDsRed.
          1. استبدال طبق الاداة المستخدمة في الخطوة 5.3.3.1 مع طبق miscroscope تحتوي على transfected، تنشيط وتعامل تبلد (أو دون علاج، والسيطرة) HLMVECs أو HDMVECs من حاضنة الثقافة الخلية (خطوات 4.5.1). استخدام ماصة نقل القابل للتصرف لإزالة بسرعة وسائل الإعلام، وشطف مرة واحدة عن طريق إضافة ~ 1 مل من قبل تحسنت العازلة-A. نضح ثم قم بإضافة 0.5 مل من العازلة-A.
          2. تحديد المجالات التي الخلايا البطانية transfectant الإيجابية الفلورسنت الزاهية موجودة وتظهر صحية مع تقاطعات بين الخلايا بشكل جيد.
          3. ضبط المعلمات اقتناء (على سبيل المثال، وقت التعرض، وزيادة كاشف وbinning) لم-YFP وDsRed. مما لا شك فيه أن متوسط ​​كثافة إشارة مضان في كل قناة تقع بين 25٪ و 75٪ من النطاق الديناميكي للكشف.
      4. إجراء تجربة التصوير الخلية الحية.
        1. استخدام برامج الحاسوب الآلي لبدء الحصول على الصور والتقاط عدة فترات من الصور لإنشاء خط الأساس.
        2. خلال الاستحواذ تطبيق ~ 5 ميكرولتر من الخلايا الليمفاوية FURA-2 تحميلها المركزة (من الخطوة 5.2) إلى وسط الميدان التصوير طبق المجهر عن طريق إدراج غيض من الحجم الصغير (P-5أو P-20) ماصة في وسائل الإعلام على مقربة من مركز للهدف وإخراج ببطء.
        3. كما تستقر الخلايا الليمفاوية في مجال التصوير، وإجراء تعديلات الجميلة في التركيز لضمان أن الخلية بطائن اجهة الخلايا التائية (المشابك المناعية) يتم الاحتفاظ بها في المستوى البؤري. مع 40 والهدف 63X، ~ 10-20 خلايا لكل حقل هي الأمثل. إذا لوحظت أقل من الخلايا في كرر الخطوة مجال التصوير 5.3.4.2.
        4. بعد تنافس الفاصل المراقبة المرجوة من التجربة، ومواصلة التصوير وماصة على الفور ionomycin مباشرة في طبق miscoscope (باستخدام تقنية كما هو الحال في 5.3.4.2) لتركيز النهائي من 2 ميكرومتر للحث على تدفق الكالسيوم القصوى / FURA-2 إشارة الإشارات (أي ، وسيلة للمعايرة، انظر التحليل 5.4).
        5. كما تنافس بديلا ل5.3.4.4after الفاصل المراقبة المرجوة من التجربة، ونضح على الفور العازلة-A واستبدالها مع 0.5 مل من محلول تثبيتي (3.7٪ الفورمالديهايد في PBS) لمدة 5 دقائق فيRT، تليها الشطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. ثم انتقل إلى الخطوة 6.
    4. تحليل تعيش خلية التصوير
      ملاحظة: بعد حفظ الملفات المكتسبة، قد يتم تحليلها بشكل مباشر أو تصديرها لتحليلها من قبل مجموعة واسعة من خارج خط تطبيقات البرمجيات تحليل الصور. يماغيج هو، حزمة تنوعا للغاية قيمة خاصة التي هي متاحة بحرية ومتوافقة مع كل حزمة البرامج اكتساب تقريبا. سوف تصميم تجارب التصوير هو موضح في الخطوات 5،1-5،3 تسفر ديناميكية القرار المكانية والزمانية عالية من التفاعل بين الخلايا الليمفاوية والبطانية APC في غياب وجود الترهل وما شابه ذلك. تقريبا التحليلات بلا حدود ممكنة عند معالجة البيانات التصوير الخلوية ديناميات كيمونسيجيا / الإشارات. الأهداف المحددة الموضحة في هذه بروتوكول معين هي لتحديد coordinately الهجرة اللمفاويات إشارة، (أي حركية ومستويات تدفق الكالسيوم داخل الخلايا) جنبا إلى جنب مع ديناميةآل التغيرات في بنية المشبك المناعية مع التركيز على ميزات معينة (أي ILPs / بودو يطبع). وفيما يلي أمثلة على معيار مستقل وغير القياسية (أي وضعت خصيصا لهذه التجارب / أسئلة) يحلل.
      1. قياس تدفق الخلايا الليمفاوية الكالسيوم
        1. حدد الأولي Fura2-340 (340 EX-510 نانومتر EM نانومتر) وFura2-380 (380 نانومتر EX-510 نانومتر EM) الصور التي تم الحصول عليها قبل إضافة الخلايا الليمفاوية. استخدام هذه كصور خلفية ورقميا طرح عليهم من كل الصور في السلسلة الزمنية لكل قناة منها.
        2. لكل نقطة زمنية خلق صورة نسبة الرقمية للFura2-340-طرح الخلفية والصور Fura2-380-طرح الخلفية (أي 340 نانومتر EX-510 نانومتر EM-الخلفية / 380 نانومتر EX-510 نانومتر EM-الخلفية).
        3. حدد أداة برنامج الرسم المناسبة. انقر على الشاشة لرسم منطقة دائرية من أنادفع الفوائد (ROI) حول كل الخلايا اللمفاوية. وهذه تولد قيمة نسبة متوسط ​​بكسل لكل اللمفاويات والإطار الزمني.
        4. مؤامرة نسبة تحسب بوصفها وظيفة من الوقت باستخدام تطبيق البرمجيات المناسبة (على سبيل المثال، برنامج جداول البيانات). حساب تدفق الكالسيوم متوسط ​​للتجربة عن طريق جمع قيم نسبة كل من الخلايا الليمفاوية في الميدان، وتقسيم تلك القيمة من قبل عدد من الخلايا الليمفاوية عن كل نقطة زمنية
      2. إجراء تحليل lympocyte تتبع هجرة.
        1. تحليل الخلايا T الهجرة الخلية باستخدام التطبيق المناسب تتبع الخلية برنامج (على سبيل المثال، يماغيج) باستخدام قناة مدينة دبي للإنترنت من كل فيديو. باستخدام يماغيج خلية تتبع البرنامج المساعد، وتحديد في كل إطار النقطه الوسطى من كل خلية يدويا عن طريق النقر عليه في كل إطار التدريجي.
        2. استخدام الناتجة إحداثيات س ص التسلسلي (أي آثار مسارات الهجرة) لحساب سرعة المتوسط ​​(المسافة الإجمالية هاجر / مجموع الفاصلة سو التصوير) وتعرج (المسافة الإجمالية هاجر / المسافة الخطية نهاية إلى نهاية بين موقع الخلية في الصورة الأولى والأخيرة).
        3. عبر ربط هذه المعلمات مع تدفق الكالسيوم (5.4.1) ديناميكية على أساس الخلية من قبل الخلايا.
      3. تقييم الكثافة بودو الطباعة / ILP داخل IS
        1. عد العدد الإجمالي للILP شكلت في كل خلية T فترات يعرف (على سبيل المثال، 5 دقائق بالإضافة منصب خلايا T). ويمكن تحديد هذه المنفصلة نطاق ميكرون الفلورسنت حلقات غشاء YFP أن شارك في توطين مع الهالات السوداء في هيولي DsRed على APC البطانية في موقع من اللمفاويات التصاق.
        2. عبر ربط الناتجة 'الفهارس ILP "مع تدفق الكالسيوم (5.4.1) ديناميكية على أساس الخلية من قبل الخلايا.
      4. قياس بودو الطباعة / عمر ILP.
        1. لكل بودو الطباعة / ILP في معين هو حساب عمر بوصفها نقطة زمنية الماضية عندما كان ILP مرئية - نقطة وقت أن بودو الطباعة ILP فاي /ظهر RST. متوسط ​​أعمار ILP على حد سواء في IS.
        2. عبر ربط هذه الأعمار مع تدفق الكالسيوم (5.4.1) ديناميكية على أساس الخلية من قبل الخلايا.
      5. تقييم العلاقة الزمنية بين تشكيل ILP الأولي وتدفق الكالسيوم.
        1. لكل اللمفاويات تحديد نقطة زمنية (الإطار) الذي الكالسيوم أولا ترتفع فوق خط الأساس 19.
        2. لكل اللمفاويات تحديد نقطة الوقت الذي أول بودو الطباعة / يبدو ILP.
        3. لكل اللمفاويات حساب على "تعويض الوقت" من خلال طرح تدفق الكالسيوم نقطة زمنية الأولية عن ذلك من الأولي بودو الطباعة / ILP. متوسط ​​القيم لجميع الخلايا الليمفاوية في حقل. القيم الإيجابية تدل على تشكيل ILP تسبق تدفق الكالسيوم بينما الأرقام السالبة تشير إلى عكس ذلك.
          ملاحظة: هذه التجارب يمكن بسهولة أن يؤديها تحت تدفق الصفحي القص ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية باستخدام المتاحة تجاريا موازيا الجدار غرف التصوير التدفق كما هو موضح 19.

    التصوير 6. خلية الثابتة والتحليل

    1. نقطة النهاية الثابتة T خلايا البطانية IS تشكيل وتلطيخ
      1. إعداد الخلايا T كما هو موضح في 1. إعداد الخلايا البطانية (- / + SAG) كما في الخطوة 5.1 (ترنسفكأيشن، الخطوة 5.1.1 اختيارية). أخذ عينة من الخلايا الليمفاوية مثقف وتحديد كثافة عن طريق العد مع عدادة الكريات (القسم 1).
      2. نقل حجم يعادل الثقافة اللمفاويات للا يقل عن 3 × 10 5 الخلايا الليمفاوية / العينة إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل والطرد المركزي في 200 x ج لمدة 3 دقائق. إزالة طاف و resuspend بيليه الخلايا اللمفاوية في الواق-A (الخطوة 5.2.1) تركيز 6 × 10 5 الخلايا الليمفاوية / مل.
      3. إزالة الخلايا البطانية من الحاضنة زراعة الخلايا و (الشروع عينة واحدة في وقت واحد) وسائل الاعلام نضح تباعا واستبدالها مع 0.5 مل من تعليق لمفاوية (3 × 10 5 الخلايا الليمفاوية / عينة) ويستعاض إلى 37 ° C طncubator.
      4. بعد مرات الحضانة المناسبة، ذكر أعلاه، نضح المتوسط ​​من الآبار وإضافة الحل كافية تثبيتي (3.7٪ الفورمالديهايد في PBS) لتغطية كامل العينة (على سبيل المثال، في 24 لوحة جيدا ~ 300-500 ميكرولتر). في احتضان RT لمدة 5-10 دقيقة.
      5. شطف العينة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. وصمة عار وذلك بإضافة الأجسام المضادة الأولية لمدة 60 دقيقة في RT (انظر القائمة). إذا تم توجيه الأجسام المضادة الأولية إلى البروتين داخل الخلايا، تحتاج خطوة permeabilization إضافية ليتم تنفيذها عن طريق إضافة حل permeabilization كافية (0.01٪ TritonX-100 في PBS) لتغطية كامل العينة لمدة 1 دقيقة في RT. شطف العينة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. إضافة الأجسام المضادة الثانوية المناسبة (في بعض الحالات phalloidin الفلورسنت بالتزامن) لمدة 60 دقيقة في RT.
      6. جبل ساترة الزجاج الدائرية على شريحة التصوير. نقطة النهاية الثابتة T خلايا البطانية IS تشكيل وتلوين. لبدء مكان التصوير الشريحة التصوير التي تحتوي على عينات على المسرح المجهر وحدد النفط 63Xموضوعي. تطبيق زيت الغمر الطازجة.
    2. استخدام وضع التصوير مشرق الميدان وعدسات العين لتحديد موقع الطائرة التنسيق. التبديل إلى epifluorescence وتفتيش عينة عن طريق عدسات العين. اختر مجال الاهتمام. التبديل إلى وضع الليزر المسح الضوئي.
    3. باستخدام طريقة المسح السريع والعمل في أوسع مجال ممكن ضبط فردي قوة الليزر وكسب كل قناة لتحسين إشارة مثل هذا، من الناحية المثالية، تصل كثافة إشارة محددة على الأقل ~ 25٪ ولا تزيد على 75٪ من مجموعة ديناميكية من كاشفات.
    4. استخدام عناصر تحكم التركيز اليدوي والمسح الضوئي بسرعة من خلال Z-محور وتحديد الحدود العليا والدنيا من باجتزاء (عادة كل المعلومات التي ينبغي الواردة في سمك ~ 15 ميكرون). حدد القسم سمك Z-axis في نطاق ~ 0،2-1،0 ميكرون.
    5. وأخيرا، والتكبير / اقتصاص مجال التصوير إلى منطقة محددة من الفائدة والسلوك المسح الضوئي. بالإضافة إلى وجود مشرق جدا ومحددة سي مضانgnal في العينة، الحصول عالية الدقة 3D التصوير يتطلب تكرار المسح وإجراء تعديلات على المعلمات الاستحواذ. الهدف هو الحصول على س ص الأقصى وقرار ض محور، دون ملموس الصور التبييض.
    6. تحليل نوعي طوبولوجيا طوبولوجيا 3D من أبرز بإجراء إعادة الإعمار 3D الرقمية من المقاطع البصرية الناتجة من خلال تطبيق البرامج المناسبة (على سبيل المثال، J صورة). من خلال تطبيقات مماثلة تقييم كمي لتوزيع إشارة مضان (على سبيل المثال، وشارك في توطين وكثافة مضان المتلازم تحليل بيرسون خط المسح الضوئي وعرض متعامد).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    وقد تم تطوير نهج التصوير رواية باستخدام الخلايا البطانية والجمع بين مزايا حل مستو طبقات ثنائية الدهون النموذج مع تعقيد فيزيولوجي والتشوه المهنية ناقلات الجنود المدرعة (الشكل 1). الشكل 2 أمثلة للهجرة نموذجية، تدفق الكالسيوم وديناميات الطوبوغرافية لاحظ مع هذا مقاربة. في حالة عدم وجود الترهل على البطانة، الخلايا الليمفاوية تبلد محددة CD4 + TH1 ينتشر بسرعة، الاستقطاب وتهاجر أفقيا على سطح البطانية (الشكل 2A) دون الصهر الكالسيوم (لا يظهر). داخل ~ 5-10 دقيقة هذه اللمفاويات الشروع التهجير عبر البطانة. في ظل وجود الترهل تحميلها على البطانة، الخلايا الليمفاوية ينتشر بشكل متناظر مع "البيض المقلي" طوبولوجيا، والشروع مستدامة (أي لمدة 30-60 دقيقة) تدفق الكالسيوم داخل الخلايا (الشكل 2B، فيلم 1) خلال الوقت الذي يعرضونالهجرة قليلة أو معدومة (الشكل 2C).

    الرقم 2
    الشكل 2. تحليل لايف خلية من تفعيل الخلايا التائية وألواح الهجرة والمناعية سنبس طوبولوجيا من غشائي ناقلات الجنود المدرعة. (A) تظهر مثال على السلاسل الزمنية التصوير T الهجرة الخلية على البطانة في غياب الترهل. يظهر لوحة العلوي الصور DIC. يشار إلى الموقف المبدئي للخلية T المهاجرة من الخط المنقط باللون الأحمر. يظهر لوحة أقل الانغلافات تشكلت على البطانة التي كتبها الخلية الهجرة T. السهام تشير إلى تشكيل عصابات عابرة (~ 0.5-1 ميكرون قطر) من غشاء YFP مضان تشكلت نتيجة لT الجيل خلية من "نتوءات مثل invadosome" (ILPs) ضد سطح البطانية APC (انظر D). (B) يدل على سبيل المثال من سلسلة مماثلة في وجود البطانة تبلد تحميل (يسار؛ أنظر أيضاالفيلم 1) والتتبع الكمي للتغيرات الديناميكية في مستويات الكالسيوم (يمين) المقابلة. السهام تشير التشكيل الأولي ILPs الذي يرتبط مع بدء تدفق الكالسيوم (ط) والاستقرار لاحق من ILPs المتعددة التي يرتبط تدفق الكالسيوم عالية (II). تعرض (C) كما هو الحال في تجارب A و B لخلية التحليل تتبع. صور مدينة دبي للإنترنت على اليسار ممثل تظهر مسارات هجرة الخلايا T خلال مدة 10 دقيقة (آثار الحمراء). الرسم البياني على اليمين يظهر السرعات الهجرة محسوب في غياب وجود الترهل. (D) التحليل الديناميكي للمناعي طوبولوجيا المشبك (معدلة من 19). التخطيطي (ط) يوضح خلية البطانية / APC "طوبولوجيا نظام مراسل" حساسة تتألف من استهداف غشاء YFP وRFP عصاري خلوي القابلة للذوبان. بوساطة الأكتين ILP أن تبرز إلى السطح الخلايا البطانية توليد الانغلافات على شكل اسطوانة (وهو نوع من الخلايا القدم الطباعة، يطلق عليه اسم "بودو الطباعة ') زارتفاع تعيشان إلى غشاء عازمة بشدة أن تبدو وكأنها حلقات من غشاء YFP مضان (أي جدران الاسطوانة ينظر أون الوجه). النزوح العصارة الخلوية والإقصاء في هذه المكاني تظهر الهالات السوداء اعتبارا من RFP عصاري خلوي. مدينة دبي للإنترنت والصور مضان في (ب) تبين مثال على هذا التحليل في وجود الترهل (أنظر أيضا فيلم 2). وحيد الأولية بودو الطباعة / ILP تطور الى مجموعة من> 20 استقرت ILPs أكثر من 15 دقيقة. ويوضح المربع الأزرق في 15 دقيقة (ج) وجهة نظر عالية الدقة من واحد بودو الطباعة / ILP حيث حلقة من غشاء YFP تتداخل مع منطقة استبعاد RFP عصاري خلوي. خط متقطع (د) يظهر خط تحليل المسح الكمي من شدة مضان. الحانات النطاق = 5 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    كما أنشأت سابقا، الخلايا الليمفاوية أكتيفاعل التحقيق سطح البطانة من خلال توسيع الأكتين وHS1 (أ نديد cortactin) -enriched وWASp- ونتوءات تعتمد على SRC يسمى 'نتوءات مثل invadosome. (ILPs، كل ~ 0.5-1 ميكرومتر في العمق في القطر) 27،28. وقد تجلى ترنسفكأيشن التي تستهدف غشاء البروتين مضان (FP) لتوفير صحفيين حساسة للغاية لديناميات الطوبوغرافية التحت خلوية في السطوح خلية خلية. في هذه الطريقة، وقد تبين أن حلقات مشرقة من الفلورسنت غشاء FP تدل على غشاء الانحناء أثناء T تفاعل الخلايا البطانية نتيجة لT خلية نتوءات ILPs. هو مبين هنا، وفي دراسات سابقة 19،20، في حين أن مجموعات صغيرة من ILPs شكل ودوران سريع (أي عمر من ~ 10-30 ثانية) أثناء الهجرة الجانبية للخلايا T على البطانة في غياب تبلد (الشكل 2A )، فإنها تصبح استقرت إلى حد كبير (أي عمر من ~ 30 دقيقة)، وتتراكم في صفائف كثيفة في الوجودمن تبلد (الشكل 2B). وعلاوة على ذلك، وتحليل ILPs وحركية بدء الكالسيوم ('الوقت إزاحة ") تبين أن ILPs تسبق إشارة الكالسيوم، مما يشير إلى أنها تساعد في عملية الاعتراف MHC-II / حج (الشكل 2Bii). بالإضافة إلى ذلك، استقرت صفائف ILPs شكل يتناسب مع تدفق الكالسيوم القصوى (الشكل 2Bii). فكرة أن حلقات من مضان غشاء تتوافق مع T نتوءات خلية القيادة البقع انغلاف منفصلة في ناقلة جنود مصفحة البطانية، ما تؤكده المظاهرة أن هذه الحلقات في جميع الحالات ترتبط مكانيا وحركيا مع مناطق النازحين / السيتوبلازم استبعاد (كما ذكرت من قبل ذوبان DsRed؛ الشكل 2D و فيلم 2).

    ويبين الشكل 3 أمثلة من نقطة النهاية الثابتة دراسات التصوير متحد البؤر. بعد 10 دقيقة من شارك في الحضانة في وجود الترهل، محطة الفضاء الدولية التي تشكلت بين الخلايا T وناقلات الجنود المدرعة البطانية تم تصويرها من قبل التثبيت، طتلطيخ mmuno مضان والفحص المجهري متحد البؤر. وتوفر هذه الدراسات تحليلا للديناميات توزيع التحت خلوية من الجزيئات الحيوية والأنشطة يشير داخل محطة الفضاء الدولية في علاقة خاصة لILPs. (تالين ICAM-1، LFA-1،، الشكل 3C)؛ (الشكل 3B CD3 / MHC-II) التصاق الاعتراف، تقديم المستضد /، على وجه التحديد، هيكل الخلية / منظم هيكل الخلية (الشكل 3A الأكتين، HS1)، ويشير المستضدات (بي كي سي تعتبر الشكل 3D) يشترك المخصب في بودو يطبع / ILP؛، س. إعادة البناء الرقمي للمتحد البؤر المسلسل القسم ض مداخن دليلا مكملة لتلك التي تظهر في الشكل 2D أن الخلايا البطانية البطانية T لديه فترة منفصلة العمارة 3-البعد تتخللها T خلية ILP جاحظ في سطح APC (الشكل 3Aii، تسى، ثالثا، D). (الشكل 3Civ).

    الشكل (3) الشكل 3. تحليل الثابتة عينة من توزيع الديناميات الجزيئية في T الخلوي الخلايا البطانية المناعية نقاط الاشتباك العصبي. حضنت الخلايا اللمفاوية على البطانة تبلد تحميلها لمدة 30 دقيقة وثابتة وملطخة. في لوحات أشارت خلية البطانية و transfected قبل للتعبير عن غشاء YFP أو -DsRed. (A) تظهر التصوير الممثل الأكتين (ط) وHS1 (أ نديد cortactin؛ الثاني) المخصب المشارك في محيط المشبك المناعي في التجمعات الصغيرة التي ترتبط مع مركز حلقات الفلورسنت البطانية من غشاء YFP (أي " بودو يطبع '؛ انظر الشكل 2D) مؤكدا أن T ILPs الخلايا هي المسؤولة عن ظهور بودو يطبع. وعرض الجانب (الثاني 90 ° الإسقاط) يوضح أن ILPs تمثل 3-الأبعاد نتوء في الطائرة ض التصوير (معدلة من 19). (B) لتخصيب الممثل من الخلايا التائية TCR (ط) وendothelial MHC-II (ب) داخل المشبك المناعي، تظهر التقسيم التحت خلوية منفصلة إلى ILP / بودو يطبع. (C) (ط) الممثل المشارك إثراء ICAM-1 وLFA-1 في بودو-المطبوعات وILP على التوالي للمؤشر. (ط) يدل على إعادة الإعمار الرقمية 3-D من أقسام مبائر من يتم استدارة 60 درجة (لوحات العليا) و 90 ° (عرض متعامد، لوحات أقل). (ب) يبين وجهة نظر أنجستروم من أبرز أون الوجه. (ج) يبين وجهة نظر مستعرضة متعامد المنطقة محاصر في (ب) (معدلة من 19). (د) الممثل المشارك إثراء تالين (بروتين رابط integtin / الأكتين) والأكتين في IS ILPs. (D) الممثل المشارك إثراء TCR يشير جزيء PKC-Q مع الأكتين في IS ILPs. وتظهر كل لوحة وجهة نظر أون الوجه (الجزء السفلي الأيسر) وجهتا نظر المتعامدة متميزة (90 ° الإسقاط). لوحات من اليسار المتطرف واليمين نستخدمها هي مكررات، والألواح المجاورة منها، المتوقعة باستخدام fluorescenc قوس قزحمقياس كثافة ه (معدلة من 19). الحانات النطاق = 5 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    فيلم 1

    فيلم 1: لايف سيل الحيوي التصوير من T الكالسيوم خلية اشارة والمناعية سنبس طوبولوجيا الفاصل بين وقت التصوير الخلية الحية من Fura2 محملة CD4 + TH1 الخلايا اللمفاوية التفاعل مع البطانة معربا عن غشاء YFP ومحملة تبلد الموافق الشكل 2B. وتظهر اللوحة اليسرى مستويات الكالسيوم داخل الخلايا (قوس قزح: الألوان الباردة، وانخفاض الكالسيوم، الألوان الدافئة عالية من الكالسيوم) في الخلايا التائية. اللوحة اليمنى يظهر مضان غشاء YFP على سطح APC البطانية. تعتبر الخلايا الليمفاوية لبدء نشر وتشكيل حزب العمال المستقل (كما رأينا عبر حلقات الفلورسنت في قناة م-YFP، أي "بودو يطبع '؛ انظر الشكل 2Bi)، تليها تحريض من (30-60 دقيقة) تدفق الكالسيوم داخل الخلايا مستمرة، والذي يحدث يتناسب مع تشكيل المصفوفات الطرفية من ILPs / بودو بصمات مشابهة لTCR / الأكتين 'يشير الصغرى عنقودية "التي ينظر إليها في مستو نماذج طبقة ثنائية APC (انظر الشكل 2Bii). الفاصل الزمني بين الإطارات هو 20 ثانية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو.

    فيلم 2

    فيلم 2: لايف سيل الحيوي التصوير من المناعية سنبس طوبولوجيا السادسمراسلون الفلورسنت في غشائي ناقلات الجنود المدرعة. الوقت الفاصل بين التصوير الخلية الحية من CD4 + TH1 الخلايا اللمفاوية (DIC، يسار) التفاعل مع البطانة المشترك، معربا عن غشاء YFP (الأخضر) وقابل للذوبان عصاري خلوي DsRed (الحمراء)، ومحملة تبلد الموافق الشكل 2D. وتظهر اللوحة اليمنى دمج من مدينة دبي للإنترنت، غشاء السيتوبلازم والإشارات. الإشارات مجتمعة من الغشاء ومضان حشوية تقرير بحساسية تشكيل وإعادة تشكيل متعددة ~ 0،2-1 الانغلافات سطح ميكرون النطاق (بودو يطبع) التي تنتج عن المصفوفات T خلية التحقيق مع نتوءات ILP. الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    عموما، يصف هذا البروتوكول أساليب التحقيق الخلايا البطانية وأنا) الكافي في ناقلة جنود مصفحة الفسيولوجية والثاني) كنوع من رواية 'مستو نموذج APC الخلوي. وفيما يتعلق السابق، فقد أصبح موضع تقدير على نحو متزايد أن ناقلات الجنود المدرعة غير لدم الطرفية (أو اللحمية ') تلعب أدوارا حاسمة، غير المكرر (أي مقارنة للدم ناقلات الجنود المدرعة) في تشكيل الاستجابات المناعية التكيفية 16-18. بين هؤلاء "شبه المحترفين ناقلات الجنود المدرعة، الأوعية الدموية والخلايا البطانية اللمفاوية (التي يفوق عدد كبير المهنية ناقلات الجنود المدرعة) هي من بين أفضل تقدير 16-18. ومع ذلك، فإن تفاصيل يشير الأحداث ونقاط الاشتباك العصبي المناعية بالإضافة بهم لا تزال لم يتم التحقيق فيها إلى حد كبير. الطرق الموضحة في هذه الوثيقة تشكل أساسا للنهوض تفاهم في هذا المجال الناشئة. على سبيل المثال، تطبيق هذه المناهج لدراسة محطة الفضاء الدولية التي شكلت في البطانية من الأنسجة المختلفة التي من المعروف أنها يواجه adaptiv متميزةه وظيفة مناعية (مثل الكبد وبطائن اللمفاوي) قد يكون من المفيد بشكل خاص.

    إلى حد كبير، ويساعد هذا الأسلوب لردم الهوة بين ناقلات الجنود المدرعة المهنية والصناعية نماذج الركيزة APC من أجل تعزيز القدرة على استجواب الآليات الأساسية من الاستجابات المناعية التكيفية. في حين ركائز مستو APC (أي طبقات ثنائية الدهون، والألياف الزجاجية المطلية الضد) توفير التصوير الأمثل (مما أدى إلى العديد من الأفكار الهامة 7،11-14)، مثل هذه النماذج محدودة بطبيعتها. بدلا من ذلك، تفاصيل الفسيولوجية ديناميات المسح خلية خلية وحتى الآن تم حجب بعمق القضايا التصوير ذات الصلة التوجه 8-10. قدرات التصوير المنصوص عليها في النهج الحالي التغلب على هذه العقبة لكشف فريد لا يمكن اكتشافها إلا العمارة التحت خلوية ثلاثية الأبعاد وإعادة عرض سريع واجهة الخلية APC-T الفسيولوجية. هذه العرض إمكانية فهم جديد لsignalin الأنتيجينز.

    على سبيل المثال، والتقدير أن خلايا T تشكل ILPs المخصب مع TCR، الأكتين والجزيئات يشير (على سبيل المثال، الشكل 2D، الشكل 3)، تشير إلى أن هذه المرجح تمثل فيزيولوجي لاحظت أجزاء العداد 3-الأبعاد إلى TCR مستو يشير مجموعات صغيرة على الاصطناعي APC ركائز 6،7،12-14،29-31. يعني هذا أنه في ظل إعدادات الفسيولوجية، الخلايا الليمفاوية قد تستخدم ILPs كما منفصلة التحت خلوية 'وحدات التخزين رد فعل 3D' مع 'مثل signalosome' الخصائص التي تضخيم والحفاظ يشير من خلال التركيز جزيئات هامة أنشطة / 32،33. بالإضافة إلى ذلك، فإن وجود مدخلات النشاط الحيوي كبيرة (أي خلية خلية تطبيق القوة) في مشاهد إذا ILP نتوء ضد APC يمكن الاستدلال على ذلك من التصوير. هذا هو غير بديهي كما ينظر القوى الميكانيكية على نحو متزايد مع الميسرين الحرجة من الإشارات المستضدات، في حين وجه التحديد كيف يمكن لهذه القوات هيلا يزال يتجلى واضحا 14،34-37.

    ويدعم أهمية الشاملة لهذا النموذج كبديل معقول لالمهنية ناقلات الجنود المدرعة التي كتبها مظاهرة لدينا المباشرة التي صفائف ILP مماثلة يمكن أن ينظر إليه في نقاط الاشتباك العصبي تشكلت على ECS والبلدان النامية (وإلى حد أقل خلايا B) عندما كانوا يعملون النهج التصوير مماثلة (على سبيل المثال واستخدام صناع مضان نفسها والسيطرة على الطائرة التوجه الطائرة 19). ومع ذلك، فإنه يحتاج إلى أن ينظر في خصائص النشاط الحيوي النسبية EC مقابل المهنية APC أسطح الأغشية غير معروفة وان الخلافات في هذه المعلمة قد يؤثر تفاصيل IS طوبولوجيا والردود المستضدات.

    مفتاح النهج الموصوفة هنا يرتبط بقوة في الاستحقاقات قرارها. وهذا بدوره هو ذات الصلة للغاية لقوة الإشارة مضان. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان أن تولي اهتماما خاصا في تحقيق الاستفادة المثلى ترنسفكأيشن وتلطيخ للfluoresللصحفيين المائة والمعلمات التصوير / تقنية (على سبيل المثال، وقت التعرض، التركيز، الخ ...). وفيما يتعلق السابق، وبروتوكول للدراسات الخلية الحية التي الموصوفة هنا تقتصر على ترنسفكأيشن من غشاء عام وعلامات حشوية أن الإبلاغ عن التغييرات الطوبوغرافية في واجهة T خلايا APC في الوقت الحقيقي (على سبيل المثال، الشكل 2، أفلام 1، 2). بالإضافة إلى ذلك، هذا البروتوكول يمكن تعديلها بسهولة للتحليل أكثر تطورا من خلال إدخال متزامنة / التصوير مزيد صحفيين في البطانة (على سبيل المثال، فلوري MHCI / II والتصاق، والجزيئات وأجهزة الاستشعار المشارك المحفزة المشارك المثبطة للانزعاج والنشاط الحيوي الموسومة البروتين ديناميات). للأسف، بيد أن محدودية العام هو أن الخلايا الليمفاوية ومن المعروف صعبة ل transfect. هذا ما يحول دون استخدام مريحة من البروتينات الفلورية (على سبيل المثال، الموسومة إلى TCR، PKC-Q، الخ) في خلايا T للتصوير الخلايا الحية.

    بينماالبروتوكول الحالي ينطوي على تفعيل المستجيب الإنسان / ذاكرة CD4 + TH1 نوع الخلايا الليمفاوية من خلال تبلد (النموذج المستخدم على نطاق واسع)، وتوجد إمكانيات أوسع من ذلك بكثير. كما هو موضح سابقا 19،20 هذا النهج هو قابلية للتكيف مع مجموعة واسعة من الإعدادات الأخرى مثل ردود CD4 + أخرى فرعية وتفعيل CD8 + ردود قتل الخلايا اللمفاوية. من خلال عزل الخلايا الليمفاوية والخلايا البطانية من سلالات TCR المعدلة وراثيا الموجودة هذا الأسلوب هو أيضا أكثر قابلية للتكيف لدراسة الردود على مستضدات الببتيد محددة 19،20. وأخيرا، فإن النهج الحالي يقتصر على فحص خلايا T المستجيب / الذاكرة. ومع ذلك، ترنسفكأيشن من الخلايا البطانية مع جزيئات شارك في تنشيطية الأساسية (CD80 / 86، لا يعبر عنها عادة على البطانة) قد يسمح لدراسة ساذجة ديناميات فتيلة الخلية في هذا النموذج.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BD Vacutainer stretch latex free tourniquet BD Biosciences 367203
    BD alcohol swabs BD Biosciences 326895
    BD Vacutainer Safety-Lok BD Biosciences 367861 K2 EDTA
    BD Vacutainer Push Button Blood Collection Set BD Biosciences 367335
    RPMI-1640 Sigma-Aldrich R8758-1L
    Ficoll-Paque Sigma-Aldrich GE17-1440-02 Bring to RT before use
    FCS-Optima Atlanta Biologics s12450 Heat inactivated
    Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4458-100ML
    Trypan blue Sigma-Aldrich T8154-20ML
    staphylococcal enterotoxin B Toxin Technology BT202RED Stock solution 1mg/ml in PBS
    toxic shock syndrome toxin 1 Toxin Technology TT606RED Stock solution 1mg/ml in PBS
    human IL-15 R&D Systems 247-IL-025 Stock solution 50ug/ml in PBS
    PBS Life Technologies 10010-049
    Fibronectin Life Technologies 33016-015 Stock solution 1mg/ml in H20
    HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells Lonza CC-2543 Other Human Microvascular ECs can be used, i.e. HLMVECs
    EGM-2 MV bullet kit Lonza CC-3202
    Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T-4174 Stock solution 10x, dilute in PBS
    amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit Lonza vpb1003 Required Kit for step 4
    IFN-g Sigma-Aldrich I3265 Stock solution 1mg/ml in H20
    TNF-alpha 10ug, human Life Technologies PHC3015 Stock solution 1mg/ml in H20
    phenol Red-free HBSS Life Technologies 14175-103
    Hepes Fisher Scientific BP299-100
    Calcium Chloride Sigma-Aldrich C1016-100G Stock solution 1M in H20
    Magnesium chloride Sigma-Aldrich 208337 Stock solution 1M in H20
    Human Serum albumin Sigma-Aldrich A6909-10ml
    Immersol 518 F fluorescence free Immersion oil Fisher Scientific 12-624-66A
    Fura-2 AM 20x50ug Life Technologies F1221 Stock solution 1mM in DMSO
    pEYFP-Mem (Mem-YFP) Clontech 6917-1
    pDsRed-Monomer (Soluble Cytoplasmic DsRed) Clontech 632466
    pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed) Clontech 632512
    pEGFP-Actin Clontech 6116-1
    Alexa Fluor 488 Phalloidin Life Technologies A12379
    Formaldehyde solution 37% Fisher Scientific BP531-500 Toxic, use fumehood
    Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-5ML
     Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-70C
    Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-49A 
    Falcon Tissue Culture Treated Flasks T25 Fisher Scientific 10-126-9
     Falcon Tissue Culture Treated Flasks T75 Fisher Scientific   13-680-65
     Corning Cell Culture Treated T175 Fisher Scientific 10-126-61 
    Glass coverslips  Fisher Scientific 12-545-85  12 mm diameter
     Falcon Tissue Culture Plates 24-well Fisher Scientific 08-772-1
    Delta-T plates Bioptechs 04200415B
    Wheaton Disposable Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-8D
    1.5 ml Eppendorf tube  Fisher Scientific 05-402-25
     ICAM1 mouse anti-human BD Biosciences 555509
    HS1 mouse anti-human BD Biosciences 610541
    Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Purified ebioscience BMS102
    Anti-Human CD3 Alexa Fluor® 488 ebioscience 53-0037-41
    Anti-MHC Class II antibody  Abcam ab55152
    Anti-Talin 1 antibody Abcam ab71333
    Anti-PKC theta antibody  Abcam ab109481
    phosphotyrosine (4G10 Platinum) Millipore 50-171-463
    Nucleofector II Amaxa Biosystems Required electroporator for step 4
    Zeiss Axiovert Carl Zeiss MicroImaging
    Zeiss LSM510  Carl Zeiss MicroImaging
    Zeiss Axiovison Software Carl Zeiss MicroImaging
    NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet NuAIRE Nu-425-600
     Forma STRCYCLE 37 °C, 5% CO2 Cell culture Incubator Fisher Scientific 202370
    Centrifuge 5810 Eppendorf EW-02570-02
    Hemocytometer Sigma-Aldrich  Z359629 Bright-Line Hemocytometer
    Isotemp Waterbath model 202 Fisher Scientific 15-462-2

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-cell function and migration. Two sides of the same coin. N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).
    2. Springer, T. A. Adhesion receptors of the immune system. Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).
    3. Shaw, A. S., Dustin, M. L. Making the T cell receptor go the distance: a topological view of T cell activation. Immunity. 6 (4), 361-369 (1997).
    4. Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
    5. Delon, J., Stoll, S., Germain, R. N. Imaging of T-cell interactions with antigen presenting cells in culture and in intact lymphoid tissue. Immunol Rev. 189, 51-63 (2002).
    6. Brossard, C., et al. Multifocal structure of the T cell - dendritic cell synapse. Eur J Immunol. 35 (6), 1741-1753 (2005).
    7. Dustin, M. L. The cellular context of T cell signaling. Immunity. 30 (4), 482-492 (2009).
    8. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
    9. Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J Cell Sci. 123, 309-320 (2010).
    10. Oddos, S., et al. High-speed high-resolution imaging of intercellular immune synapses using optical tweezers. Biophys J. 95 (10), L66-L68 (2008).
    11. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
    12. Bunnell, S. C., et al. T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies. J Cell Biol. 158 (7), 1263-1275 (2002).
    13. Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
    14. Seminario, M. C., Bunnell, S. C. Signal initiation in T-cell receptor microclusters. Immunol Rev. 221, 90-106 (2008).
    15. Dustin, M. L. Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies. J Struct Biol. 168 (1), 152-160 (2009).
    16. Martinelli, R., Carman, C. V. Lymphocyte Endothelilal Interactions. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. , Elsevier. London. (2015).
    17. Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T lymphocyte-endothelial cell interactions. Annu Rev Immunol. 22, 683-709 (2004).
    18. Marelli-Berg, F. M., Jarmin, S. J. Antigen presentation by the endothelium: a green light for antigen-specific T cell trafficking? Immunol Lett. 93 (2-3), 109-113 (2004).
    19. Sage, P. T., et al. Antigen recognition is facilitated by invadosome-like protrusions formed by memory/effector T cells. J Immunol. 188 (8), 3686-3699 (2012).
    20. Kumari, S., et al. Actin foci facilitate activation of the phospholipase C-gama in primary T lymphocytes via the WASP pathway . eLife. , (2015).
    21. Marelli-Berg, F. M., et al. Major histocompatibility complex class II-expressing endothelial cells induce allospecific nonresponsiveness in naive T cells. J Exp Med. 183 (4), 1603-1612 (1996).
    22. Ma, W., Pober, J. S. Human endothelial cells effectively costimulate cytokine production by, but not differentiation of, naive CD4+ T cells. J Immunol. 161 (5), 2158-2167 (1998).
    23. Perez, V. L., Henault, L., Lichtman, A. H. Endothelial antigen presentation: stimulation of previously activated but not naive TCR-transgenic mouse T cells. Cell Immunol. 189 (1), 31-40 (1998).
    24. Epperson, D. E., Pober, J. S. Antigen-presenting function of human endothelial cells. Direct activation of resting CD8 T cells. J Immunol. 153 (12), 5402-5412 (1994).
    25. Shiao, S. L., et al. Human effector memory CD4+ T cells directly recognize allogeneic endothelial cells in vitro and in vivo. J Immunol. 179 (7), 4397-4404 (2007).
    26. Marelli-Berg, F. M., Okkenhaug, K., Mirenda, V. A two-signal model for T cell trafficking. Trends Immunol. 28 (6), 267-273 (2007).
    27. Carman, C. V., et al. Transcellular diapedesis is initiated by invasive podosomes. Immunity. 26 (6), 784-797 (2007).
    28. Carman, C. V. Mechanisms for transcellular diapedesis: probing and pathfinding by 'invadosome-like protrusions'. J Cell Sci. 122 ((Pt 17)), 3025-3035 (2009).
    29. Dustin, M. L., Tseng, S. Y., Varma, R., Campi, G. T. T cell-dendritic cell immunological synapses. Curr Opin Immunol. 18 (4), 512-516 (2006).
    30. Saito, T., Yokosuka, T. Immunological synapse and microclusters: the site for recognition and activation of T cells. Curr Opin Immunol. 18 (3), 305-313 (2006).
    31. Gomez, T. S., et al. HS1 functions as an essential actin-regulatory adaptor protein at the immune synapse. Immunity. 24 (6), 741-752 (2006).
    32. Burbach, B. J., Medeiros, R. B., Mueller, K. L., Shimizu, Y. T-cell receptor signaling to integrins. Immunol Rev. 218, 65-81 (2007).
    33. Vicente-Manzanares, M., Sanchez-Madrid, F. Role of the cytoskeleton during leukocyte responses. Nat Rev Immunol. 4 (2), 110-122 (2004).
    34. Ma, Z., Janmey, P. A., Finkel, T. H. The receptor deformation model of TCR triggering. Faseb J. 22 (4), 1002-1008 (2008).
    35. Ma, Z., Sharp, K. A., Janmey, P. A., Finkel, T. H. Surface-anchored monomeric agonist pMHCs alone trigger TCR with high sensitivity. PLoS Biol. 6 (2), e43 (2008).
    36. Groves, J. T. Bending mechanics and molecular organization in biological membranes. Annu Rev Phys Chem. 58, 697-717 (2007).
    37. Xu, C., et al. Regulation of T cell receptor activation by dynamic membrane binding of the CD3epsilon cytoplasmic tyrosine-based motif. Cell. 135 (4), 702-713 (2008).

    Tags

    علم المناعة، العدد 106، المشبك المناعي، T مستقبلات الخلايا، معقد التوافق النسيجي الرئيسي، اللمفاويات، خلية مقدمة للمستضد، البطانة، مما يشير إلى والكالسيوم والأكتين، والتصوير، والحصانة على التكيف، والهجرة
    نموذج الخلايا البطانية مستو التصوير المناعية سنبس حيوية
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Martinelli, R., Carman, C. V. An… More

    Martinelli, R., Carman, C. V. An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics. J. Vis. Exp. (106), e53288, doi:10.3791/53288 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter