Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunologisk Synapse Dynamics

Published: December 24, 2015 doi: 10.3791/53288
Automatic Translation
1, 1
1Department of Medicine, Harvard Medical School - BIDMC

Abstract

Adaptiv immunitet er reguleret af dynamiske interaktioner mellem T-celler og antigen-præsenterende celler (APC'er) benævnt »immunologiske synapser«. Inden for disse intime celle-celle grænseflader diskrete sub-cellulære klynger af MHC / Ag-TCR, F-actin, vedhæftning og signalmolekyler dannes og remodel hurtigt. Disse dynamikker menes at være kritiske determinanter for både effektiviteten og kvaliteten af ​​de immunreaktioner, der udvikler og derfor beskyttende versus patologisk immunitet. Nuværende forståelse af immunologiske synapser med fysiologisk APC'er er begrænset af den utilstrækkelige opnåelige imaging opløsning. Selvom kunstigt substrat modeller (f.eks plane lipiddobbeltlag) tilbyder fremragende opløsning og har været yderst værdifulde værktøjer, er de i sagens natur ikke-fysiologiske og forsimplede. Vaskulære og lymfeendotelceller er dukket op som en vigtig perifere væv (eller stromale) rum af 'semi-professional APC'erne «. Disse APC'er (som udtrykker det meste af molekylære maskineri professionelle APC'er) har den unikke egenskab at danne næsten plane celleoverfladen og er let transficerbare (f.eks med fluorescerende protein reportere). Heri en grundlæggende tilgang til at gennemføre endothelceller som en roman og fysiologisk 'plane cellulære APC model "for forbedret billeddannelse og forhør af fundamentale antigene signaleringsprocesser blive beskrevet.

Introduction

T-lymfocytter er en gren af det adaptive immunsystem kendetegnet ved evnen til effektivt at genkende peptidantigen (Ag) bundet til major histocompatibility complex (MHC) molekyler gennem deres T-cellereceptorer (TCR'er) 1. Naive lymfocytter konstitutivt migrere og scanne faglige Ag celler '(APC'er; f.eks dendritiske celler) inden lymfeknuder, mens hukommelsen / effektor T-celler har brug for effektivt at overskue en meget bred vifte af APC og potentielle målceller inden perifere væv.

I min efter første indregning af beslægtet Ag på en APC, lymfocytter arrestere deres migration og begynder at danne en specialiseret intim celle-celle-interface betegnes "immunologisk synapse" (IS). Vedvarende (dvs. 30-60 min) kontakter er forpligtet til at forstærke og fastholde signalering 2-7 IS. Nye undersøgelser identificere, at inden for IS, er den kontinuerlige dannelse og hurtig remodeling af diskrete sub-cellulær signalering mikro-klynger (dvs. indeholdende MHC / Ag-TCR, F-actin, vedhæftning og signalmolekyler), der bestemmer styrken og kvaliteten af resulterende immunreaktioner 2-7. Dog er dynamiske detaljer og reguleringsmekanisme af denne proces ufuldstændigt forstået 8,9. Dette skyldes i høj grad fra de tekniske udfordringer forbundet med uregelmæssige topologier af APC overflader og dårligt kontrolleret orientering af celle-celle interaktion fly, spørgsmål, dybt begrænser den nødvendige Spatiotemporal billeddannelse nærmer 8-10 (Figure1A).

Figur 1

Figur 1. Et Fysiologisk Planar Cell APC Model for Imaging Immunologisk Synapse Dynamics. Den skematiske illustrerer traditionelle billeddannelse af immunologisk synapser mellem en T-celle og en professio udg APC (A) og T-celle og en traditionel plane lipiddobbeltlag APC model (B) i forhold til denne nye endotel plane APC model (C). Professionelle APC'er giver fysiologiske immunologiske synapser men tilbyder dårligt orienteret celle-celle-grænseflade (dvs. med hensyn til den optimale xy afbildningsplanet, opløsning ~ 0,2 um), som dramatisk kompromitterer rumlige (z billedplanet opløsning ~ 1 um) og tidsmæssige (dvs. på grund af behovet for gentagne gange at scanne gennem alle z imaging fly) opløsning på billeddannelse. Dobbeltlag modeller har en plan topologi, der giver optimal Spatiotemporal billedbehandling opløsning, men er også meget forenklet, ikke-fysiologiske og stive. Denne endotelcelle model kombinerer den plane topologi lipiddobbeltlag med fysiologisk substrat af en klassisk APC til at levere en optimal rumlig og tidsmæssig opløsning billeddannelse i et fysiologisk miljø.m / filer / ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Tidligere arbejde har delvist omgås disse hindringer ved at udvikle plane modeller (dvs. lipiddobbeltlag og antistof-coatede overflader), som giver optimal spatiotemporale opløsning (dvs. via fastsættelse af T-celleaktivering overflade i en enkelt plan, der er parallelt med den optimale xy imaging fly) 11-15 (figur 1B). Disse modeller har lettet vigtig indsigt i de subcellulære / molekylær dynamik, der styrer antigen signalering i T-celler, herunder opdagelsen af dynamiske actin / TCR signalering mikro-klynger 7,11-14. Imidlertid er sådanne modeller iboende oversimplificeres, samt stive (hinder udvikling / studie af 3-dimensionelle topologiske træk) (figur 1B). Derfor er det fortsat usikkert, hvordan at relatere sådanne resultater til grafisiologic celle-celle immunovervågning.

Men stadig dublerede er vaskulære og lymfatiske endotelceller fremstår som en stor (dvs. større i antal end alle professionelle APC'er, ved ~ 1000 gange) perifere rum af 'semi-professionelle "APC'er 16-18. Disse celler udtrykker MHC-I-, II- MHC-og et væld af co-stimulator molekyler (f.eks CD40, LFA3, ICOSL, 4-1 BB, OX40L, TL1A, PD-L1, men ikke CD80 og CD86), og er strategisk placeret ved blod-vævsgrænsefladen hvor de tjener specialiserede sentinel funktioner 16-18. Tidligere undersøgelser viste, at endotelceller effektivt kan re-stimulere effektor / hukommelse, men ikke naive, T-celler 19-25. Således spiller sandsynligvis unikke APC roller i effektorfasen af adaptive immunresponser inden for de perifere væv, såsom lokal indflydelse på T-celleaktivering, differentiering, hukommelse og tolerance 16,17,26 endotelceller. Critisk, når der dyrkes in vitro, endotelceller danner næsten plane celleoverflader og er let transficerbare (f.eks med fluorescerende protein reportere). Disse funktioner er ideelle til høj Spatiotemporal opløsning billeddannelse af topologiske dynamik under celle-celle interaktioner 19,27. Således endotelceller kunne tjene som en fysiologisk 'plane cellulære APC' model udpræget egnet til undersøgelse af de subcellulære / molekylære mekanismer remodeling som driver antigen-genkendelse og regulerer responser (figur 1C) 19,20.

Tidligere konstaterede komplementære billeddannelsesteknikker (herunder transfektion af endotel celler med fluorescerende protein skaberne af plasmamembranen og cytosol) for at studere detaljerne i leukocyt-endotel interaktion under adhæsion og transendotelial migration 27, viste, at leukocytter aktivt sonde overfladen af endotel ved dynamisk indsættelse af end tilbagetrækning af sub-micron-skala, actin-rige cylindriske fremspring (200-1000 nm i diameter og dybde ~) betegnes invadosome-lignende fremspring (dvs. "ILPS ') 27,28. Disse billeddannende fremgangsmåder er blevet udvidet yderligere sammen med oprettelsen af protokoller for at drage fordel af endotel APC-funktion for at udvikle de første metoder til høj spatiotemporale opløsning billeddannelse af T-celle-endothelial immunologisk synapse som rapporteret 19,20 og beskriver endvidere heri. En central konklusion stammer fra denne roman plane cellulære APC-modellen er, at T-celle efterværn fungere både i at fremme indledende Ag detektion og fastholde efterfølgende signalering. Faktisk arrays af flere efterværn (der blev stabiliseret og påløbne som reaktion på indledende calciumflux) viser berigelse i TCR og molekyler, der tyder på aktiv signalering sådan PKC-Q, ZAP-70, phosphotyrosin og HS1. Derfor synes efterværn at repræsentere et tredimensionalt fysiologisk svarer til TCR-signalering mikroklynger set i plane dobbeltlag modeller. Denne tilgang, således følsomt afslører / rapporter molekylære og arkitektoniske (og underforståede biomekaniske) dynamik ellers ikke påvises.

Den her beskrevne metode bør være nyttige for at bygge bro mellem professionelle APC og kunstige APC substrat modeller for at forbedre vores evne til at afhøre grundlæggende mekanismer i adaptive immunrespons. Mens her er fokus på aktiveringen af CD4 + Th1-typen effektor / lagercelle, kan denne grundlæggende fremgangsmåde let modificeres til at studere en bred vifte af T-celle typer og Ags, som beskrevet nedenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøg er beskrevet i denne protokol udføres med primære humane T-celler og kommercielt tilgængelige primære humane endotelceller (dermal eller lunge mikrovaskulære EC'er) .Any forskningsprotokol med menneskelige forsøgspersoner skal godkendes af en institutionel gennemgang bord og skriftligt informeret samtykke skal gives fra hver bloddonor. Eksperimenter udført ved hjælp af denne protokol blev godkendt af IRB af Beth Israel Deaconess Medical Center.

1. fremstilling af human CD4 + Th1 effektor / Memory T-celler

  1. Påfør årepresse til armen af ​​donor, tørre vene med alkohol, og indsæt nålen. Træk langsomt 15 ml blod i Vacutainer hjælp EDTA som antikoagulant. Når blodet er blevet trukket, afbinde årepressen før du fjerner nålen. Gælder det samme pres for at sår med steril gaze, når nålen fjernes.
  2. Overfør blod til en 50 ml rør. Tilføj RPMI-1640 ved stuetemperatur i en 1: 1 fortynding (slutvolumen 30 ml). Overlay forsigtigt fortyndeded blod på to 50 ml rør indeholdende 15 ml af præ-filtreret lymfocytter isolation medium, såsom Ficoll-Paque ved stuetemperatur.
  3. Centrifugeres gradient ved stuetemperatur i 30 minutter ved 1200 xg i en svingende spand rotor. Mens centrifugering forberede T-celle medium (500 ml RPMI-1640, 50 ml FCS, 5 ml penicillin / streptomycin).
  4. Efter fjernelse af 50 ml rør fra centrifugen, observere fire lag: en pellet af røde blodlegemer i bunden er paque, et lag af celler, som indeholder hvide blodlegemer (herunder lymfocytter) og plasma. Fjern forsigtigt hvide blodlegemer lag med en Pasteur-pipette og overføres i et 50 ml Falcon-rør.
  5. Vask af hvide blodlegemer lag ved tilsætning af RT RPMI-1460 (op til 20 ml) og centrifugering ved stuetemperatur i 5 minutter ved 1200 x g. Resuspender de hvide blodlegemer i 1 ml T-celle-medium. Tilsæt 5 pi af 1 ml cellesuspension til 250 pi T-celle-medium i en 1,5 ml centrifugerør og blandes forsigtigt op og ned med pipette.
  6. 25 pi fortyndetd cellesuspension til 25 pi 0,4% Trypan blå. Tilsæt 10 pi blandingen til hver side af en standard hæmocytometer.
  7. Placer hæmocytometer på et lavt strømforbrug lysmikroskop. Ved hjælp af en 10X mål tælle antallet af levende celler, som har udelukket trypanblåt farvestof og er til stede i det midterste kvadrat til begge sider af hæmocytometeret.
  8. At beregne cellekoncentrationen, multipliceres gennemsnittet af de 2 kvadrater med 100 (fortyndingsfaktor) og derefter gange med 10 4 for at give antallet af celler / ml.
  9. Juster slutkoncentration på 0,5 x 10 6 celler / ml i T-celle-medium. Tilføj en slutkoncentration på 1 ug / ml af hver af bakterielle superantigener stafylokok-enterotoksin B (SEB) og toksisk shock-syndrom-toksin 1 (TSST) til cellerne. Kultur i 72 timer (37 ° C og 5% CO2) for at udvide CD4 + T-celle population.
  10. Pellet T-celler (1.200 xg 5 min) og resuspender 0.5 x 10 6 celler / ml i T-celle-medium medtilsætning af human IL-15 (20 ng / ml). Overførsel lymfocytter til en T150 kolbe. Fortsæt med at udvide / split celler i fuldt medium-IL-15 hver 24-48 timer efter behov (baseret på medier farve, dvs, når medier vender sig fra lyserød til svagt gul) derefter. Bevar den resulterende lymfocytpopulationen i op til 15 dage.
    BEMÆRK: Ved design, vil denne protokol aktivere og udvide specifikt undersæt af CD4 + -T-celler, som er reaktive til SEB og TSST og derefter drive dem mod en Th1-lignende effektor / memory fænotype. Andre hvide blodlegemer undlader at overleve og vokse under disse betingelser, således at trin 1.10 cellerne vil være mindst 95% CD4 +, CD45RO + -T-celler 19, som let kan vurderes ved flowcytometri. Hvis det ønskes, kan yderligere oprensning let opnås ved kommercielt tilgængeligt antistof / magnetiske perle-baserede positive eller negative udvælgelse kits.

2. Fra Primær humane endotelceller Cellekultur

<ol>
  • Coat en T25 kolbe med fibronectin (FN) 20 ug / ml i PBS i sterile betingelser. Efterlad ved stuetemperatur i 30-60 min. Fjern FN og tilsæt 5 ml komplet medium (Endotel Basal Medium (EBM-2) medium suppleret med Endothelial vækstmedium (EGM-2) singlequots). Præinkuberes i 37   ° C cellekultur inkubator i mindst 30 minutter.
  • Optø et hætteglas med frosne human lunge eller dermal mikrovaskulære endotelceller (HLMVECs eller HDMVECs) i et 37 ° C vandbad med lejlighedsvis forsigtig omrøring i -2-3 min. Umiddelbart overføre cellerne til T25 kolbe indeholdende foropvarmet medier. Forsigtigt hvirvle og plads i inkubator ved 37 ° C.
  • Skift medierne efter ~ 4-6 time. Fortsæt med at ændre medierne ca. hver 48 timer (eller når mediet bliver let gul), indtil pladen når ~ 90-95% konfluens.

    • 3. Generelle Opdeling og Udvidelse af endothelceller

    1. Grow celler til ~ 90-95 konfluens. Dette kan tage 2-5 dage. Til opdeling,fjern mediet og skyl med PBS. Fjern PBS og erstatte med et minimum volumen af ​​frisk 1x trypsin (0,5 ml til T25 eller 1,5 ml til T75). Forsigtigt hvirvle at dække alle overflade med trypsin. Der inkuberes ved 37 ° C for ~ 5 min. Overvåg udstationering af cellerne fra pladen ved hjælp af en lav effekt lysmikroskop.
    2. Når størstedelen af celler synes afrundet eller fritstående, tilsættes 5 volumen (dvs. i forhold til trypsin volumen tilsat) forvarmet komplet EGM-2 medium og forsigtigt pipetteres over overfladen af kolben for at frigøre alle celler.
    3. Tæl endotelceller med et hæmocytometer som beskrevet i 1,6-1,7. Pelletere cellerne ved centrifugering (5 min, 1200 xg). Supernatanten fjernes. Juster fusions 0,5 millioner celler pr ml ved tilsætning af forvarmet komplet EGM-2 MV medier.
    4. Overfør celledelprøver til de relevante FN-overtrukne skåle eller kolber til vedligeholdelse. Forsigtigt hvirvle og placere i inkubatoren. Skift medierne inden 6-12 timer af plating. Media shoULD ændres cirka hver 48 timer derefter.

    4. endothelial celletransfektion

    BEMÆRK: Primær endotelceller er refraktære over for transfektion af de fleste fælles kemiske og elektroporation metoder. Beskrevet nedenfor den nukleare transfektion-baserede metode muliggør relativt høj transfektionseffektivitet (~ 50-70%). Et effektivt alternativ metode er brug af infektion med egnede virale vektorer (se kommentarer i Materials tabel).

    1. Forbered T25 eller T75 kolber (efter behov) af HLMVECs eller HDMVECs til en endelig densitet på 90-95% confluency.Coat med fibronectin (FN) 20 ug / ml i PBS i sterile betingelser enten mikroskop dyrkningsplader såsom Delta-T plader (for trin 5) eller 12 mm cirkulære dækglas placeret i en brønd i en 24-brønds celledyrkningsplade (for trin 6) med som beskrevet ovenfor (2.1).
    2. Tilsæt 1 ml komplet EGM-2 dyrkningsmedier til mikroskop kultur platesor 0,5 ml til hver 24 godt og ligevægt plader ien befugtet 37 ° C / 5% CO2-inkubator.
    3. Høst og tæller endotelceller som i trin 3.1-3.3.Centrifuge den nødvendige mængde celler (0,5 millioner celler pr prøve) ved 1200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Resuspender cellepelleten forsigtigt i 100 pi RT nuklear transfektionsopløsning per prøve.
    4. Kombiner 100 pi cellesuspension med 1-5 ug DNA. Overfør celle / DNA suspensionen i certificeret kuvette; Prøven skal dække bunden af ​​kuvetten uden luftbobler.
      BEMÆRK: Konstruktioner målrettet YFP eller DsRed til cellemembranen (gennem de N-terminale 20 aminosyrer af neuromodulin som indeholder et signal for posttranslationel palmitoylering) blev anvendt alene (membran-YFP alene eller membran-DsRed alene) eller cotransficeret med en cytoplasmatisk volumetrisk markør (f.eks membran-YFP og opløseligt DsRed). Mange permutationer af fluorescerende protein markører kan benyttes.
    5. Luk kuvetten med hætten. Isæt kuvetten medcelle / DNA suspension i kuvetteholderen af ​​elektroporator og anvende elektroporation programmet S-005. Tag en kuvette ud af holderen, når programmet er afsluttet.
    6. Tilføj ~ 500 pi præ-ækvilibreret dyrkningsmedier til kuvetten og fjern forsigtigt cellesuspensionen fra kuvetten ved hjælp af plast overførselspipetter fastsat i den nukleare transfektion kit.
    7. For forsøg med mikroskop dyrkningsplader partitionere cellesuspensionen fra en reaktion ligeligt mellem to skåle indeholdende forvarmet medier (trin 4,2-4,3). Til forsøg under anvendelse af 24 brønd / plade, partition én reaktion ligeligt mellem 3 brønde.
    8. Inkubér cellerne i en befugtet 37 ° C / 5% CO2-inkubator og ændre mediet 4-6 timer, og igen ved 12-16 timer efter transfektion.

    5. Levende Cell Imaging og analyse

    1. Forberedelse Endothelium
      1. Dag 0: Co-transfektion primære HLMVECs med membran-YFP og opløselig DsRed via en nucleofeIndsatsen teknologi som beskrevet i trin 4 og pladen oven på live-cell imaging dyrkningsplader.
      2. Dag 1: Erstat medium med frisk medium indeholdende IFN-γ (100 ng / ml) for at inducere MHC-II-ekspression. På dag 2. Stimulering transficerede celler ved tilsætning af 20 ng / ml TNF-α til eksisterende medier.
      3. På dag 3, inkuberes endotelet med 1 ug / ml af hver af bakterielle superantigener stafylokok-enterotoksin B (SEB) og toksisk shock-syndrom-toksin 1 (TSST) ved 37 ° C i 30-60 min umiddelbart før forsøg. Udelad dette trin for 'Ag kontrolsystemer betingelser.
    2. Forberedelse Lymfocytter
      1. Sideløbende med trin 5.1.3, forberede Buffer A (phenolrødt-frit HBSS) suppleret med 20 mM Hepes, pH 7,4 og 0,5% v / v human serumalbumin pre-opvarmet til 37 ° C. Tage en prøve af dyrkede lymfocytter og bestemme densiteten ved at tælle med et hæmocytometer (trin 1,12-1,17).
      2. Centrifuger 2 millioner celler pr prøve på 1,200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur i en 15 ml konisk rør. Aspirer medier og forsigtigt resuspender cellepelleten i 2 ml puffer A, således at ingen celleklynger tilbage.
      3. Fjern en frisk portion af Fura-2 calcium farvestof og resuspender i DMSO for at gøre en stamkoncentration på 1 mM.
      4. Tilsæt 2 pi Fura-2 stamopløsning til T-celle-suspension (2 uM slutkoncentration), cap røret og bland straks ved at vende røret for at sikre en jævn dispersion af farvestof. Der inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter.
      5. Centrifugeres som i trin 5.2.2. Aspirer Buffer-A og forsigtigt, men grundigt resuspender lymfocytter i 20-40 pi frisk puffer-A.
    3. Live-cell Imaging opsætning og Acquisition
      BEMÆRK: En bred vifte af systemer kan anvendes til live-cell fluorescensimagografi på opretstående og omvendte lys mikroskoper. Grundlæggende krav omfatter en fluorescens lyskilde og filtre, et CCD-kamera, motoriseret filter skift og skodder, et opvarmet etape (eller MicroscOPE-monterbar opvarmet kammer) og software til billedoptagelse automatiseret. Til denne protokol høj numerisk blænde, høj forstørrelse (dvs. 40X, 63x) olie nedsænkning linser er nødvendige for at opnå den nødvendige rumlige opløsning. Særlig omhu skal tages i valget af egnede fluorescens kilden og linser til Fura-2-baserede calcium billeddannelse, da ikke alle er kompatible med de nødvendige 340/380 nm excitationsbølgelængder. En alternativ fremgangsmåde (kompatibel med standard grønne og røde fluorescens filtersæt) kan anvendes med ikke-ratiomentic calcium-sensitive farvestoffer (f.eks Fluo-4, Rhod-3), selvom disse ikke kan præcist at kvantificere calciumflux og kun give en relativ / kvantitative udlæsning.
      1. Tænd mikroskopsystem (PC til drift, mikroskop, CCD-kamera, filterhjul og xenon lampe).
      2. Åbn udpeget software.
      3. Opsæt mikroskop / software til automatiseret multikanal time-lapse billeddannelse. Medtag sekventiel erhvervelse af annonceifferential kontrast interferens (DIC), standard grøn fluorescens, standard røde fluorescerer og standard 340 og 380 nm excitation Fura-2 billeder. Indstil intervallet for erhvervelse til 10-30 sek og en samlet varighed på ~ 20-60 min.
        1. Indstil eksponeringstider for Fura-2 billeddannelse.
          1. Tilføj ny målsætning olie og montere et mikroskop parabol, der kun indeholder 0,5 ml buffer-A på varme- bordadapteren og straks tænde afbalancere til 37 ° C (vil tage -2-3 min).
          2. Tilføj hvilende fura2-fyldte lymfocytter til den monterede mikroskop skålen kammeret under anvendelse af en 20 pi pipette.
          3. Tænd lyse felt billeddannelse. Vælg strålegangen til okularerne. Brug den grove fokus knop at bringe målsætningen i kontakt med bunden af ​​miscoscope parabol. Brug okularet og den fine fokus knappen for at fokusere på de T-celler afregnet på bunden af ​​skålen.
          4. Brug XY-scene kontroller at vælge et felt indeholdende mindst 10 celler. Undgåoverfyldte felter og celleklumper da disse vil skabe billeddannelse artefakter.
          5. Skift fra lyse felt til fluorescerende lyskilde. Skift fra okular billedbehandling til CCD-kamera. Indstil erhvervelse parametre (f.eks eksponeringstid, detektor gain og udsmidningen). Brug af softwaren erhverve hvilende Fura2-340 og Fura2-380 billeder (begyndende med identiske eksponeringstid for hver, sædvanligvis i området på ~ 200-1000 ms).
          6. Brug fremgangsmåderne beskrevet i trin 5.4.1 at beregne Fura2-340 / Fura2-380 for hver lymfocyt. Udfør gentagne iterationer af justere Fura2-340 og Fura2-380 eksponeringstid, erhverve billeder og beregne nøgletal, indtil de gennemsnitlige værdier er tæt på 1.
        2. Indstil eksponeringstider for mem-YFP og DsRed.
          1. Udskift mikroskopet fad anvendt i trin 5.3.3.1 med en miscroscope skål indeholdende transfekteret, aktiveret og SAG behandlet (eller ubehandlet, kontrol) HLMVECs eller HDMVECs fra cellekultur inkubator (trin 4.5.1). Brug en engangs overførselspipetten til hurtigt fjerne mediet, skylles én gang ved tilsætning af ~ 1 ml forvarmet Buffer-A. Aspirer og derefter tilføje 0,5 ml buffer-A.
          2. Identificer områder, hvor lyst fluorescerende positive transfektante endotelceller er til stede og forekommer sunde med velformede intercellulære vejkryds.
          3. Juster erhvervelse parametre (f.eks eksponeringstid, detektor gain og udsmidningen) for mem-YFP og DsRed. Vær sikker på, at middelfluorescens signalintensitet i hver kanal er mellem 25% og 75% af det dynamiske område af detektoren.
      4. Gennemføre live-cell imaging eksperiment.
        1. Brug automatiseret software til at begynde billedet erhvervelse og fange flere intervaller på billederne for at etablere baseline.
        2. Under erhvervelsen anvendelse ~ 5 pi koncentrerede Fura-2-loaded lymfocytter (fra trin 5.2) til centrum af mikroskopet skålen felt billeddannelse ved at indsætte spidsen af ​​et lille volumen (P-5eller P-20) pipette ind i medierne tæt på centrum af målet og skubbe langsomt.
        3. Som lymfocytter bosætte sig i den billeddannende felt, gør fine justeringer i fokus at sikre, at T-celle-endotel celle-interface (immunologiske synapser) fastholdes i brændplanet. Med 40 og 63X mål, ~ 10-20 celler pr felt er optimale. Hvis færre celler i den billeddannende felt gentag trin 5.3.4.2.
        4. Efter at den ønskede observation interval eksperiment konkurrerede, fortsat billeddannelse og straks pipetteres ionomycin direkte i miscoscope skålen (ved hjælp af teknik som i 5.3.4.2) til en slutkoncentration på 2 uM til at inducere maksimal calciumflux / Fura-2 signaleringssignal (dvs. , et middel til kalibrering, se analyse 5.4.).
        5. Som et alternativ til 5.3.4.4after den ønskede observation interval eksperiment konkurrerede straks aspirere Buffer-A og erstatte det med 0,5 ml fikseringsopløsning (3,7% formaldehyd i PBS) i 5 minutter vedRT, efterfulgt af skylning tre gange med PBS. Fortsæt derefter til trin 6.
    4. Analyse af levende celler Imaging
      BEMÆRK: Efter at have gemt erhvervede filer, kan de analyseres direkte eller eksporteres til analyse af en lang række off-line billedanalyse software applikationer. ImageJ er en særlig værdifuld, meget alsidig pakke, der er frit tilgængelig og kompatibel med næsten alle købet softwarepakke. Udformningen af ​​de billeddannende beskrevne eksperimenter i trin 5,1-5,3 vil give høje rumlige og tidslige dynamik interaktioner mellem lymfocytter og endotel APC i fravær og tilstedeværelse af beslægtet SAg opløsning. Næsten ubegrænsede analyser er mulige, når man behandler billeddata af cellulære morfometrisk / signalering dynamik. De specifikke mål, der er beskrevet i dette særlige protokol skal sideordnet kvantificere lymfocytmigration og signaler (dvs. kinetik og niveauer af intracellulær calcium flux) sammen med dynamiskal ændringer i den immunologiske synapse arkitektur med fokus på særlige karakteristika (dvs. efterværn / PODO-prints). De følgende er eksempler på separat standard og ikke-standard (dvs. udviklet specielt til disse eksperimenter / spørgsmål) analyser.
      1. Mål Lymfocyt calciumflux
        1. Vælg de indledende Fura2-340 (340 nm EX-510 nm EM) og Fura2-380 (380 nm EX-510 nm EM) billeder, som er anskaffet før tilsætning af lymfocytter. Bruge disse som baggrundsbilleder og digitalt trække dem fra alle de billeder i tidsserien for de respektive kanal.
        2. For hvert tidspunkt skabe en digital forholdet billede af baggrundssubtraktion Fura2-340 og baggrundssubtraktion Fura2-380 billeder (dvs. 340 nm EX-510 nm EM-baggrund / 380 nm EX-510 nm EM-baggrund).
        3. Vælg den relevante software tegneværktøj. Klik på skærmen for at tegne et cirkulært område af interest (ROI) omkring hver lymfocyt. Disse vil generere en pixel-gennemsnit forholdet for hver lymfocyt- og tidsramme.
        4. Plot den beregnede forholdet som funktion af tid ved hjælp af et passende program (f.eks regneark). Beregn gennemsnit calcium flux til eksperimentet som summen forholdsværdierne af alle lymfocytterne hver mark og dividere denne værdi med det samlede antal af lymfocytter for hvert tidspunkt
      2. Gennemføre lympocyte migration sporing analyse.
        1. Analyser celle T cellemigrering ved anvendelse af en passende celle tracking software program (f.eks, ImageJ) under anvendelse af DIC kanal fra hver video. Brug ImageJ Cell Tracking Plugin, identificere i hver ramme det geometriske tyngdepunkt af hver celle manuelt ved at klikke på det i hvert progressiv ramme.
        2. Brug de resulterende seriel xy koordinater (dvs. spor af migrationsveje) til at beregne det gennemsnitlige hastighed (samlede distance migreret / total interval of billeddannelse) og tortuosity (total afstand migreret / den lineære ende-til-ende afstand mellem celle placering i det første og sidste billede).
        3. Cross-korrelere disse parametre med calcium flux (5.4.1) dynamik på en celle til celle-basis.
      3. Vurdere Podo-print / ILP Density inden IS
        1. Tæl samlede antal ILP dannet i hver T-celle er defineret intervaller (fx 5 minutter efter tilsætning af T-celler). Disse kan identificeres diskrete micron skala fluorescerende membran-YFP ringe, der co-lokalisere med mørke rande i cytoplasmatisk DsRed på endotel APC på et sted af lymfocyt vedhæftning.
        2. Cross-korrelere de resulterende »ILP indekser 'med calcium flux (5.4.1) dynamik på en celle til celle-basis.
      4. Mål Podo-print / ILP levetid.
        1. For hver Podo-print / ILP i en given IS beregne sine levetider som sidste gang punkt, når en ILP var synlig - det tidspunkt, hvor der Podo-print / ILP first dukkede op. Gennemsnitlig ILP levetider både pr IS.
        2. Cross-korrelere disse levetider med calcium flux (5.4.1) dynamik på en celle til celle-basis.
      5. Vurdere den tidsmæssige sammenhæng mellem indledende ILP dannelse og calcium flux.
        1. For hver lymfocyt identificerer tidspunkt (ramme), hvor calcium først hæver sig over baseline 19.
        2. For hver lymfocyt identificere tidspunkt, hvor den første Podo-print / ILP vises.
        3. For hver lymfocyt beregne en "offset tid" ved at subtrahere den oprindelige calciumflux tidspunkt fra den oprindelige Podo-print / ILP. Gennemsnittet af værdier for alle lymfocytter i et felt. Positive værdier angiver ILP dannelse forud calciumflux mens negative tal angiver det modsatte.
          BEMÆRK: Disse eksperimenter kan let udføres under fysiologisk relevant laminar shear flow anvendelse af kommercielt tilgængelige parallelle væg flow imaging kamre som beskrevet 19.

    6. Fast-celle Imaging og analyse

    1. Fast endepunkt T-celle-endotel IS dannelse og farvning
      1. Forbered T-celler som beskrevet i 1. Klargør endotelceller (- / + SAG) som i trin 5.1 (transfektion, trin 5.1.1 er valgfrit). Tag en prøve af dyrkede lymfocytter og bestemme tætheden ved at tælle med et hæmocytometer (afsnit 1).
      2. Overfør en lymfocytkultur volumen svarende til mindst 3 x 10 5 lymfocytter / prøve til en 15 ml konisk rør og centrifugeres ved 200 xg i 3 min. Fjern supernatanten og resuspender pellet lymfocyt i puffer-A (trin 5.2.1) koncentration på 6 x 10 5 lymfocytter / ml.
      3. Fjern endothelcellerne fra cellekulturen inkubatoren og (fortsætter én prøve ad gangen), indsuges medie og udskift med 0,5 ml lymfocytsuspension (3 x 10 5 lymfocytter / prøve) og erstatte 37 ° C incubator.
      4. Efter passende inkubationstider, nævnt ovenfor, aspireres medium fra brøndene og tilsæt tilstrækkeligt Fixative Solution (3,7% formaldehyd i PBS) til helt at dække prøven (fx i 24-brønds plade ~ 300-500 pi). Inkuber ved stuetemperatur i 5-10 min.
      5. Skyl prøven 3 gange med PBS. Farv ved tilsætning primært antistof i 60 minutter ved stuetemperatur (se listen). Hvis det primære antistof er rettet mod et intracellulært protein, der skal udføres ved at tilsætte en tilstrækkelig permeabilisering opløsning (0,01% Triton X-100 i PBS) til helt at dække prøven i 1 min ved stuetemperatur en yderligere permeabilisering trin. Skyl prøven 3 gange med PBS. Tilføj passende sekundære antistoffer (i nogle tilfælde samtidig fluorescerende phalloidin) i 60 minutter ved stuetemperatur.
      6. Monter cirkulære dækglas på en billeddannende dias. Fast endepunkt T-celle-endotel IS dannelse og farvning. Til at begynde billedbehandling sted den billeddannende slide indeholder prøver på mikroskopet scenen og vælg 63X olieobjektiv. Påfør frisk fordybelse olie.
    2. Brug lyse-feltet billedbehandlingstype og okulære linser til at finde brændplanet. Skift til epifluorescens og inspicere prøven via øjet linser. Vælg et interesseområde. Skift til laser-scanning-tilstand.
    3. Brug af fast-scan mode og arbejder i den bredest mulige felt individuel justering laserenergi og forstærkning for hver kanal for at optimere signal, således at ideelt set den specifikke signalintensiteten når mindst ~ 25% og højst 75% af det dynamiske område af detektorerne.
    4. Brug manuel fokus kontroller, hurtigt scanne gennem Z-aksen og identificere de øvre og nedre grænser for sektionering (typisk alle de oplysninger bør være indeholdt i en tykkelse på ~ 15 pm). Vælg Z-aksen snittykkelse i intervallet 0,2-1,0 um ~.
    5. Endelig zoom / beskære den billeddannende felt til den specifikke område af interesse og adfærd scanning. Ud over at have meget lyse og specifik fluorescens signal i prøven, erhverve høj opløsning 3D-billedbehandling kræver gentagelser af scanning og foretage justeringer af erhvervelse parametre. Målet er at opnå maksimal xy og z-aksen opløsning, uden nogen nævneværdig foto-blegning.
    6. Kvalitativt analysere topologi 3D topologi af IS ved at foretage digital 3D rekonstruktion af de resulterende optiske snit gennem et passende program (fx billede J). Gennem lignende applikationer kvantitativt vurdere fluorescenssignal distribution (f.eks Pearsons co-lokalisering og korrelationsmaalinger fluorescensintensitet line-scan analyse og retvinklede visning).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    En hidtil ukendt billeddannende tilgang med endothelceller og kombinere fordelene ved den plane lipiddobbeltlag model med fysiologisk kompleksitet og deformerbarhed af professionelle APC'er opløsning blev udviklet (Figur 1). Figur 2 giver eksempler på typiske migration, calciumflux og topologiske dynamik observeret med dette nærme sig. I mangel af SAg på endotel, Sag-specifikke CD4 + Th1 lymfocytter hurtigt spredt, polarisere og sideværts migrere over endoteloverfladen (figur 2A) uden flus calcium (ikke vist). Inden ~ 5-10 min disse lymfocyt indlede transmigration gennem endotelet. I nærvær af SAg indlades endotel lymfocytter spredt symmetrisk med en spejlæg 'topologi, indlede opretholdt (dvs. i 30-60 min) intracellulært calcium flux (Figur 2B; Movie 1), i hvilket tidsrum de udviserringe eller ingen migration (figur 2C).

    Figur 2
    Figur 2. live-cell Analyse af T-celleaktivering og migration og immunologiske Synapse topologi endotel APC'er. (A) paneler viser et eksempel på tidsserier billeddannelse af T-celle-migration på endotel i fravær af SAg. Øvre Panel viser DIC billeder. Udgangsstillingen for de vandrende T-celle er angivet ved den røde stiplede linie. Nedre panel viser invaginationer dannet på endotel ved migrationen T-cellen. Pile angiver dannelsen af ​​forbigående ringe (~ 0,5-1 um diameter) af membranen-YFP fluorescens dannet som et resultat af T-celle generering af 'invadosome-lignende fremspring «(ILPS) mod endotel APC overflade (se D). (B) viser et eksempel på en lignende serie i nærvær af SAg-loaded endotel (venstre; Se ogsåsvarende Movie 1) og kvantitative spor af de dynamiske ændringer i calcium niveauer (til højre). Pile indikerer indledende efterværn formation, der korrelerer med indledningen af ​​calcium flux (i) og efterfølgende stabilisering af flere efterværn, der korrelerer med højt calcium flux (ii). (C) Eksperimenter som i A og B blev underkastet cellesporing analyse. DIC billeder på venstre viser repræsentative T-celle migration stier over varigheden af ​​10 min (røde spor). Graf på højre viser de beregnede migration hastigheder i fravær og tilstedeværelse af synke. (D) Dynamisk analyse af immunologisk synapse topologi (modificeret fra 19). Skematisk (i) illustrerer en følsom endotelcelle / APC 'topologi reporter system «bestående af membran-målrettet-YFP og opløselig cytosolisk RFP. Actin-medieret ILP der rager ind endotelcelleoverfladen generere cylinderformede invaginationer (en type af cellulær mund- print, betegnet en "Podo-print ') giving anledning til skarpt bøjede membran, der vises som ringe af membran-fluorescens YFP (dvs. væggene i cylinderen på en face). Cytosol fordrivelse og udstødelse på disse loci vises som mørke cirkler af cytosolisk RFP. DIC og fluorescens billeder i (ii) viser et eksempel på en sådan analyse i nærværelse af SAG (Se også tilsvarende film 2). En enkelt indledende Podo-print / ILP udvikler sig til en vifte af> 20 stabiliseret efterværn løbet af 15 minutter. Blå boks i 15 min (iii) illustrerer en høj opløsning billede af en enkelt Podo-print / ILP hvorved en ring af membran-YFP overlapper et område af udelukket cytosolisk RFP. Stiplet linje (iv) viser en kvantitativ linjescanning analyse af fluorescensintensiteter. Scale barer = 5 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Som tidligere konstaterede lymfocytter actively probe overfladen af ​​endotel ved at udvide actin og HS1 (a cortactin homolog)-beriget og WASp- og src-afhængig fremspring såkaldte "invadosome-lignende fremspring; (Efterværn; hver ~ 0,5-1 um ​​i dybden i diameter) 27,28. Transfektion af membran-målrettet fluorescens protein (FP) er blevet påvist at give meget følsomme journalister for subcellulære topologiske dynamik ved celle-celle overflader. På denne måde er det blevet vist, at lyse ringe af fluorescerende membran-FP er tegn på membranen bøjes under T-celle-endothelial interaktion som et resultat af T-celle ILPS fremspring. Det er vist her, og i tidligere undersøgelser 19,20, at mens små klynger af efterværn formular og omsætningen hurtigt (dvs. levetid for ~ 10-30 sek) under lateral migrering af T-celler på endotel i fravær af SAG (figur 2A ), bliver de meget stabiliseret (dvs. levetid for ~ 30 min) og ophobes i tætte rækker i nærværSag (figur 2B). Desuden analyse af efterværn og calcium initiation kinetik ("Offset tid«) viser, at efterværn forud calcium signalering, hvilket tyder på at de støtte i anerkendelsesprocessen MHC-II / Ag (figur 2Bii). Derudover stabiliseret ILPS arrays danner et rimeligt forhold til maksimal calciumflux (fig 2Bii). Tanken om, at ringene i membran-fluorescens svarer til T-celle fremspring kørsel diskrete invagination pletter i endothelial APC'er, bekræftes af demonstrationen, at disse ringe i alle tilfælde korrelerer rumligt og kinetisk med zoner af fordrevne / udelukket cytoplasma (som rapporteret af opløselige DsRed; Figur 2D og Movie 2).

    Figur 3 giver eksempler på faste endpoint konfokal billeddiagnostiske undersøgelser. Efter 10 minutter af co-inkubering i nærværelse af Sag ISS dannet mellem T-celler og endotelceller APC'er blev afbildet ved fiksering, immuno-fluorescensfarvning og konfokal mikroskopi. Disse undersøgelser giver analyse af de subcellulære fordeling dynamik kritiske molekyler og signalanlæg aktiviteter inden Iss især relation til efterværn. Specifikt cytoskelet / cytoskelet regulator (actin, HS1, figur 3A), antigenpræsentation / anerkendelse (CD3 / MHC-II, figur 3B) adhæsion (ICAM-1, LFA-1, talin; figur 3C) og antigene signalering (PKC -Q, figur 3D) ses at være co-berigede i Podo-print / ILP. Digital rekonstruktion af konfokale seriel-sektion z-stakke giver supplerende beviser til dem, der vises i figur 2D, at T-celle-endotel endotel IS har en diskret 3-dimension arkitektur præget af T-celle ILP fremspringende i APC overflade (figur 3Aii, Ci, iii, D). (Figur 3Civ).

    Figur 3 Figur 3. Fast-Sample Analyse af Molecular Dynamics Distribution i T-celle-endotelcelle Immunologiske synapser. Lymfocytter blev inkuberet på SAg-loaded endotel i 30 minutter og fikseret og farvet. I angivne paneler endothelcelle blev præ-transficeret til at udtrykke membran-YFP eller -DsRed. (A) repræsentant imaging show actin (i) og HS1 (a cortactin homolog ii) co-beriget ved periferien af det immunologiske synapser i mikro-klynger, der korrelerer med centrum af endotelceller fluorescerende ringe af membran-YFP (dvs. " PODO-prints ', se figur 2D) bekræfter, at T-celle efterværn er ansvarlige for forekomsten af PODO-udskrifter. En side visning (ii. 90 ° projektion) illustrerer, at efterværn udgør 3-dimensionel fremspring i z imaging planet (ændret fra 19). (B) repræsentant berigelse af T-celle-TCR (i) og endothelial MHC-II (ii) inden den immunologiske synapse, viser diskret subcellulære fordeling til ILP / Podo-prints. (C) (i), Repræsentant co-berigelse af ICAM-1 og LFA-1 i PODO-prints og ILP, henholdsvis IS. (i) viser en 3-D digital rekonstruktion af konfokale dele af roteres 60 ° (øverste paneler) og 90 ° (orthogonal view; nedre paneler). (ii) Viser en zoomet afbildning af IS en face. (iii) viser et ortogonalt tværsnit af indrammede region (ii) (modificeret fra 19). (iv) Repræsentant co-berigelse af Tallinn (et integtin / actin linker protein) og actin i IS efterværn. (D) Repræsentant co-berigelse af TCR signalmolekyle PKC-Q med actin i IS efterværn. Hvert panel viser et en face visning (nederste venstre del) og to forskellige ortogonale visninger (90 ° projektion). Det yderste venstre og højre paneler bruger er gentagelser af deres, respektive nabolande paneler, fremskrevet med en regnbue fluorescence intensitet skala (modificeret fra 19). Scale barer = 5 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Movie 1

    Film 1:. Levende-Cell Dynamic Imaging af T-celle Calcium Signaling og immunologiske Synapse Topologi Time-lapse live-cell imaging af fura2-loaded CD4 + Th1 lymfocyt interagere med endotel udtrykker membran-YFP og fyldt med SAg, svarende til figur 2B. Venstre panel viser intracellulære calcium niveauer (rainbow: fede farver, lav calcium, varme farver høj calcium) i T-celle. Højre panel viser membran-YFP fluorescens på overfladen af ​​endotel APC. Lymfocytter ses at igangsætte spredning og ILP formation (som set via fluorescerende ringe i MEM-YFP kanal, altså 'PODO-prints', se figur 2Bi), efterfulgt af induktion af en vedvarende (30-60 min) intracellulært calcium flux, som opstår i et rimeligt forhold dannelsen af perifere arrays af efterværn / Podo-prints analoge med TCR / actin 'signalering mikro-klynger', der er set i plane dobbeltlag APC modeller (se figur 2Bii). Intervallet mellem rammer er 20 sek. Klik her for at se denne video.

    Movie 2

    Film 2: Levende-Cell Dynamic Imaging af Immunologisk Synapse topologi vien fluorescerende reportere endotel APC'er. Time-lapse live-cell imaging af CD4 + Th1 lymfocyt (DIC, venstre) vekselvirker med endotel co-udtrykker membran-YFP (grøn) og opløselig cytosolisk DsRed (rød) og fyldt med SAg, svarende til Figur 2D. Højre panel viser fletning af DIC, membran og cytoplasma signalering. De kombinerede signaler af membranen og cytoplasmatisk fluorescens sensitivt rapportere dannelse og ombygning af flere ~ 0,2-1 um ​​skala overflade invaginationer (PODO-tryk), der skyldes arrays T-celle sondering med ILP fremspring. Klik her for at se denne video.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Samlet set denne protokol beskriver metoder til undersøgelse endothelceller som i) dublerede fysiologiske APC'er og ii) som en ny form for 'plane cellulære APC model ". Med hensyn til førstnævnte, er det blevet stadig klart, at ikke-hæmatopoietiske perifere (eller "stromale ') APC'er spiller kritiske, ikke-redundante roller (dvs. sammenlignet med hæmatopoietisk APC'er) i udformningen af adaptive immunresponser 16-18. Blandt sådanne "semi-professionelle" APC'er, vaskulære og lymfatiske endotelceller (som langt overtal professionelle APC'er) er blandt de bedste værdsat 16-18. Men detaljerne i signalering begivenheder og deres koblede immunologiske synapser stort set efterforsket. De heri beskrevne metoder giver et grundlag for at fremme forståelsen på dette nye område. For eksempel anvendelsen af ​​disse metoder til studiet af ISS dannet på endotel fra forskellige væv, der vides at udvise særskilte ADAPTIVe immunologisk funktion (f.eks, lever og lymfe endotel) kan være særligt lærerigt.

    Betydeligt, denne metode er med til at bygge bro mellem professionelle APC'er og kunstige APC substrat modeller for at styrke evnen til at afhøre grundlæggende mekanismer i adaptive immunrespons. Ud fra følgende betragtninger plane APC substrater (dvs. lipiddobbeltlagene, antistof-coatede glas) giver optimal billeddannelse (hvilket har ført til mange kritiske indsigter 7,11-14), sådanne modeller i sagens natur er begrænsede. Alternativt oplysninger om fysiologiske celle-celle scanning dynamik har hidtil været dybt skjult af orientering-relaterede imaging spørgsmål 8-10. De billeddiagnostiske kapaciteter tilvejebragt i den nuværende tilgang overvinde denne hindring for entydigt afsløre ellers målbart tredimensional subcellulære arkitektur og hurtig ombygning af en fysiologisk APC-T-celle-interface. Disse tilbud potentiale for ny forståelse af antigen signaling.

    For eksempel erkendelse af, at T-celler danner efterværn beriget med TCR, actin og signalmolekyler (f.eks, figur 2D, figur 3), viser, at disse sandsynligvis repræsenterer fysiologisk 3-dimensionelle counter dele til den plane TCR signalering mikro-klynger observeret på kunstig APC substrater 6,7,12-14,29-31. Dette indebærer, at under fysiologiske indstillinger, kan lymfocytter ansætte efterværn som diskrete subcellulære '3D-reaktionsvolumener "med" signalosome'-lignende egenskaber, der forstærker og fastholde signalering ved at koncentrere vigtige molekyler / aktiviteter 32,33. Derudover, tilstedeværelsen af betydelige biomekaniske indgange (dvs. celle-celle force ansøgning) ved seværdigheder, hvis ILP fremspring mod APC kan udledes af billeddannelse. Dette er nontrivial som mekaniske kræfter i stigende grad betragtes som kritiske facilitatorer af antigen signalering, mens præcist, hvordan sådanne kræfter ermanifesteret fortsat uklart 14,34-37.

    Den generelle betydning af denne model som en rimelig erstatning for professionel APC'er understøttes af vores direkte påvisning af, at lignende ILP arrays kunne ses i synapser dannet på EC'er og DCS (og i mindre omfang B-celler), når analoge billedteknik blev anvendt (f.eks , brug af de samme fluorescens beslutningstagere og styring af IS flyet orientering flyet 19). Den har brug for alligevel at blive betragtet, at de relative biomekaniske egenskaber af EF versus professionelle APC membranoverflader er ukendte, og at forskelle i denne parameter kan påvirke oplysninger om IS topologi og antigene reaktioner.

    Nøglen til den tilgang, der er beskrevet heri er stærkt relateret til dens fordele opløsning. Dette vil igen er meget relateret til styrken af ​​fluorescenssignalet. Således er det vigtigt at være særlig opmærksom på at optimere transfektion og farvning af Lysstofrørcent journalister og billedbehandling parametre / teknik (f.eks eksponeringstid, fokus, etc ...). Med hensyn til førstnævnte, protokollen for levende celle undersøgelser, der er beskrevet her, er begrænset til transfektion af generiske membran og cytoplasmatiske markører, der rapporterer topologiske ændringer på T-celle-APC-grænsefladen i realtid (f.eks Figur 2, film 1, 2). Derudover kan denne protokol let modificeres til mere sofistikerede analyse ved samtidig indfører / imaging yderligere reportere i endotel (fx fluorescerende protein-mærkede MHCI / II og friktion, co-stimulerende og co-hæmmende molekyler og biosensorer til signalering og biomekaniske Dynamics). Desværre en generel begrænsning er, at lymfocytter er notorisk vanskelige at transficere. Dette udelukker praktisk anvendelse af fluorescerende proteiner (f.eks tagget til TCR, PKC-Q, etc.) i T-celler for levende celler.

    Mensden nuværende protokol involverer aktivering af menneskelige effektor / hukommelse CD4 + Th1 typen lymfocytter via SAg (en udbredt model), eksisterer meget bredere muligheder. Som tidligere påvist 19,20 denne fremgangsmåde kan let tilpasses til en bred vifte af andre indstillinger såsom reaktioner af andre CD4 + delmængder og aktivering af CD8 + lymfocyt drab reaktioner. Gennem isolering af lymfocytter og endotelceller fra eksisterende TCR-transgene stammer er denne metode også let kan tilpasses til at studere reaktioner på specifikke peptidantigener 19,20. Endelig er den nuværende tilgang er begrænset til en undersøgelse af effektor / memory T-celler. Men transfektion af endothelceller med de væsentlige co-stimulerende molekyler (CD80 / 86, der normalt ikke udtrykkes på endotel) kunne åbne mulighed for undersøgelse af naive cellepriming dynamik i denne model.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BD Vacutainer stretch latex free tourniquet BD Biosciences 367203
    BD alcohol swabs BD Biosciences 326895
    BD Vacutainer Safety-Lok BD Biosciences 367861 K2 EDTA
    BD Vacutainer Push Button Blood Collection Set BD Biosciences 367335
    RPMI-1640 Sigma-Aldrich R8758-1L
    Ficoll-Paque Sigma-Aldrich GE17-1440-02 Bring to RT before use
    FCS-Optima Atlanta Biologics s12450 Heat inactivated
    Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4458-100ML
    Trypan blue Sigma-Aldrich T8154-20ML
    staphylococcal enterotoxin B Toxin Technology BT202RED Stock solution 1mg/ml in PBS
    toxic shock syndrome toxin 1 Toxin Technology TT606RED Stock solution 1mg/ml in PBS
    human IL-15 R&D Systems 247-IL-025 Stock solution 50ug/ml in PBS
    PBS Life Technologies 10010-049
    Fibronectin Life Technologies 33016-015 Stock solution 1mg/ml in H20
    HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells Lonza CC-2543 Other Human Microvascular ECs can be used, i.e. HLMVECs
    EGM-2 MV bullet kit Lonza CC-3202
    Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T-4174 Stock solution 10x, dilute in PBS
    amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit Lonza vpb1003 Required Kit for step 4
    IFN-g Sigma-Aldrich I3265 Stock solution 1mg/ml in H20
    TNF-alpha 10ug, human Life Technologies PHC3015 Stock solution 1mg/ml in H20
    phenol Red-free HBSS Life Technologies 14175-103
    Hepes Fisher Scientific BP299-100
    Calcium Chloride Sigma-Aldrich C1016-100G Stock solution 1M in H20
    Magnesium chloride Sigma-Aldrich 208337 Stock solution 1M in H20
    Human Serum albumin Sigma-Aldrich A6909-10ml
    Immersol 518 F fluorescence free Immersion oil Fisher Scientific 12-624-66A
    Fura-2 AM 20x50ug Life Technologies F1221 Stock solution 1mM in DMSO
    pEYFP-Mem (Mem-YFP) Clontech 6917-1
    pDsRed-Monomer (Soluble Cytoplasmic DsRed) Clontech 632466
    pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed) Clontech 632512
    pEGFP-Actin Clontech 6116-1
    Alexa Fluor 488 Phalloidin Life Technologies A12379
    Formaldehyde solution 37% Fisher Scientific BP531-500 Toxic, use fumehood
    Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-5ML
     Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-70C
    Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-49A 
    Falcon Tissue Culture Treated Flasks T25 Fisher Scientific 10-126-9
     Falcon Tissue Culture Treated Flasks T75 Fisher Scientific   13-680-65
     Corning Cell Culture Treated T175 Fisher Scientific 10-126-61 
    Glass coverslips  Fisher Scientific 12-545-85  12 mm diameter
     Falcon Tissue Culture Plates 24-well Fisher Scientific 08-772-1
    Delta-T plates Bioptechs 04200415B
    Wheaton Disposable Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-8D
    1.5 ml Eppendorf tube  Fisher Scientific 05-402-25
     ICAM1 mouse anti-human BD Biosciences 555509
    HS1 mouse anti-human BD Biosciences 610541
    Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Purified ebioscience BMS102
    Anti-Human CD3 Alexa Fluor® 488 ebioscience 53-0037-41
    Anti-MHC Class II antibody  Abcam ab55152
    Anti-Talin 1 antibody Abcam ab71333
    Anti-PKC theta antibody  Abcam ab109481
    phosphotyrosine (4G10 Platinum) Millipore 50-171-463
    Nucleofector II Amaxa Biosystems Required electroporator for step 4
    Zeiss Axiovert Carl Zeiss MicroImaging
    Zeiss LSM510  Carl Zeiss MicroImaging
    Zeiss Axiovison Software Carl Zeiss MicroImaging
    NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet NuAIRE Nu-425-600
     Forma STRCYCLE 37 °C, 5% CO2 Cell culture Incubator Fisher Scientific 202370
    Centrifuge 5810 Eppendorf EW-02570-02
    Hemocytometer Sigma-Aldrich  Z359629 Bright-Line Hemocytometer
    Isotemp Waterbath model 202 Fisher Scientific 15-462-2

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-cell function and migration. Two sides of the same coin. N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).
    2. Springer, T. A. Adhesion receptors of the immune system. Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).
    3. Shaw, A. S., Dustin, M. L. Making the T cell receptor go the distance: a topological view of T cell activation. Immunity. 6 (4), 361-369 (1997).
    4. Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
    5. Delon, J., Stoll, S., Germain, R. N. Imaging of T-cell interactions with antigen presenting cells in culture and in intact lymphoid tissue. Immunol Rev. 189, 51-63 (2002).
    6. Brossard, C., et al. Multifocal structure of the T cell - dendritic cell synapse. Eur J Immunol. 35 (6), 1741-1753 (2005).
    7. Dustin, M. L. The cellular context of T cell signaling. Immunity. 30 (4), 482-492 (2009).
    8. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
    9. Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J Cell Sci. 123, 309-320 (2010).
    10. Oddos, S., et al. High-speed high-resolution imaging of intercellular immune synapses using optical tweezers. Biophys J. 95 (10), L66-L68 (2008).
    11. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
    12. Bunnell, S. C., et al. T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies. J Cell Biol. 158 (7), 1263-1275 (2002).
    13. Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
    14. Seminario, M. C., Bunnell, S. C. Signal initiation in T-cell receptor microclusters. Immunol Rev. 221, 90-106 (2008).
    15. Dustin, M. L. Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies. J Struct Biol. 168 (1), 152-160 (2009).
    16. Martinelli, R., Carman, C. V. Lymphocyte Endothelilal Interactions. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. , Elsevier. London. (2015).
    17. Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T lymphocyte-endothelial cell interactions. Annu Rev Immunol. 22, 683-709 (2004).
    18. Marelli-Berg, F. M., Jarmin, S. J. Antigen presentation by the endothelium: a green light for antigen-specific T cell trafficking? Immunol Lett. 93 (2-3), 109-113 (2004).
    19. Sage, P. T., et al. Antigen recognition is facilitated by invadosome-like protrusions formed by memory/effector T cells. J Immunol. 188 (8), 3686-3699 (2012).
    20. Kumari, S., et al. Actin foci facilitate activation of the phospholipase C-gama in primary T lymphocytes via the WASP pathway . eLife. , (2015).
    21. Marelli-Berg, F. M., et al. Major histocompatibility complex class II-expressing endothelial cells induce allospecific nonresponsiveness in naive T cells. J Exp Med. 183 (4), 1603-1612 (1996).
    22. Ma, W., Pober, J. S. Human endothelial cells effectively costimulate cytokine production by, but not differentiation of, naive CD4+ T cells. J Immunol. 161 (5), 2158-2167 (1998).
    23. Perez, V. L., Henault, L., Lichtman, A. H. Endothelial antigen presentation: stimulation of previously activated but not naive TCR-transgenic mouse T cells. Cell Immunol. 189 (1), 31-40 (1998).
    24. Epperson, D. E., Pober, J. S. Antigen-presenting function of human endothelial cells. Direct activation of resting CD8 T cells. J Immunol. 153 (12), 5402-5412 (1994).
    25. Shiao, S. L., et al. Human effector memory CD4+ T cells directly recognize allogeneic endothelial cells in vitro and in vivo. J Immunol. 179 (7), 4397-4404 (2007).
    26. Marelli-Berg, F. M., Okkenhaug, K., Mirenda, V. A two-signal model for T cell trafficking. Trends Immunol. 28 (6), 267-273 (2007).
    27. Carman, C. V., et al. Transcellular diapedesis is initiated by invasive podosomes. Immunity. 26 (6), 784-797 (2007).
    28. Carman, C. V. Mechanisms for transcellular diapedesis: probing and pathfinding by 'invadosome-like protrusions'. J Cell Sci. 122 ((Pt 17)), 3025-3035 (2009).
    29. Dustin, M. L., Tseng, S. Y., Varma, R., Campi, G. T. T cell-dendritic cell immunological synapses. Curr Opin Immunol. 18 (4), 512-516 (2006).
    30. Saito, T., Yokosuka, T. Immunological synapse and microclusters: the site for recognition and activation of T cells. Curr Opin Immunol. 18 (3), 305-313 (2006).
    31. Gomez, T. S., et al. HS1 functions as an essential actin-regulatory adaptor protein at the immune synapse. Immunity. 24 (6), 741-752 (2006).
    32. Burbach, B. J., Medeiros, R. B., Mueller, K. L., Shimizu, Y. T-cell receptor signaling to integrins. Immunol Rev. 218, 65-81 (2007).
    33. Vicente-Manzanares, M., Sanchez-Madrid, F. Role of the cytoskeleton during leukocyte responses. Nat Rev Immunol. 4 (2), 110-122 (2004).
    34. Ma, Z., Janmey, P. A., Finkel, T. H. The receptor deformation model of TCR triggering. Faseb J. 22 (4), 1002-1008 (2008).
    35. Ma, Z., Sharp, K. A., Janmey, P. A., Finkel, T. H. Surface-anchored monomeric agonist pMHCs alone trigger TCR with high sensitivity. PLoS Biol. 6 (2), e43 (2008).
    36. Groves, J. T. Bending mechanics and molecular organization in biological membranes. Annu Rev Phys Chem. 58, 697-717 (2007).
    37. Xu, C., et al. Regulation of T cell receptor activation by dynamic membrane binding of the CD3epsilon cytoplasmic tyrosine-based motif. Cell. 135 (4), 702-713 (2008).

    Tags

    Immunologi Immunologisk synapse T-cellereceptor major histokompatibilitetskompleks lymfocyt antigenpræsenterende celle endotel signalering calcium actin imaging adaptiv immunitet migration
    En Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunologisk Synapse Dynamics
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Martinelli, R., Carman, C. V. An… More

    Martinelli, R., Carman, C. V. An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics. J. Vis. Exp. (106), e53288, doi:10.3791/53288 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter