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Immunology and Infection

इमेजिंग रोग प्रतिरक्षण Synapse गतिशीलता के लिए एक endothelial Planar सेल मॉडल

Published: December 24, 2015 doi: 10.3791/53288

Abstract

प्रतिरक्षा अनुकूली टी कोशिकाओं और प्रतिजन कोशिकाओं ('APCs') के बीच गतिशील बातचीत द्वारा विनियमित 'प्रतिरक्षाविज्ञानी synapses' के रूप में जाना जाता है। इन अंतरंग सेल सेल इंटरफेस के भीतर एमएचसी / एजी-TCR, एफ actin, आसंजन के असतत उप सेलुलर समूहों और संकेतन अणुओं के रूप में और तेजी से फिर से तैयार करना। ये गतिशीलता महत्वपूर्ण दक्षता और विकास है कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की गुणवत्ता दोनों के निर्धारकों और इसलिए वैकृत उन्मुक्ति बनाम सुरक्षा का माना जाता है। शारीरिक APCs साथ प्रतिरक्षाविज्ञानी synapses के वर्तमान समझ प्राप्य इमेजिंग संकल्प की अपर्याप्तता द्वारा सीमित है। कृत्रिम सब्सट्रेट मॉडल (जैसे, तलीय लिपिड bilayers) उत्कृष्ट संकल्प प्रस्ताव है और बेहद कीमती उपकरण किया गया है, वे स्वाभाविक गैर-शारीरिक और oversimplified हैं। संवहनी और लसीका endothelial कोशिकाओं 'अर्द्ध पेशे का एक महत्वपूर्ण परिधीय ऊतक (या स्ट्रोमल) डिब्बे के रूप में उभरा हैअल APCs '। (पेशेवर APCs के आणविक मशीनरी के अधिकांश एक्सप्रेस), जो इन APCs लगभग तलीय कोशिका की सतह के गठन की अनूठी विशेषता है और (फ्लोरोसेंट प्रोटीन पत्रकारों के साथ, उदाहरण के लिए) आसानी transfectable हैं। इस के साथ साथ एक बुनियादी दृष्टिकोण वर्णित किया जाएगा एक उपन्यास और बेहतर इमेजिंग और मौलिक प्रतिजनी संकेतन प्रक्रियाओं की पूछताछ के लिए शारीरिक 'तलीय सेलुलर एपीसी मॉडल' के रूप में endothelial कोशिकाओं को लागू करने के लिए।

Introduction

टी lymphocytes प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल (एमएचसी) के लिए बाध्य कुशलता पेप्टाइड प्रतिजन (एजी) को पहचानने की क्षमता की विशेषता अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की एक शाखा है उनकी टी सेल रिसेप्टर्स (TCRs) 1 के माध्यम से अणुओं। भोले लिम्फोसाइट अनिवार्यता से विस्थापित और 'पेशेवर एजी कोशिकाओं पेश' (APCs, जैसे, वृक्ष के समान कोशिकाओं) स्कैन स्मृति / प्रेरक टी कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से परिधीय ऊतकों के भीतर APCs और संभावित लक्ष्य कोशिकाओं की एक अत्यंत व्यापक रेंज सर्वेक्षण करने के लिए जरूरत है, जबकि लिम्फ नोड्स के भीतर।

एक एपीसी पर आत्मीय एजी की प्रारंभिक पहचान निम्नलिखित मिनट में, उनके पलायन को गिरफ्तार करने और एक विशेष अंतरंग सेल सेल इंटरफेस में कहा 'प्रतिरक्षात्मक अन्तर्ग्रथन' के रूप में शुरू लिम्फोसाइटों (है)। निरंतर (यानी, 30-60 मिनट) संपर्क बढ़ाना और 2-7 संकेत बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं। उभरते पढ़ाई के भीतर, यह निरंतर गठन और तेजी R है कि पहचानताकत और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 2-7 जिसके परिणामस्वरूप की गुणवत्ता निर्धारित है कि (यानी, एमएचसी / एजी-TCR, एफ actin, आसंजन और संकेतन अणुओं से युक्त) असतत उप सेलुलर संकेत सूक्ष्म समूहों के emodeling। हालांकि, इस प्रक्रिया के गतिशील विवरण और नियामक तंत्र अधूरे 8,9 समझ रहे हैं। यह गहराई से अपेक्षित spatiotemporal इमेजिंग कि सीमा एपीसी सतहों की अनियमित टोपोलॉजी और सेल सेल बातचीत के विमानों के खराब नियंत्रित अभिविन्यास, मुद्दों के साथ जुड़े तकनीकी चुनौतियों से काफी हद तक उपजी 8-10 (Figure1A) दृष्टिकोण।

आकृति 1

इमेजिंग रोग प्रतिरक्षण Synapse गतिशीलता के लिए चित्रा 1. एक शारीरिक Planar सेल एपीसी मॉडल। योजनाबद्ध एक टी सेल और एक professio के बीच प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन के पारंपरिक इमेजिंग दिखाता है एनएएल एपीसी (ए) और टी सेल और इस उपन्यास एन्दोथेलिअल तलीय एपीसी मॉडल (सी) की तुलना में एक पारंपरिक तलीय लिपिड bilayer एपीसी मॉडल (बी)। , नाटकीय रूप से यानी स्थानिक (जेड इमेजिंग विमान संकल्प ~ 1 माइक्रोन) और लौकिक (समझौता, जो व्यावसायिक APCs शारीरिक रोग प्रतिरोधक synapses प्रदान करते हैं लेकिन (संकल्प ~ 0.2 माइक्रोन इष्टतम XY इमेजिंग विमान के लिए सम्मान के साथ यानी,) खराब उन्मुख सेल सेल इंटरफेस की पेशकश जरूरत की वजह से बार-बार इमेजिंग का संकल्प) सभी Z इमेजिंग विमानों के माध्यम से स्कैन करने के लिए। Bilayer मॉडल इष्टतम spatiotemporal इमेजिंग संकल्प प्रदान करता है कि एक तलीय टोपोलॉजी है, लेकिन यह भी अत्यधिक, गैर शारीरिक और कठोर सरल कर रहे हैं। इस endothelial सेल मॉडल एक शारीरिक सेटिंग में इष्टतम स्थानिक और लौकिक इमेजिंग संकल्प वितरित करने के लिए एक क्लासिक एपीसी की शारीरिक सब्सट्रेट के साथ लिपिड bilayers के तलीय टोपोलॉजी को जोड़ती है।एम / फ़ाइलें / ftp_upload / 53,288 / 53288fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पिछला काम आंशिक रूप से इष्टतम XY इमेजिंग के समानांतर है कि एक भी योजना में टी सेल सक्रियण सतह फिक्सिंग के माध्यम से, यानी इष्टतम spatiotemporal संकल्प (प्रदान करते हैं कि विकासशील तलीय सब्सट्रेट मॉडल (यानी, लिपिड bilayers और एंटीबॉडी लेपित सतहों) द्वारा इन बाधाओं को धोखा दिया गया है विमान) 11-15 (चित्रा 1 बी)। इन मॉडलों को गतिशील actin / TCR संकेत सूक्ष्म समूहों 7,11-14 की खोज सहित टी कोशिकाओं में प्रतिजनी संकेतन, कि नियंत्रण आणविक / subcellular गतिशीलता में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि में मदद की है। हालांकि, इस तरह के मॉडल स्वाभाविक oversimplified कर रहे हैं, साथ ही कठोर (चित्रा 1 बी) (3-आयामी topological सुविधाओं के विकास / अध्ययन precluding)। इसलिए, यह बनावट के लिए इस तरह के निष्कर्ष बताते हैं कि संबंधित करने के लिए कैसे अनिश्चित बनी हुई हैsiologic सेल सेल प्रतिरक्षा निगरानी।

अभी भी understudied हालांकि, नाड़ी और लसीका endothelial कोशिकाओं के एक बड़े रूप में उभर रहे हैं (यानी, ~ 1,000 गुना से सभी पेशेवर APCs से संख्या में अधिक से अधिक) 'अर्द्ध पेशेवर' APCs 16-18 के परिधीय डिब्बे। (जैसे, CD40, LFA3, ICOSL, 4-1BB, OX40L, TL1A, पीडी-एल 1, लेकिन नहीं CD80 और CD86) इन कोशिकाओं MHC-मैं-, एमएचसी-द्वितीय और सह उत्तेजक अणुओं की एक भीड़ को व्यक्त करने और रणनीतिक रूप से कर रहे हैं वे विशेष प्रहरी कार्यों 16-18 की सेवा जहां खून-ऊतक इंटरफेस में तैनात हैं। पिछले अध्ययनों endothelial कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से प्रेरक / स्मृति, लेकिन भोले नहीं, टी कोशिकाओं 19-25 फिर से उत्तेजित कर सकते हैं कि प्रदर्शन किया। इस प्रकार, endothelial कोशिकाओं ऐसी टी सेल सक्रियण, भेदभाव, स्मृति और सहिष्णुता 16,17,26 पर स्थानीय प्रभाव के रूप में परिधीय ऊतकों के भीतर अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रेरक चरण में अद्वितीय एपीसी भूमिकाओं खेलने की संभावना है। CRIइन विट्रो में हो गई जब tically, endothelial कोशिकाओं लगभग तलीय सेल रूप और सतहों (फ्लोरोसेंट प्रोटीन पत्रकारों के साथ, उदाहरण के लिए) आसानी transfectable हैं। इन सुविधाओं सेल सेल बातचीत 19,27 दौरान topological गतिशीलता के उच्च spatiotemporal संकल्प इमेजिंग के लिए आदर्श होते हैं। इस प्रकार endothelial कोशिकाओं प्रतिक्रियाओं (चित्रा 1 सी) 19,20 प्रतिजन मान्यता ड्राइव और विनियमित कि आणविक / subcellular पुनर्गठन तंत्र के अध्ययन के लिए साफ़ तौर पर अनुकूल एक शारीरिक 'तलीय सेलुलर एपीसी' मॉडल के रूप में काम कर सकता है।

इससे पहले आसंजन और transendothelial पलायन 27 के दौरान ल्युकोसैट endothelial बातचीत का ब्यौरा अध्ययन के लिए (प्लाज्मा झिल्ली और साइटोसॉल के फ्लोरोसेंट प्रोटीन निर्माताओं के साथ endothelia कोशिकाओं के अभिकर्मक सहित) पूरक इमेजिंग तकनीक की स्थापना की, ल्यूकोसाइट्स सक्रिय रूप से गतिशील द्वारा अन्तःचूचुक की सतह की जांच से पता चला कि प्रविष्टि एकउप माइक्रोन पैमाने पर की घ त्याग, actin युक्त बेलनाकार उभार (~ व्यास और गहराई में 200-1,000 एनएम) invadosome की तरह उभार (यानी, 'ILPS') 27,28 करार दिया। इन इमेजिंग दृष्टिकोण आगे सूचना 19,20 के रूप में टी सेल endothelial रोग प्रतिरोधक अन्तर्ग्रथन के उच्च spatiotemporal संकल्प इमेजिंग के लिए पहले तरीकों को विकसित करने के लिए एन्दोथेलिअल एपीसी समारोह का लाभ लेने के लिए और आगे इस के साथ साथ वर्णन करने के लिए प्रोटोकॉल के निर्माण के साथ-साथ विस्तारित किया गया है। इस उपन्यास तलीय सेलुलर एपीसी मॉडल से ली गई एक केंद्रीय निष्कर्ष टी सेल ILPS प्रारंभिक एजी का पता लगाने को बढ़ावा देने में और बाद में सिगनल को बनाए रखने में दोनों कार्य करते हैं। दरअसल, (स्थिर है और कैल्शियम प्रवाह प्रारंभिक प्रतिक्रिया में एकत्रित हुई) TCR और सक्रिय संकेतन ऐसे पीकेसी-क्यू, जैप -70, phosphotyrosine और HS1 के विचारोत्तेजक अणुओं में शो संवर्धन कई ILPS की सरणियों। इसलिए, ILPS TCR-संकेत सूक्ष्म करने के लिए एक तीन आयामी शारीरिक बराबर का प्रतिनिधित्व करने लगते हैंतलीय बाईलेयर मॉडल में देखा समूहों। यह दृष्टिकोण, इस प्रकार, संवेदनशीलता का पता चलता है / रिपोर्ट आणविक और वास्तु (और biomechanical गर्भित) गतिशीलता अन्यथा पता लगाने योग्य नहीं।

इस के साथ साथ वर्णित विधि अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के बुनियादी तंत्र से पूछताछ करने की हमारी क्षमता को बढ़ाने के क्रम में पेशेवर एपीसी और कृत्रिम एपीसी सब्सट्रेट मॉडलों के बीच के अंतर को पूरा करने के लिए उपयोगी होना चाहिए। यहाँ ध्यान सीडी 4 + Th1 प्रकार प्रेरक / स्मृति सेल की सक्रियता पर है जबकि नीचे चर्चा के रूप में, इस बुनियादी दृष्टिकोण को आसानी से, टी सेल प्रकार और AGS की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी प्रयोगों प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्राथमिक मानव endothelial कोशिकाओं मानव विषयों को शामिल (चमड़े या फेफड़ों microvascular ईसीएस) .Any अनुसंधान प्रोटोकॉल एक संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए और लिखित सूचित सहमति से प्रदान किया जाना चाहिए साथ आयोजित की जाती हैं प्रत्येक रक्त दाता। इस प्रोटोकॉल का उपयोग किए गए प्रयोगों बेथ इसराइल Deaconess मेडिकल सेंटर के आईआरबी द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. तैयारी मानव सीडी 4 + Th1 प्रेरक / स्मृति टी कोशिकाओं

  1. शराब के साथ नस पोंछ, दाता के हाथ करने के लिए बंधन लागू करें, और सुई डालें। धीरे धीरे anticoagulant के रूप में EDTA का उपयोग vacutainer में रक्त का 15 मिलीलीटर आकर्षित। रक्त तैयार किया गया है, सुई निकालने से पहले बंधन खोल दिया गया। इसके तत्काल बाद सुई निकाल दिया जाता है जब बाँझ धुंध के साथ घाव करने के लिए दबाव डालते हैं।
  2. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब के लिए रक्त का स्थानांतरण। एक कमजोर पड़ने (अंतिम मात्रा 30 मिलीलीटर): एक 1 पर आरटी पर RPMI 1640 जोड़ें। ध्यान से पतला उपरिशायीऐसे आरटी पर है Ficoll Paque रूप लिम्फोसाइटों पूर्व फ़िल्टर अलगाव माध्यम के 15 मिलीग्राम से युक्त दो 50 मिलीलीटर ट्यूब पर घ खून।
  3. एक झूलते बाल्टी रोटर में 1,200 XG पर 30 मिनट के लिए आरटी पर ढाल अपकेंद्रित्र। (RPMI-1640 की 500 मिलीलीटर, 50 मिलीलीटर एफसीएस, 5 मिलीलीटर पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन) टी सेल के माध्यम से तैयार centrifuging है।
  4. सेंट्रीफ्यूज से 50 मिलीलीटर ट्यूब के हटाने पर, चार परतों का निरीक्षण: लाल रक्त कोशिकाओं की एक गोली तल में, Paque, सफेद रक्त (लिम्फोसाइटों सहित) कोशिकाओं और प्लाज्मा होता है जो कोशिकाओं की एक परत। ध्यान से एक 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में एक पाश्चर विंदुक और हस्तांतरण के साथ सफेद रक्त कोशिका परत को हटा दें।
  5. (20 मिलीलीटर तक) आर टी RPMI-1460 को जोड़ने और 1,200 x जी पर 5 मिनट के लिए आरटी पर centrifuging द्वारा सफेद रक्त कोशिका परत को धो लें। टी सेल के माध्यम से 1 मिलीलीटर में सफेद रक्त कोशिकाओं Resuspend। एक 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 250 μl टी सेल के माध्यम से 1 मिलीलीटर सेल निलंबन के 5 μl जोड़ें और धीरे से ऊपर और नीचे पिपेट द्वारा मिश्रण।
  6. 25 μl पतला जोड़ें25 μl 0.4% Trypan नीले रंग के लिए डी सेल निलंबन। एक मानक hemocytometer के प्रत्येक पक्ष को मिश्रण के 10 μl जोड़ें।
  7. एक कम शक्ति प्रकाश माइक्रोस्कोप पर hemocytometer रखें। एक 10x उद्देश्य का उपयोग Trypan नीले डाई बाहर रखा गया है और hemocytometer के दोनों पक्षों के बीच वर्ग में मौजूद हैं है कि जीवित कोशिकाओं की संख्या गिनती।
  8. सेल एकाग्रता की गणना करने के लिए, 100 (कमजोर पड़ने कारक) द्वारा 2 चौकों की औसत गुणा और फिर से गुणा 10 4 कोशिकाओं / एमएल की संख्या देने के लिए।
  9. टी सेल के माध्यम में 0.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल अंतिम एकाग्रता को समायोजित करें। 1 ग्राम के अंतिम एकाग्रता जोड़ें / कोशिकाओं को बैक्टीरियल superantigens staphylococcal आंत्रजीवविष बी (एसईबी) और विषाक्त आघात सिंड्रोम विष 1 (TSST) में से प्रत्येक मिलीलीटर। 72 घंटा (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) के लिए संस्कृति सीडी 4+ टी सेल की आबादी का विस्तार करने के लिए।
  10. गोली टी कोशिकाओं (1,200 XG, 5 मिनट) और के साथ टी सेल के माध्यम में 0.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल में resuspendमानव आईएल 15 (20 एनजी / एमएल) के अलावा के। स्थानांतरण एक T150 फ्लास्क लिम्फोसाइटों। जरूरत के रूप में पूर्ण मध्यम-आईएल -15 में / हर 24-48 घंटा विभाजित कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए जारी रखें (मीडिया रंग के आधार पर, यानी, मीडिया के लिए थोड़ा पीला गुलाबी से बदल जाता है जब भी) उसके बाद। अप करने के लिए 15 दिनों के लिए जिसके परिणामस्वरूप लिम्फोसाइट आबादी को बनाए रखें।
    नोट: डिजाइन से, इस प्रोटोकॉल को सक्रिय करने और विशेष रूप से विस्तार एसईबी और TSST के लिए प्रतिक्रियाशील हैं कि सीडी 4+ टी कोशिकाओं के सबसेट और फिर एक Th1-जैसे प्रेरक / स्मृति फेनोटाइप की ओर उन्हें ड्राइव करेंगे। अन्य सफेद रक्त कोशिकाओं को जीवित है और आसानी से प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता के रूप में कदम 1.10 द्वारा कोशिकाओं, कम से कम 95% सीडी 4+, CD45RO + टी कोशिकाओं 19 हो जाएगी, ऐसा है कि इन परिस्थितियों में विकसित करने के लिए असफल। अगर वांछित, आगे की शुद्धि के लिए आसानी से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी / चुंबकीय मनका आधारित सकारात्मक या नकारात्मक चयन किट के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है।

2. प्राथमिक मानव endothelial सेल संस्कृति शुरू

<राजभाषा>
  • कोट बाँझ परिस्थितियों में पीबीएस में फ़ाइब्रोनेक्टिन (एफ एन) 20 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर के साथ एक T25 कुप्पी। 30-60 मिनट के लिए आरटी पर छोड़ दें। एफ एन निकालें और 5 मिलीलीटर पूरा मध्यम जोड़ने (endothelial बेसल मध्यम (ईबीएम -2) मध्यम endothelial वृद्धि मध्यम (ईजीएम -2) SingleQuots के साथ पूरक)। 37 में पूर्व सेते   कम से कम 30 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस सेल संस्कृति इनक्यूबेटर।
  • 2-3 मिनट ~ के लिए कभी-कभी कोमल आंदोलन के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जमे हुए मानव फेफड़े या त्वचीय microvascular endothelial कोशिकाओं (HLMVECs या HDMVECs) की एक शीशी पिघलना। इसके तत्काल बाद पूर्व गर्म मीडिया वाले T25 कुप्पी कोशिकाओं हस्तांतरण। धीरे घुमाना और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह।
  • ~ 4-6 घंटे के बाद मीडिया बदलें। मीडिया लगभग हर 48 घंटा (या मीडिया थोड़ा पीला हो जाता है) प्लेट ~ पहुंचता है जब तक 90-95% confluency बदलने के लिए आगे बढ़ें।
  • 3. सामान्य बंटवारे और endothelial कोशिकाओं के विस्तार

    1. ~ 90-95 confluency करने के लिए कोशिकाओं को विकसित। यह 2-5 दिन लग सकते हैं। बंटवारे के लिए,मीडिया को हटाने और पीबीएस के साथ कुल्ला। पीबीएस निकालें और ताजा 1x trypsin की न्यूनतम मात्रा (T25 के लिए 0.5 मिलीलीटर या T75 के लिए 1.5 एमएल) के साथ बदलें। धीरे trypsin के साथ सभी सतह को कवर करने के लिए ज़ुल्फ़। 37 पर सेते ~ 5 मिनट के लिए सी °। एक कम शक्ति प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग थाली से कोशिकाओं की टुकड़ी की निगरानी करें।
    2. कोशिकाओं के बहुमत गोल या अलग दिखाई देते हैं, पूर्व गर्म पूरा ईजीएम -2 मध्यम के (जोड़ा ट्रिप्सिन मात्रा की तुलना में, यानी) 5 मात्रा जोड़ने और धीरे सभी कोशिकाओं को अलग करने के लिए कुप्पी की सतह पर विंदुक।
    3. 1.6-1.7 में वर्णित के रूप में एक hemocytometer साथ endothelial कोशिकाओं की गणना। Centrifugation द्वारा कोशिकाओं (5 मिनट, 1200 XG) गोली। सतह पर तैरनेवाला निकालें। पूर्व गर्म पूरा ईजीएम -2 एमवी मीडिया के अलावा द्वारा मिलीलीटर प्रति 0.5 मिलियन कोशिकाओं के लिए एकाग्रता को समायोजित करें।
    4. रखरखाव के लिए उचित एफ एन लेपित बर्तन या बोतल करने के लिए कोशिकाओं की aliquots स्थानांतरण। धीरे घुमाना और इनक्यूबेटर में जगह है। चढ़ाना के 6-12 घंटे के भीतर मीडिया बदलें। मीडिया थानेदारहर 48 घंटे उसके बाद लगभग बदला जा uld।

    4. Endothelial सेल अभिकर्मक

    नोट: प्राथमिक endothelial कोशिकाओं सबसे आम रासायनिक और electroporation विधियों द्वारा अभिकर्मक के लिए आग रोक रहे हैं। नीचे वर्णित परमाणु अभिकर्मक आधारित पद्धति अपेक्षाकृत उच्च अभिकर्मक दक्षता (~ 50-70%) के लिए अनुमति देता है। एक कारगर विकल्प विधि उचित वायरल वैक्टर (सामग्री तालिका में टिप्पणी देखें) द्वारा संक्रमण का इस्तेमाल होता है।

    1. (के लिए बाँझ शर्तों या तो इस तरह के डेल्टा-टी प्लेटों के रूप में माइक्रोस्कोप संस्कृति प्लेटों में पीबीएस में फ़ाइब्रोनेक्टिन (एफ एन) 20ug / एमएल के साथ 90-95% confluency.Coat के अंतिम घनत्व को HLMVECs या HDMVECs का T25 या T75 बोतल (जरूरत के रूप में) तैयार करें (2.1) से ऊपर वर्णित के रूप में) के साथ 6 चरण के लिए 24 अच्छी तरह से सेल कल्चर प्लेट (की एक अच्छी तरह से अंदर रखा चरण 5) या 12 मिमी परिपत्र कांच coverslips।
    2. प्रत्येक 24 में अच्छी तरह से करने के लिए माइक्रोस्कोप संस्कृति को पूरा ईजीएम -2 संस्कृति मीडिया के 1 मिलीलीटर platesor 0.5 मिलीलीटर जोड़ें और प्लेटों संतुलित करनाएक humidified 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर।
    3. हार्वेस्ट और कदम आरटी पर 5 मिनट के लिए 1,200 XG पर कोशिकाओं के लिए आवश्यक मात्रा (नमूना प्रति 0.5 मिलियन कोशिकाओं) 3.1-3.3.Centrifuge में के रूप में endothelial कोशिकाओं गिनती। नमूना प्रति 100 μl आरटी परमाणु अभिकर्मक समाधान में ध्यान से सेल गोली Resuspend।
    4. 1-5 ग्राम डीएनए के साथ सेल निलंबन के 100 μl का मिश्रण। प्रमाणित क्युवेट में सेल / डीएनए निलंबन स्थानांतरण; नमूना हवा के बुलबुले के बिना क्युवेट के तल को कवर करना होगा।
      नोट: (posttranslational palmitoylation के लिए एक संकेत होता है कि neuromodulin के 20 एन टर्मिनल अमीनो एसिड के माध्यम से) कोशिका झिल्ली को YFP या DsRed को निशाना constructs (अकेले झिल्ली YFP अकेले या झिल्ली DsRed) अकेले इस्तेमाल किया गया है या एक साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट साइटोप्लास्मिक बड़ा मार्कर (जैसे, झिल्ली YFP और घुलनशील DsRed)। फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्कर के कई permutations इस्तेमाल किया जा सकता है।
    5. टोपी के साथ क्युवेट बंद करें। साथ क्युवेट डालेंसेल / डीएनए electroporator की क्युवेट धारक में निलंबन और electroporation कार्यक्रम एस -005 लागू होते हैं। कार्यक्रम समाप्त होने के बाद धारक के बाहर क्युवेट ले लो।
    6. क्युवेट करने के लिए पूर्व equilibrated संस्कृति मीडिया के ~ 500 μl जोड़ें और धीरे परमाणु अभिकर्मक किट में प्रदान की प्लास्टिक हस्तांतरण pipettes का उपयोग क्युवेट से सेल निलंबन हटा दें।
    7. माइक्रोस्कोप संस्कृति प्लेटों का उपयोग कर प्रयोगों पूर्व गर्म मीडिया (कदम 4.2-4.3) युक्त दो व्यंजन के बीच समान रूप से एक प्रतिक्रिया से सेल निलंबन विभाजन के लिए। 24 अच्छी तरह से / प्लेट, विभाजन 3 कुओं के बीच समान रूप से एक प्रतिक्रिया का उपयोग प्रयोगों के लिए।
    8. 12-16 घंटे बाद अभिकर्मक पर फिर से एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं और मीडिया 4-6 घंटा बदलने के लिए, और।

    5. लाइव सेल इमेजिंग और विश्लेषण

    1. तैयारी अन्तःस्तर
      1. 0 दिवस: एक nucleofe के माध्यम से झिल्ली YFP और घुलनशील DsRed के साथ प्राथमिक HLMVECs सह transfectके रूप में ction प्रौद्योगिकी रहते सेल इमेजिंग संस्कृति प्लेटों पर कदम 4 और थाली में वर्णित है।
      2. दिन 1: MHC-द्वितीय अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने IFN-γ (100 एनजी / एमएल) युक्त ताजा माध्यम के साथ मध्यम बदलें। 2 दिवस पर मौजूदा मीडिया के लिए 20 एनजी / एमएल टीएनएफ-α के अलावा द्वारा कोशिकाओं को उत्तेजित।
      3. 3 दिन, 1 ग्राम के साथ अन्तःचूचुक सेते / बैक्टीरियल superantigens से प्रत्येक 37 में staphylococcal आंत्रजीवविष बी (एसईबी) और विषाक्त आघात सिंड्रोम विष 1 (TSST) मिलीलीटर तुरंत प्रयोगों के लिए पहले 30-60 मिनट के लिए सी °। '-ag' नियंत्रण की स्थिति के लिए यह कदम न आना।
    2. लिम्फोसाइटों तैयारी
      1. कदम 5.1.3 के साथ समानांतर में, बफर 20 मिमी HEPES के साथ पूरक (फिनोल लाल मुक्त HbSS), पीएच 7.4 और 0.5% v / वी मानव सीरम albumin 37 के लिए पूर्व गरम तैयार सी। सुसंस्कृत लिम्फोसाइट का एक नमूना ले लो और एक hemocytometer (चरण 1.12-1.17) के साथ की गणना के द्वारा घनत्व निर्धारित करते हैं।
      2. 1 पर नमूना प्रति अपकेंद्रित्र 2 मिलियन कोशिकाओं,एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में आरटी पर 5 मिनट के लिए 200 XG। महाप्राण मीडिया और बफर के 2 मिलीलीटर में धीरे resuspend सेल गोली कोई सेल समूहों रहना एक ऐसा है कि।
      3. 1 मिमी की एक शेयर एकाग्रता बनाने के लिए DMSO में Fura-2 कैल्शियम डाई और resuspend के एक ताजा विभाज्य निकालें।
      4. (2 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता) टी सेल निलंबन के लिए Fura-2 के शेयर समाधान के 2 μl जोड़ें, ट्यूब टोपी और डाई का भी फैलाव सुनिश्चित करने के लिए inverting ट्यूब से तुरंत मिश्रण। 37 पर सेते 30 मिनट के लिए सी °।
      5. कदम 5.2.2 के रूप में अपकेंद्रित्र। महाप्राण बफर-ए और ताजा बफर-ए का 20-40 μl में धीरे लेकिन पूरी तरह resuspend लिम्फोसाइट।
    3. लाइव सेल इमेजिंग सेटअप और अधिग्रहण
      नोट: सिस्टम की एक विस्तृत विविधता ईमानदार और उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप पर रहते सेल प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए नियोजित किया जा सकता है। बुनियादी जरूरतों एक प्रतिदीप्ति प्रकाश स्रोत और फिल्टर, एक सीसीडी कैमरा, मोटर फिल्टर स्विचिंग और दरवाज़े, एक गर्म मंच (या microsc शामिलope-माउंटेबल गर्म कक्ष) और स्वचालित छवि अधिग्रहण के लिए सॉफ्टवेयर। इस प्रोटोकॉल उच्च संख्यात्मक एपर्चर, उच्च वृद्धि के लिए (यानी, 40X, 63X) तेल विसर्जन लेंस आवश्यक स्थानिक संकल्प को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं। विशेष देखभाल नहीं सभी अपेक्षित 340/380 एनएम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ संगत कर रहे हैं के रूप में Fura-2-आधारित कैल्शियम इमेजिंग के लिए उपयुक्त प्रतिदीप्ति स्रोत और लेंस के चयन में लिया जाना चाहिए। (मानक हरे और लाल प्रतिदीप्ति फिल्टर सेट के साथ संगत) एक वैकल्पिक दृष्टिकोण गैर ratiomentic कैल्शियम के प्रति संवेदनशील रंगों के साथ प्रयोग किया जा सकता है (जैसे, Fluo 4, Rhod-3), इन सही रूप में कैल्शियम प्रवाह quantitate और केवल एक रिश्तेदार प्रदान नहीं कर सकते, हालांकि / मात्रात्मक readout।
      1. माइक्रोस्कोप प्रणाली पर बारी (आपरेशन, माइक्रोस्कोप, सीसीडी कैमरा, फिल्टर पहिया और क्सीनन दीपक के लिए पीसी)।
      2. नामित सॉफ्टवेयर खोलें।
      3. स्वचालित मल्टीचैनल समय चूक इमेजिंग के लिए स्थापित माइक्रोस्कोप / सॉफ्टवेयर। विज्ञापन के अनुक्रमिक अधिग्रहण शामिलifferential हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी), मानक हरी प्रतिदीप्ति, मानक लाल प्रतिदीप्ति और मानक 340 और 380 एनएम उत्तेजना Fura-2 छवियों। 10-30 सेकंड और 20-60 मिनट ~ की कुल अवधि के लिए अधिग्रहण के लिए अंतराल सेट करें।
        1. Fura-2 के इमेजिंग के लिए जोखिम बार सेट करें।
          1. ताजा उद्देश्य तेल जोड़ें और हीटिंग मंच एडाप्टर पर बफर-ए का केवल 0.5 मिलीग्राम से युक्त एक माइक्रोस्कोप पकवान माउंट और तुरंत 37 को संतुलित करने के लिए मोड़ पर है | डिग्री सेल्सियस (~ 2-3 मिनट ले जाएगा)।
          2. एक 20 μl पिपेट का उपयोग घुड़सवार माइक्रोस्कोप पकवान कक्ष में Fura2 से भरी हुई लिम्फोसाइट आराम कर जोड़ें।
          3. उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग चालू करें। आईपीस को प्रकाश पथ का चयन करें। Miscoscope डिश के तल के साथ संपर्क में उद्देश्य लाने के लिए मोटे ध्यान केंद्रित घुंडी का प्रयोग करें। पकवान के नीचे बसे टी कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करने के आईपीस और ठीक ध्यान घुंडी का प्रयोग करें।
          4. कम से कम 10 कोशिकाओं से युक्त एक क्षेत्र का चयन करने के लिए XY मंच नियंत्रण का प्रयोग करें। बचेंअधिक भीड़ इन इमेजिंग कलाकृतियों पैदा करेगा के रूप में खेतों और सेल झुरमुटों।
          5. उज्ज्वल क्षेत्र से स्विच प्रकाश स्रोत फ्लोरोसेंट। सीसीडी कैमरे के आईपीस इमेजिंग से स्विच। सेट अधिग्रहण मानकों (जैसे, जोखिम समय, डिटेक्टर लाभ और binning)। Fura2-340 और Fura2-380 छवियों आराम कर सॉफ्टवेयर के अधिग्रहण का प्रयोग (आमतौर पर ~ 200-1,000 मिसे की रेंज में, प्रत्येक के लिए समान जोखिम समय के साथ शुरू)।
          6. प्रत्येक लिम्फोसाइट के लिए Fura2-340 / Fura2-380 गणना करने के लिए कदम 5.4.1 में वर्णित विधि का प्रयोग करें। , Fura2-340 और Fura2-380 जोखिम बार एडजस्ट करने छवियों को प्राप्त करने और औसत मान 1 के करीब हैं जब तक अनुपात की गणना के दोहराया पुनरावृत्तियों प्रदर्शन करते हैं।
        2. मेम-YFP और DsRed के लिए जोखिम बार सेट करें।
          1. एक miscroscope पकवान के साथ कदम 5.3.3.1 में इस्तेमाल माइक्रोस्कोप पकवान बदलें, ट्रांसफ़ेक्ट सक्रिय और शिथिलता इलाज (या अनुपचारित; नियंत्रण) युक्त सेल कल्चर इनक्यूबेटर (कदम 4.5 से HLMVECs या HDMVECs।1)। तेजी से मीडिया को दूर पूर्व गर्म बफर-ए का ~ 1 मिलीलीटर के अलावा द्वारा एक बार कुल्ला करने के लिए एक डिस्पोजेबल हस्तांतरण पिपेट का प्रयोग करें। महाप्राण और फिर बफर-ए का 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।
          2. चमकते फ्लोरोसेंट सकारात्मक transfectant endothelial कोशिकाओं मौजूद हैं और अच्छी तरह से बनाई कहनेवाला जंक्शनों के साथ स्वस्थ दिखाई देते हैं जिस क्षेत्रों की पहचान करें।
          3. मेम-YFP और DsRed के लिए अधिग्रहण के मानकों (जैसे, जोखिम समय, डिटेक्टर लाभ और binning) समायोजित करें। हर चैनल में मतलब प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता 25% और डिटेक्टर के गतिशील रेंज के 75% के बीच गिर जाता है कि सुनिश्चित करें।
      4. रहते सेल इमेजिंग प्रयोग आचरण।
        1. आधारभूत स्थापित करने के लिए छवियों के कई अंतराल छवि अधिग्रहण शुरू हो और कब्जा करने के लिए स्वचालित सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें।
        2. अधिग्रहण के दौरान एक छोटी मात्रा (पी -5 की नोक डालने से माइक्रोस्कोप पकवान इमेजिंग क्षेत्र के केंद्र के लिए (कदम 5.2 से) केंद्रित Fura-2-भरी हुई लिम्फोसाइटों के ~ 5 μl लागूया पी -20) बंद धीरे धीरे उद्देश्य और बाहर खदेड़ना के केंद्र के लिए मीडिया में पिपेट।
        3. लिम्फोसाइट इमेजिंग क्षेत्र में बसने के रूप में, ध्यान में ठीक समायोजन टी सेल endothelia सेल इंटरफेस (प्रतिरक्षाविज्ञानी synapses) फोकल हवाई जहाज़ में रखा जाता है विश्वास दिलाता हूं कि बनाते हैं। 40 और 63x उद्देश्य के साथ, ~ क्षेत्र प्रति 10-20 कोशिकाओं इष्टतम हैं। कम कोशिकाओं इमेजिंग क्षेत्र दोहराने कदम 5.3.4.2 में मनाया जाता है।
        4. प्रयोग के वांछित अवलोकन अंतराल की प्रतियोगिता है, के बाद अधिक से अधिक कैल्शियम प्रवाह / Fura-2 संकेतन संकेत प्रेरित करने के लिए 2 माइक्रोन का एक अंतिम एकाग्रता (5.3.4.2 में के रूप में तकनीक का उपयोग करते हुए) इमेजिंग जारी है और तुरंत miscoscope डिश में सीधे ionomycin पिपेट (यानी अंशांकन करने का एक साधन है, विश्लेषण 5.4 देखें।)।
        5. प्रयोग के वांछित अवलोकन अंतराल 5.3.4.4after के लिए एक विकल्प की प्रतियोगिता है, तुरंत बफर-ए महाप्राण और 0.5 मिलीलीटर लगानेवाला समाधान (पीबीएस में 3.7% formaldehyde) 5 मिनट के लिए पर इसे बदलने के साथआरटी, पीबीएस के साथ तीन बार rinsing द्वारा पीछा किया। फिर 6 कदम आगे बढ़ना।
    4. लाइव सेल इमेजिंग का विश्लेषण
      नोट: प्राप्त कर लिया फ़ाइलों को बचाने के बाद, वे सीधे विश्लेषण किया जा सकता है या बंद लाइन छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर अनुप्रयोगों की एक विस्तृत विविधता द्वारा विश्लेषण के लिए निर्यात किया। ImageJ लगभग हर अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पैकेज के साथ स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है और संगत है कि एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, अत्यधिक बहुमुखी पैकेज है। कदम 5.1-5.3 में वर्णित इमेजिंग प्रयोगों के डिजाइन लिम्फोसाइट और endothelial एपीसी अभाव में और आत्मीय शिथिलता की उपस्थिति के बीच बातचीत के उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प गतिशीलता निकलेगा। सेलुलर morphometric / सिगनल गतिशीलता की इमेजिंग डेटा को संबोधित जब लगभग असीम विश्लेषण संभव हो रहे हैं। इस विशेष प्रोटोकॉल में वर्णित विशिष्ट उद्देश्यों coordinately लिम्फोसाइट प्रवास और गतिशील के साथ (यानी, कैनेटीक्स और intracellular कैल्शियम प्रवाह के स्तर) संकेत यों की हैंअल विशिष्ट सुविधाओं (यानी, ILPS / Podo-प्रिंट) पर ध्यान देने के साथ immunologic अन्तर्ग्रथन वास्तुकला में बदल जाता है। अलग मानक और गैर मानक के उदाहरण हैं का विश्लेषण करती है (यानी, इन प्रयोगों / प्रश्नों के लिए विशेष रूप से विकसित)।
      1. लिम्फोसाइट कैल्शियम प्रवाह उपाय
        1. लिम्फोसाइटों के अलावा पहले हासिल किया गया है कि प्रारंभिक Fura2-340 (340 एनएम पूर्व 510 एनएम ईएम) और Fura2-380 (380 एनएम पूर्व 510 एनएम ईएम) छवियों का चयन करें। प्रत्येक संबंधित चैनल के लिए समय की श्रृंखला में छवियों के सभी से उन्हें घटाना डिजिटली पृष्ठभूमि छवियों के रूप में इन का प्रयोग करें और।
        2. प्रत्येक समय बिंदु के लिए पृष्ठभूमि घटाया Fura2-340 और पृष्ठभूमि घटाया Fura2-380 छवियों (यानी, 340 एनएम पूर्व 510 एनएम ईएम पृष्ठभूमि / 380 एनएम पूर्व 510 एनएम ईएम पृष्ठभूमि) की एक डिजिटल अनुपात छवि बनाने।
        3. उपयुक्त सॉफ्टवेयर ड्राइंग उपकरण का चयन करें। मैं के एक परिपत्र क्षेत्र आकर्षित करने के लिए स्क्रीन पर क्लिक करेंप्रत्येक लिम्फोसाइट के आसपास (आरओआई) nterest। ये प्रत्येक लिम्फोसाइट और समय सीमा के लिए एक पिक्सेल औसतन अनुपात मूल्य उत्पन्न होगा।
        4. एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर आवेदन (जैसे, स्प्रेडशीट प्रोग्राम) का उपयोग समय के एक समारोह के रूप में गणना अनुपात प्लॉट। क्षेत्र प्रति लिम्फोसाइटों के सभी के अनुपात मूल्यों संक्षेप और हर समय बिंदु के लिए लिम्फोसाइट की कुल संख्या से है कि मूल्य को विभाजित करके प्रयोग के लिए औसतन कैल्शियम प्रवाह की गणना
      2. Lympocyte पलायन ट्रैकिंग विश्लेषण का संचालन।
        1. प्रत्येक वीडियो से डीआईसी चैनल का उपयोग एक उचित सेल ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर अनुप्रयोग (जैसे, ImageJ) का उपयोग सेल टी सेल प्रवास का विश्लेषण करें। ImageJ सेल ट्रैकिंग प्लगइन का उपयोग करना, स्वयं एक प्रगतिशील फ्रेम में उस पर क्लिक करके प्रत्येक फ्रेम में प्रत्येक कोशिका के केन्द्रक की पहचान।
        2. जिसके परिणामस्वरूप सीरियल XY निर्देशांक का उपयोग (यानी, प्रवास के रास्तों का निशान) मतलब वेग (कुल दूरी चले गए / कुल अंतराल ओ गणना करने के लिएच इमेजिंग) और टेढ़ा-मेढ़ापन (कुल दूरी) / प्रथम और अंतिम छवि में सेल स्थान के बीच रैखिक अंत करने के लिए अंत दूरी चले गए।
        3. एक सेल-दर-सेल आधार पर कैल्शियम प्रवाह (5.4.1) गतिशीलता के साथ इन मानकों क्रॉस सहसंबंधी।
      3. भीतर Podo-प्रिंट / आईएलपी घनत्व का आकलन
        1. प्रत्येक टी सेल में गठित आईएलपी की कुल संख्या की गणना परिभाषित किया गया है अंतराल (जैसे, टी कोशिकाओं के 5 मिनट के पद अलावा)। ये लिम्फोसाइट आसंजन की एक साइट पर एन्दोथेलिअल एपीसी पर साइटोप्लास्मिक DsRed में काले घेरे के साथ-स्थानीय बनाना कि सह असतत माइक्रोन पैमाने फ्लोरोसेंट झिल्ली YFP छल्ले पहचाना जा सकता है।
        2. एक सेल-दर-सेल आधार पर कैल्शियम प्रवाह (5.4.1) गतिशीलता के साथ जिसके परिणामस्वरूप 'आईएलपी अनुक्रमित' क्रॉस-सहसंबंधी।
      4. Podo-प्रिंट / आईएलपी जन्मों उपाय।
        1. दिए गए प्रत्येक Podo-प्रिंट / आईएलपी के लिए एक आईएलपी दिखाई दे रहा था, जब पिछली बार बिंदु के रूप में अपने जीवन काल की गणना है - समय बिंदु है कि जब Podo-प्रिंट / आईएलपी फाईआरएसटी दिखाई दिया। औसत आईएलपी दोनों प्रति जन्मों।
        2. एक सेल-दर-सेल आधार पर कैल्शियम प्रवाह (5.4.1) गतिशीलता के साथ इन जन्मों क्रॉस सहसंबंधी।
      5. प्रारंभिक आईएलपी गठन और कैल्शियम प्रवाह के बीच अस्थायी संबंध का आकलन करें।
        1. प्रत्येक लिम्फोसाइट के लिए कैल्शियम पहले आधारभूत 19 से ऊपर उठकर, जिस पर समय बिंदु (फ्रेम) की पहचान।
        2. प्रत्येक लिम्फोसाइट के लिए पहले Podo-प्रिंट / आईएलपी प्रकट होता है, जिस पर समय बिंदु की पहचान।
        3. प्रत्येक लिम्फोसाइट के लिए प्रारंभिक Podo-प्रिंट / आईएलपी के उस से प्रारंभिक कैल्शियम प्रवाह समय बिंदु घटाकर एक 'ऑफसेट' समय की गणना। एक क्षेत्र में सभी लिम्फोसाइटों के लिए मूल्यों औसत। सकारात्मक मूल्यों ऋणात्मक संख्याओं के विपरीत संकेत मिलता है जबकि आईएलपी गठन कैल्शियम प्रवाह पछाड़ संकेत मिलता है।
          नोट: 1 के रूप में वर्णित इन प्रयोगों आसानी से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध समानांतर दीवार प्रवाह इमेजिंग कक्षों का उपयोग कर physiologically प्रासंगिक लामिना कतरनी प्रवाह के तहत किया जा सकता है9।

    6. फिक्स्ड सेल इमेजिंग और विश्लेषण

    1. फिक्स्ड समापन बिंदु टी सेल एन्दोथेलिअल गठन और धुंधला हो जाना है
      1. 1 में वर्णित के रूप में endothelial कोशिकाओं को तैयार टी कोशिकाओं को तैयार (- / + एसएजी) 5.1 कदम के रूप में (अभिकर्मक, चरण 5.1.1 वैकल्पिक है)। सुसंस्कृत लिम्फोसाइट का एक नमूना ले लो और एक hemocytometer (खंड 1) के साथ की गणना के द्वारा घनत्व निर्धारित करते हैं।
      2. 3 मिनट के लिए 200 XG पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए कम से कम 3 एक्स 10 5 लिम्फोसाइट्स / नमूना के लिए एक लिम्फोसाइट संस्कृति मात्रा बराबर स्थानांतरण। तैरनेवाला निकालें और बफर-ए में लिम्फोसाइट गोली (चरण 5.2.1) 6 एक्स 10 5 लिम्फोसाइट्स / एमएल की एकाग्रता resuspend।
      3. सेल संस्कृति इनक्यूबेटर से endothelial कोशिकाओं को हटाने और क्रमिक महाप्राण मीडिया (एक समय में एक नमूना कार्यवाही) और लिम्फोसाइट निलंबन (3 एक्स 10 5 लिम्फोसाइट्स / नमूना) के 0.5 मिलीलीटर के साथ की जगह है और 37 तक की जगह डिग्री सेल्सियस मैंncubator।
      4. उचित ऊष्मायन समय के बाद, ऊपर कुओं से महाप्राण मध्यम उल्लेख किया और (24 अच्छी तरह से थाली ~ 300-500 μl में, उदाहरण के लिए) पूरी तरह से नमूना कवर करने के लिए पर्याप्त लगानेवाला समाधान (पीबीएस में 3.7% formaldehyde) जोड़ें। 5-10 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
      5. पीबीएस के साथ नमूना 3 बार कुल्ला। आरटी पर 60 मिनट के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़कर दाग (सूची देखें)। प्राथमिक एंटीबॉडी एक intracellular प्रोटीन को निर्देश दिया है, तो एक अतिरिक्त permeabilization कदम पूरी तरह से आरटी पर 1 मिनट के लिए नमूना कवर करने के लिए पर्याप्त permeabilization समाधान (पीबीएस में 0.01% TritonX-100) जोड़कर प्रदर्शन की जरूरत है। पीबीएस के साथ नमूना 3 बार कुल्ला। आरटी पर 60 मिनट के लिए (कुछ मामलों समन्वित रूप से फ्लोरोसेंट phalloidin में) उचित माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें।
      6. एक इमेजिंग स्लाइड पर परिपत्र गिलास coverslip माउंट। फिक्स्ड समापन बिंदु टी सेल एन्दोथेलिअल गठन और धुंधला हो जाना है। खुर्दबीन मंच पर नमूने युक्त इमेजिंग स्लाइड इमेजिंग जगह शुरू हो और 63X तेल का चयन करने के लिएउद्देश्य। ताजा विसर्जन के तेल को लागू करें।
    2. फोकल हवाई जहाज़ का पता लगाने के लिए उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग मोड और नेत्र लेंस का प्रयोग करें। Epifluorescence स्विच करने के लिए और नेत्र लेंस के माध्यम से नमूना निरीक्षण किया। ब्याज की एक क्षेत्र का चयन करें। लेजर स्कैनिंग मोड में स्विच करें।
    3. तेजी से स्कैन मोड का उपयोग करना है और संभव व्यापक क्षेत्र को अलग-अलग, आदर्श, विशिष्ट संकेत तीव्रता तक पहुँच जाता है कि इस तरह के संकेत अनुकूलन करने के लिए लेजर शक्ति और प्रत्येक चैनल के लाभ को समायोजित में काम कर ~ 25% और गतिशील रेंज के नहीं 75% से अधिक कम से कम डिटेक्टरों की।
    4. ध्यान मैनुअल नियंत्रण का प्रयोग, जल्दी से जेड अक्ष के माध्यम से स्कैन और सेक्शनिंग के ऊपरी और निचले सीमा (आमतौर पर सभी जानकारी के ~ 15 माइक्रोन की मोटाई के भीतर समाहित किया जाना चाहिए) को पहचानें। ~ 0.2-1.0 माइक्रोन की रेंज में जेड अक्ष अनुभाग मोटाई का चयन करें।
    5. अंत में, ज़ूम / ब्याज और आचरण स्कैन के विशिष्ट क्षेत्र के लिए इमेजिंग क्षेत्र फसल। बहुत उज्ज्वल है और विशिष्ट प्रतिदीप्ति सी होने के अलावानमूने में gnal, उच्च संकल्प 3 डी इमेजिंग प्राप्त स्कैनिंग और अधिग्रहण के मापदंडों के समायोजन करने की पुनरावृत्तियों की आवश्यकता है। उद्देश्य प्रशंसनीय तस्वीर विरंजन के बिना अधिक से अधिक XY और जेड अक्ष संकल्प, प्राप्त करने के लिए है।
    6. गुणात्मक एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर आवेदन (जैसे, छवि जम्मू) के माध्यम से जिसके परिणामस्वरूप ऑप्टिकल वर्गों के डिजिटल 3D पुनर्निर्माण का आयोजन के द्वारा होता है की 3 डी टोपोलॉजी टोपोलॉजी का विश्लेषण। इसी तरह के अनुप्रयोगों के माध्यम से मात्रात्मक प्रतिदीप्ति संकेत वितरण का आकलन (जैसे, पीयरसन की सह स्थानीयकरण और correlative प्रतिदीप्ति तीव्रता लाइन-स्कैन विश्लेषण और orthogonal देखने)।

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    Representative Results

    Endothelial कोशिकाओं का प्रयोग और शारीरिक जटिलता और पेशेवर APCs के विरूपता के साथ तलीय लिपिड bilayers मॉडल का संकल्प लाभ के संयोजन एक उपन्यास इमेजिंग दृष्टिकोण (चित्रा 1) विकसित किया गया था। 2 इस के साथ मनाया ठेठ प्रवास, कैल्शियम प्रवाह और topological गतिशीलता के उदाहरण प्रदान करता चित्रा दृष्टिकोण। अन्तःचूचुक पर शिथिलता के अभाव में शिथिलता-विशिष्ट सीडी 4 + Th1 लिम्फोसाइट तेजी से ध्रुवीकरण, फैला है और कैल्शियम fluxing बिना endothelial सतह (2A चित्रा) पर विस्थापित laterally () नहीं दिखाया। ~ 5-10 मिनट के भीतर इन लिम्फोसाइट अन्तःचूचुक भर स्थानांतरगमन आरंभ करें। अन्तःचूचुक पर शिथिलता लोडिंग की उपस्थिति में, एक 'तला हुआ अंडा' टोपोलॉजी के साथ संतुलित रूप से फैल लिम्फोसाइटों (यानी, 30-60 मिनट के लिए) intracellular कैल्शियम प्रवाह (चित्रा 2 बी, मूवी 1) निरंतर आरंभ वे दिखा रहे हैं जो समय के दौरानकम या कोई प्रवास (चित्रा -2)।

    चित्र 2
    टी सेल सक्रियण और प्रवासन और endothelial APCs के रोग प्रतिरक्षण Synapse टोपोलॉजी। (ए) पैनलों की चित्रा 2. लाइव सेल विश्लेषण शिथिलता के अभाव में अन्तःचूचुक पर टी सेल प्रवास के समय श्रृंखला इमेजिंग का एक उदाहरण दिखा। ऊपरी पैनल डीआईसी छवियों से पता चलता है। पलायन के टी सेल की प्रारंभिक स्थिति लाल बिंदीदार रेखा ने संकेत दिया है। कम पैनल पलायन टी सेल के द्वारा अन्तःचूचुक पर गठित invaginations से पता चलता है। तीर एन्दोथेलिअल एपीसी सतह के खिलाफ 'invadosome की तरह उभार' (ILPS) (डी देखें) के टी सेल पीढ़ी का एक परिणाम के रूप में गठन झिल्ली YFP प्रतिदीप्ति के क्षणिक छल्ले (~ 0.5-1 मीटर व्यास) के गठन का संकेत मिलता है। (बी) शिथिलता से भरी हुई अन्तःचूचुक (बाएं की उपस्थिति में एक समान श्रृंखला का एक उदाहरण दिखाता है, यह भी देखेंमूवी 1) और कैल्शियम का स्तर (दाएं) में गतिशील परिवर्तन की मात्रात्मक का पता लगाने के लिए इसी। तीर उच्च कैल्शियम प्रवाह (द्वितीय) के साथ संबद्ध है कि कैल्शियम प्रवाह (मैं) की दीक्षा के साथ संबद्ध है कि प्रारंभिक ILPS गठन और कई ILPS के बाद स्थिरीकरण इंगित करता है। एक और बी के रूप में (सी) प्रयोगों पर नज़र रखने के विश्लेषण प्रकोष्ठ के अधीन थे। 10 मिनट (लाल निशान) की अवधि के ऊपर छोड़ दिया शो प्रतिनिधि टी सेल प्रवास रास्तों पर डीआईसी छवियों। सही पर ग्राफ अनुपस्थिति और शिथिलता की उपस्थिति में गणना पलायन वेग से पता चलता है। (डी) (19 से संशोधित) प्रतिरक्षात्मक अन्तर्ग्रथन टोपोलॉजी के गतिशील विश्लेषण। (मैं) झिल्ली-लक्षित-YFP और घुलनशील साइटोसोलिक आरएफपी से मिलकर एक संवेदनशील endothelial सेल / एपीसी 'टोपोलॉजी संवाददाता प्रणाली' को दिखाता है योजनाबद्ध। सिलेंडर के आकार invaginations उत्पन्न endothelial सेल सतह में फैलाना कि actin की मध्यस्थता आईएलपी जी (सेलुलर फुट प्रिंट का एक प्रकार है, एक 'Podo-प्रिंट' कहा जाता है)झिल्ली-YFP प्रतिदीप्ति के छल्ले के रूप में दिखाई देते हैं कि तेजी से मुड़ी हुई झिल्ली को iving वृद्धि (यानी, चेहरे एन देखी सिलेंडर की दीवारों)। इन स्थलों पर साइटोसॉल विस्थापन और बहिष्कार साइटोसोलिक आरएफपी के रूप में काले घेरे दिखाई देते हैं। डीआईसी और (ii) शिथिलता की उपस्थिति में इस तरह के विश्लेषण का एक उदाहरण दिखा में प्रतिदीप्ति छवियों (भी फिल्म 2 इसी देखें)। एक एकल प्रारंभिक Podo-प्रिंट / आईएलपी> 20 से 15 मिनट से अधिक ILPS स्थिर की एक सरणी में विकसित करता है। झिल्ली-YFP की एक अंगूठी बाहर रखा साइटोसोलिक आरएफपी के एक क्षेत्र के साथ ओवरलैप जिससे 15 मिनट (iii) पर नीले बॉक्स में एक भी Podo-प्रिंट / आईएलपी की एक उच्च संकल्प दृश्य दिखाता है। धराशायी लाइन (iv) प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक मात्रात्मक लाइन स्कैन के विश्लेषण से पता चलता है। स्केल सलाखों = 5 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    पहले से स्थापित के रूप में, लिम्फोसाइट ACTIVइली जांच का विस्तार actin और HS1 (एक cortactin सजात) द्वारा अन्तःचूचुक की सतह -enriched और WASp- और स्रोत पर निर्भर उभार 'invadosome की तरह उभार करार दिया; (ILPS, प्रत्येक ~ व्यास में गहराई में 0.5-1 माइक्रोन) 27,28। झिल्ली-लक्षित प्रतिदीप्ति प्रोटीन (एफपी) के अभिकर्मक सेल सेल सतहों पर subcellular topological गतिशीलता के लिए अत्यधिक संवेदनशील संवाददाताओं से प्रदान करने के लिए प्रदर्शन किया गया है। इस तरह, यह फ्लोरोसेंट झिल्ली एफपी की है कि उज्ज्वल छल्ले टी सेल ILPS उभार का एक परिणाम के रूप में टी सेल endothelial बातचीत के दौरान झुकने झिल्ली का संकेत कर रहे हैं दिखाया गया है। यह यहाँ दिखाया गया है, और पिछले अध्ययनों 19,20, में है कि छोटे तेजी से ILPS फार्म और कारोबार के समूहों (यानी, 10-30 सेकंड ~ जन्मों) शिथिलता के अभाव में अन्तःचूचुक पर टी कोशिकाओं के पार्श्व प्रवास के दौरान (2A चित्रा जबकि ), वे अत्यधिक स्थिर (यानी, ~ 30 मिनट के जीवन काल) और उपस्थिति में घने सरणियों में जमा हो जाते हैंशिथिलता की चित्रा (2 बी)। इसके अलावा, ILPS और कैल्शियम दीक्षा कैनेटीक्स का विश्लेषण, ILPS कैल्शियम संकेतन पूर्व में होना पता चलता है कि वे एमएचसी-द्वितीय / एजी मान्यता प्रक्रिया (चित्रा 2Bii) में सहायता सुझाव ('समय ऑफसेट')। इसके अतिरिक्त, ILPS सरणियों अधिक से अधिक कैल्शियम प्रवाह (चित्रा 2Bii) के अनुरूप फार्म स्थिर हो। विचार झिल्ली प्रतिदीप्ति के छल्ले एन्दोथेलिअल APCs में असतत invagination स्पॉट ड्राइविंग टी सेल उभार के अनुरूप है कि सभी मामलों में इन छल्लों घुलनशील DsRed द्वारा रिपोर्ट के रूप में विस्थापित / बाहर रखा कोशिका द्रव्य का क्षेत्र (साथ स्थानिक और kinetically सहसंबंधी कि प्रदर्शन के द्वारा की पुष्टि की है; चित्रा 2 डी और मूवी 2)।

    चित्रा 3 तय समापन बिंदु confocal इमेजिंग के अध्ययन के उदाहरण प्रदान करता है। टी कोशिकाओं और endothelial APCs के बीच का गठन शिथिलता, आईएसएस की उपस्थिति में सह ऊष्मायन के 10 मिनट के बाद मैं निर्धारण द्वारा imaged थेmmuno प्रतिदीप्ति धुंधला और confocal माइक्रोस्कोपी। इन अध्ययनों ILPS के लिए विशेष संबंध में आईएसएस के भीतर महत्वपूर्ण अणुओं की subcellular वितरण की गतिशीलता का विश्लेषण और संकेत गतिविधियों प्रदान करते हैं। विशेष रूप से, cytoskeletal / cytoskeletal नियामक (actin, HS1, चित्रा 3 ए), प्रतिजन प्रस्तुति / मान्यता (CD3 / MHC-द्वितीय, चित्रा 3 बी) आसंजन (ICAM-1, LFA-1, Talin, चित्रा 3 सी), और प्रतिजनी संकेतन (पीकेसी -Q, चित्रा 3 डी) Podo प्रिंट / आईएलपी में सह-समृद्ध करते हुए देखा गया। कोंफोकल सीरियल अनुभाग Z ढेर के डिजिटल पुनर्निर्माण, टी सेल एन्दोथेलिअल एन्दोथेलिअल एपीसी सतह में फैला हुआ टी सेल आईएलपी द्वारा punctuated एक असतत 3-आयाम वास्तुकला (चित्रा 3Aii, सीआइ गया है कि चित्रा 2 डी में दिखाया गया है उन लोगों के लिए पूरक सबूत उपलब्ध कराता है तृतीय, डी)। (चित्रा 3Civ)।

    चित्र तीन टी सेल endothelial सेल रोग प्रतिरक्षण Synapses में आण्विक वितरण गतिशीलता की चित्रा 3. फिक्स्ड नमूना विश्लेषण। लिम्फोसाइटों 30 मिनट के लिए शिथिलता से भरी हुई अन्तःचूचुक पर incubated और तय की और दाग रहे थे। संकेत दिया पैनलों में endothelial कोशिका झिल्ली-YFP या -DsRed व्यक्त करने के लिए पूर्व ट्रांसफ़ेक्ट थे। (ए) प्रतिनिधि इमेजिंग शो actin (i) और HS1 (एक cortactin सजात ii) एन्दोथेलिअल फ्लोरोसेंट झिल्ली YFP के छल्ले (यानी, 'का केंद्र के साथ संबंध स्थापित कि सूक्ष्म समूहों में प्रतिरक्षात्मक अन्तर्ग्रथन की परिधि में सह-समृद्ध Podo-प्रिंट '; टी सेल ILPS Podo-प्रिंट की उपस्थिति के लिए जिम्मेदार हैं कि इस बात की पुष्टि) चित्रा 2 डी देखें। एक तरफ देखने (ii। 90 डिग्री प्रोजेक्शन) ILPS (19 से संशोधित) Z इमेजिंग विमान में 3 आयामी फलाव प्रतिनिधित्व करते हैं कि दिखाता है। (बी) के टी सेल TCR (i) और endoth के प्रतिनिधि संवर्धनelial एमएचसी-द्वितीय (द्वितीय) प्रतिरक्षात्मक अन्तर्ग्रथन भीतर, आईएलपी / Podo-प्रिंट करने के लिए असतत subcellular विभाजन दिखा। क्रमश की Podo-प्रिंट और आईएलपी में ICAM -1 और LFA-1 (सी) (i) प्रतिनिधि सह संवर्धन,। (मैं) है के confocal वर्गों के एक 3 डी डिजिटल पुनर्निर्माण 60 डिग्री (ऊपरी पैनल) और 90 डिग्री (; कम पैनल ओर्थोगोनल देखें) घुमाया दिखाता है। (Ii) के चेहरे एन के एक जूम दृश्य दिखाता है। (Iii) (द्वितीय) (19 से संशोधित) में बॉक्सिंग क्षेत्र के एक orthogonal पार के अनुभागीय दृश्य दिखाता है। में Talin (एक integtin / actin के संयोजक प्रोटीन) और actin (iv) प्रतिनिधि सह संवर्धन ILPS है। (डी) में actin के साथ TCR संकेत अणु पीकेसी-क्यू के प्रतिनिधि सह संवर्धन ILPS है। प्रत्येक पैनल एक एन चेहरे दृश्य (निचले बाएं हिस्से) और दो ​​अलग-अलग ओर्थोगोनल विचार (90 ° प्रोजेक्शन) से पता चलता है। अब तक छोड़ दिया और सही पैनल उनके संबंधित पड़ोसी पैनलों की प्रतिकृति उपयोग कर रहे हैं, एक इंद्रधनुष fluorescenc का उपयोग कर अनुमान(19 से संशोधित) ई तीव्रता पैमाने। स्केल सलाखों = 5 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    मूवी 1

    फिल्म 1:। टी सेल कैल्शियम संकेतन का लाइव सेल गतिशील इमेजिंग और रोग प्रतिरक्षण Synapse टोपोलॉजी अन्तःचूचुक झिल्ली YFP व्यक्त और 2 बी चित्रा के लिए इसी शिथिलता के साथ लोड के साथ बातचीत Fura2 से भरी हुई सीडी 4 + Th1 लिम्फोसाइट के समय चूक रहते सेल इमेजिंग। टी सेल में;: वाम पैनल intracellular कैल्शियम का स्तर (गर्म रंग उच्च कैल्शियम शांत रंग, कम कैल्शियम इंद्रधनुष) से ​​पता चलता है। एन्दोथेलिअल एपीसी की सतह पर राइट पैनल दिखाया झिल्ली YFP प्रतिदीप्ति। लिम्फोसाइटों फैल रहा है और आईएलपी गठन आरंभ करने के लिए देखा जाता है (सदस्य-YFP चैनल में फ्लोरोसेंट के छल्ले के माध्यम से देखा के रूप में, यानी, 'Podo-प्रिंट', चित्रा 2Bi देखें) एक निरंतर (30-60 मिनट) intracellular कैल्शियम प्रवाह की प्रेरण द्वारा पीछा किया, TCR / actin के अनुरूप ILPS / Podo-प्रिंट की परिधीय सरणियों के गठन के अनुरूप होता है, जो तलीय बाईलेयर एपीसी मॉडल (चित्रा 2Bii देखें) में देखा जाता है कि 'सूक्ष्म क्लस्टर संकेत'। फ्रेम के बीच अंतराल 20 सेकंड है। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    फिल्म 2

    फिल्म 2: रोग प्रतिरक्षण Synapse टोपोलॉजी छठी का लाइव सेल गतिशील इमेजिंगअन्तःचूचुक के साथ बातचीत अंतर्कलीय APCs। सीडी 4 + Th1 लिम्फोसाइट के समय चूक रहते सेल इमेजिंग (डीआईसी, बाएं) में एक फ्लोरोसेंट संवाददाताओं करने के लिए इसी झिल्ली YFP (हरा) और घुलनशील साइटोसोलिक DsRed (लाल) सह व्यक्त और शिथिलता के साथ भरी हुई चित्रा 2 डी। राइट पैनल डीआईसी, झिल्ली और कोशिका द्रव्य सिगनल के मर्ज से पता चलता है। झिल्ली और cytoplasmic प्रतिदीप्ति के संयुक्त संकेतों संवेदनशीलता कई के गठन और पुर्ननिर्माण की रिपोर्ट ~ आईएलपी उभार के साथ जांच कर रही सरणियों टी सेल से होने वाली 0.2-1 माइक्रोन पैमाने पर सतह invaginations (Podo-प्रिंट)। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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    Discussion

    कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल मैं) understudied शारीरिक APCs के रूप में endothelial कोशिकाओं की जांच के लिए विधियों का वर्णन और ii) 'तलीय सेलुलर एपीसी मॉडल' का एक उपन्यास प्रकार के रूप में। पूर्व करने के लिए सम्मान के साथ, यह तेजी से अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 16-18 आकार देने में (hematopoietic APCs की तुलना में, यानी) परिधीय गैर हिमेटोपोयटिक (या 'स्ट्रोमल') APCs महत्वपूर्ण, गैर बेमानी भूमिका निभाते हैं कि सराहना की हो गई है। जैसे 'अर्द्ध पेशेवर' APCs, नाड़ी और (बेहद पेशेवर APCs संख्या से बढ़ना है) लसीका endothelial कोशिकाओं के बीच सबसे अच्छा 16-18 सराहना शामिल हैं। हालांकि, संकेत घटनाओं के विवरण और उनके युग्मित प्रतिरक्षाविज्ञानी synapses काफी हद तक uninvestigated रहते हैं। इस के साथ साथ वर्णित विधि इस उभरते क्षेत्र में समझ को आगे बढ़ाने के लिए एक आधार प्रदान करते हैं। उदाहरण के लिए, अलग adaptiv प्रदर्शन करने के लिए जाना जाता है कि विभिन्न ऊतकों से एन्दोथेलिअल पर गठित आईएसएस के अध्ययन के लिए इन तरीकों को लागू करनेई प्रतिरक्षा समारोह (जैसे, जिगर और लसीका endothelia) विशेष रूप से शिक्षाप्रद हो सकता है।

    गौरतलब है कि इस विधि अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के बुनियादी तंत्र से पूछताछ करने की क्षमता को बढ़ाने के क्रम में पेशेवर APCs और कृत्रिम एपीसी सब्सट्रेट मॉडलों के बीच की खाई को पाटने में मदद करता है। तलीय (यानी, लिपिड bilayers, एंटीबॉडी लेपित ग्लास) एपीसी substrates जबकि, इस तरह के मॉडल स्वाभाविक सीमित हैं (कई महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि 7,11-14 करने के लिए नेतृत्व किया है) इष्टतम इमेजिंग प्रदान करते हैं। वैकल्पिक रूप से, शारीरिक सेल सेल स्कैनिंग गतिशीलता का ब्यौरा इस प्रकार अब तक गहराई से उन्मुखीकरण से संबंधित इमेजिंग मुद्दों 8-10 से छिप कर दिया गया है। वर्तमान दृष्टिकोण में प्रदान की इमेजिंग क्षमताओं विशिष्ट अन्यथा undetectable तीन आयामी subcellular वास्तुकला और एक शारीरिक एपीसी-टी सेल इंटरफेस का तेजी से पुनर्गठन प्रकट करने के लिए इस बाधा को दूर। प्रतिजनी signalin की नई समझ के लिए ये प्रस्ताव को संभावितजी।

    उदाहरण के लिए, टी कोशिकाओं (जैसे, चित्रा 2 डी, चित्रा 3) TCR, actin और संकेतन अणुओं के साथ समृद्ध ILPS कि फार्म सराहना इन संभावना सूक्ष्म समूहों संकेत तलीय TCR करने के लिए 3-आयामी काउंटर भागों पर मनाया शारीरिक प्रतिनिधित्व सुझाव है कि कृत्रिम एपीसी 6,7,12-14,29-31 substrates। यह शारीरिक सेटिंग्स के तहत, लिम्फोसाइटों बढ़ाना कि 'signalosome'-जैसे गुणों के साथ असतत subcellular' 3 डी-प्रतिक्रिया की मात्रा 'के रूप में ILPS रोजगार और महत्वपूर्ण अणुओं / गतिविधियों 32,33 ध्यान केंद्रित करके संकेत बनाए रखने सकता है कि निकलता है। इसके अतिरिक्त, स्थलों पर महत्वपूर्ण बायोमैकेनिकल आदानों (यानी, सेल सेल बल आवेदन) की उपस्थिति एपीसी के खिलाफ आईएलपी फलाव इमेजिंग से अनुमान लगाया जा सकता है। यांत्रिक बलों के तेजी से प्रतिजनी सिगनल की महत्वपूर्ण facilitators के रूप में देखा जाता है के रूप में ठीक कैसे इस तरह की ताकतों रहे हैं, जबकि यह nontrivial हैप्रकट 14,34-37 अस्पष्ट बनी हुई है।

    पेशेवर APCs के लिए एक उचित किराए के रूप में इस मॉडल के समग्र प्रासंगिकता समान आईएलपी सरणियों अनुरूप इमेजिंग दृष्टिकोण कार्यरत थे जब (बी कोशिकाओं और एक हद तक कम करने के लिए) ईसीएस और DCS पर गठित synapses में देखा जा सकता है कि हमारे प्रत्यक्ष प्रदर्शन के द्वारा समर्थित है (उदाहरण के लिए , एक ही प्रतिदीप्ति निर्माताओं और आईएस विमान उन्मुखीकरण विमान 19) के नियंत्रण का उपयोग करें। बहरहाल, यह पेशेवर एपीसी झिल्ली सतहों बनाम चुनाव आयोग के रिश्तेदार biomechanical गुणों अज्ञात हैं और यह कि इस पैरामीटर में मतभेद है और टोपोलॉजी प्रतिजनी प्रतिक्रियाओं के विवरण को प्रभावित कर सकता है कि विचार किया जाना चाहिए।

    यहाँ बताया दृष्टिकोण की कुंजी अपने संकल्प लाभ के लिए दृढ़ता से संबंधित है। यह, बारी में प्रतिदीप्ति सिग्नल की शक्ति को अत्यधिक संबंधित है। इस प्रकार, यह fluores की अभिकर्मक और धुंधला अनुकूलन में विशेष ध्यान देने के लिए महत्वपूर्ण हैप्रतिशत पत्रकारों और इमेजिंग मापदंडों / तकनीक (उदाहरण के लिए, जोखिम समय, ध्यान, आदि ...)। पूर्व करने के लिए सम्मान के साथ, यहाँ वर्णित है कि लिव-सेल के अध्ययन के लिए प्रोटोकॉल, सामान्य झिल्ली और वास्तविक समय में टी सेल-एपीसी इंटरफेस में topological परिवर्तन (जैसे, चित्रा 2, सिनेमा एक रिपोर्ट है कि साइटोप्लास्मिक मार्कर का अभिकर्मक के लिए सीमित कर रहे हैं 2)। साथ ही, इस प्रोटोकॉल आसानी अन्तःचूचुक (में समन्वित रूप से शुरू / इमेजिंग आगे संवाददाताओं से अधिक परिष्कृत विश्लेषण के लिए संशोधित किया जा सकता जैसे, फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग MHCI / द्वितीय और संकेत और biomechanical के लिए आसंजन, सह उत्तेजक और सह निरोधात्मक अणुओं और biosensors गतिशीलता)। दुर्भाग्य से, हालांकि, एक सामान्य सीमा लिम्फोसाइट कुख्यात transfect करने के लिए मुश्किल हो रहा है। इस फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीना सेल इमेजिंग के लिए टी कोशिकाओं में (जैसे, TCR के लिए टैग, पीकेसी-क्यू, आदि) के सुविधाजनक उपयोग अलग करता है।

    जबकिवर्तमान प्रोटोकॉल शिथिलता (एक व्यापक रूप से इस्तेमाल मॉडल) के माध्यम से मानव प्रेरक / स्मृति सीडी 4 + Th1 प्रकार लिम्फोसाइटों के सक्रियण शामिल है, बहुत व्यापक संभावनाएं मौजूद हैं। पहले से 19,20 प्रदर्शन के रूप में इस दृष्टिकोण इस तरह के अन्य सीडी 4 + कैंपेन्स और सीडी 8 + लिम्फोसाइट हत्या प्रतिक्रियाओं के सक्रियण की प्रतिक्रियाओं के रूप में अन्य सेटिंग्स की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए आसानी से अनुकूल है। मौजूदा TCR ट्रांसजेनिक तनाव से लिम्फोसाइट और endothelial कोशिकाओं के अलगाव के माध्यम से इस विधि विशिष्ट पेप्टाइड एंटीजन 19,20 करने के लिए प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए भी आसानी से अनुकूल है। अंत में, वर्तमान दृष्टिकोण प्रेरक / स्मृति टी कोशिकाओं की परीक्षा तक सीमित है। हालांकि, आवश्यक सह उत्तेजक अणु (CD80 / 86, सामान्य रूप से अन्तःचूचुक पर व्यक्त नहीं) इस मॉडल में भोले सेल भड़काना गतिशीलता के अध्ययन के लिए अनुमति दे सकते हैं साथ endothelial कोशिकाओं के अभिकर्मक।

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BD Vacutainer stretch latex free tourniquet BD Biosciences 367203
    BD alcohol swabs BD Biosciences 326895
    BD Vacutainer Safety-Lok BD Biosciences 367861 K2 EDTA
    BD Vacutainer Push Button Blood Collection Set BD Biosciences 367335
    RPMI-1640 Sigma-Aldrich R8758-1L
    Ficoll-Paque Sigma-Aldrich GE17-1440-02 Bring to RT before use
    FCS-Optima Atlanta Biologics s12450 Heat inactivated
    Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4458-100ML
    Trypan blue Sigma-Aldrich T8154-20ML
    staphylococcal enterotoxin B Toxin Technology BT202RED Stock solution 1mg/ml in PBS
    toxic shock syndrome toxin 1 Toxin Technology TT606RED Stock solution 1mg/ml in PBS
    human IL-15 R&D Systems 247-IL-025 Stock solution 50ug/ml in PBS
    PBS Life Technologies 10010-049
    Fibronectin Life Technologies 33016-015 Stock solution 1mg/ml in H20
    HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells Lonza CC-2543 Other Human Microvascular ECs can be used, i.e. HLMVECs
    EGM-2 MV bullet kit Lonza CC-3202
    Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T-4174 Stock solution 10x, dilute in PBS
    amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit Lonza vpb1003 Required Kit for step 4
    IFN-g Sigma-Aldrich I3265 Stock solution 1mg/ml in H20
    TNF-alpha 10ug, human Life Technologies PHC3015 Stock solution 1mg/ml in H20
    phenol Red-free HBSS Life Technologies 14175-103
    Hepes Fisher Scientific BP299-100
    Calcium Chloride Sigma-Aldrich C1016-100G Stock solution 1M in H20
    Magnesium chloride Sigma-Aldrich 208337 Stock solution 1M in H20
    Human Serum albumin Sigma-Aldrich A6909-10ml
    Immersol 518 F fluorescence free Immersion oil Fisher Scientific 12-624-66A
    Fura-2 AM 20x50ug Life Technologies F1221 Stock solution 1mM in DMSO
    pEYFP-Mem (Mem-YFP) Clontech 6917-1
    pDsRed-Monomer (Soluble Cytoplasmic DsRed) Clontech 632466
    pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed) Clontech 632512
    pEGFP-Actin Clontech 6116-1
    Alexa Fluor 488 Phalloidin Life Technologies A12379
    Formaldehyde solution 37% Fisher Scientific BP531-500 Toxic, use fumehood
    Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-5ML
     Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-70C
    Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-49A 
    Falcon Tissue Culture Treated Flasks T25 Fisher Scientific 10-126-9
     Falcon Tissue Culture Treated Flasks T75 Fisher Scientific   13-680-65
     Corning Cell Culture Treated T175 Fisher Scientific 10-126-61 
    Glass coverslips  Fisher Scientific 12-545-85  12 mm diameter
     Falcon Tissue Culture Plates 24-well Fisher Scientific 08-772-1
    Delta-T plates Bioptechs 04200415B
    Wheaton Disposable Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-8D
    1.5 ml Eppendorf tube  Fisher Scientific 05-402-25
     ICAM1 mouse anti-human BD Biosciences 555509
    HS1 mouse anti-human BD Biosciences 610541
    Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Purified ebioscience BMS102
    Anti-Human CD3 Alexa Fluor® 488 ebioscience 53-0037-41
    Anti-MHC Class II antibody  Abcam ab55152
    Anti-Talin 1 antibody Abcam ab71333
    Anti-PKC theta antibody  Abcam ab109481
    phosphotyrosine (4G10 Platinum) Millipore 50-171-463
    Nucleofector II Amaxa Biosystems Required electroporator for step 4
    Zeiss Axiovert Carl Zeiss MicroImaging
    Zeiss LSM510  Carl Zeiss MicroImaging
    Zeiss Axiovison Software Carl Zeiss MicroImaging
    NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet NuAIRE Nu-425-600
     Forma STRCYCLE 37 °C, 5% CO2 Cell culture Incubator Fisher Scientific 202370
    Centrifuge 5810 Eppendorf EW-02570-02
    Hemocytometer Sigma-Aldrich  Z359629 Bright-Line Hemocytometer
    Isotemp Waterbath model 202 Fisher Scientific 15-462-2

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    References

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    इम्यूनोलॉजी अंक 106 रोग प्रतिरक्षण अन्तर्ग्रथन टी सेल रिसेप्टर प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल लिम्फोसाइट प्रतिजन सेल अन्तःचूचुक संकेत कैल्शियम actin इमेजिंग अनुकूली प्रतिरक्षा पलायन
    इमेजिंग रोग प्रतिरक्षण Synapse गतिशीलता के लिए एक endothelial Planar सेल मॉडल
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    Martinelli, R., Carman, C. V. AnMore

    Martinelli, R., Carman, C. V. An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics. J. Vis. Exp. (106), e53288, doi:10.3791/53288 (2015).

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