Abstract
適応免疫は、T細胞と抗原提示細胞（「APCの '）との間の動的な相互作用によって調節される「免疫学的シナプス」と呼ばれます。これらの親密な細胞間のインタフェース内の個別のサブセルラーMHC / AgをTCRのクラスター、F-アクチン、接着およびシグナル伝達分子を形成し、急速に改造。これらのダイナミクスは、病理学的免疫対開発し、したがって、保護の免疫応答の効率と品質の両方の重要な決定要因であると考えられています。生理学的なAPCとの免疫学的シナプスの現在の理解を得ることができる画像解像度の不足によって制限されます。人工基質モデル （例えば、平面脂質二重膜）は、優れた解像度を提供し、非常に貴重なツールとなっているが、彼 らは本質的に非生理学的および単純化し過ぎています。血管とリンパ内皮細胞は重要な末梢組織（または間質）として出現した「半専門職のコンパートメントアルのAPC」。 （プロフェッショナルAPCの分子機構のほとんどを発現する）これらのAPCは、事実上平面状細胞表面を形成するユニークな機能を持っており、（蛍光タンパク質レポーターで、 例えば ）は、容易にトランスフェクトされています。基本的な抗原性シグナル伝達プロセスの改善されたイメージング及び質問のための新規な及び生理的な「平面セルラーAPCモデル 'に説明するように内皮細胞を実装するために、本明細書の基本的なアプローチ。
Introduction
Tリンパ球は、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）に結合した、効率的ペプチド抗原（銀）を認識する能力を特徴と適応免疫系の分岐であるが、それらのT細胞受容体（TCR）を介して1分子。ナイーブリンパ球恒常移行し、「プロのAg提示細胞」（APCは、 例えば 、樹状細胞）をスキャンするメモリ/エフェクターT細胞が効果的に末梢組織内のAPCおよび潜在的な標的細胞の非常に広い範囲を調査する必要がある一方で、リンパ節内。
APC上の同族銀の当初認識以下分では、リンパ球は、それらの移動を阻止し、（IS）「免疫シナプス」と呼ばれる特殊な親密な細胞間のインタフェースを形成し始めます。持続（ すなわち 、30〜60分）は接点が増幅し、2-7のシグナリング維持する必要がありますされています。新興の研究では、IS内、それが連続形成し、迅速なRであることを識別強度および免疫応答2-7を得られるの品質を決定する（ すなわち 、MHC / AgをTCR、F-アクチン、接着およびシグナル伝達分子を含む）は、離散サブ細胞シグナルマイクロクラスタemodeling。しかし、このプロセスの動的な詳細及び調節機構は不完全に理解されている8,9。これは、APC表面の不規則なトポロジーに関連する技術的な課題や細胞間相互作用面のコントロール不良の向き、深く必要な時空間イメージングは8月10日 （Figure1A）に近づく制限の問題から大きく茎。
イメージング免疫学的シナプスのダイナミクスについては、図1のA生理学的平面内細胞APCモデル。概略的には、T細胞とprofessio間の免疫学的シナプスの伝統的なイメージングを示しています最終APC（A）とT細胞とこの新規内皮平面APCモデル（C）と比較して、従来の平面脂質二重層APCモデル（B）。プロフェッショナルAPCは、生理学的、免疫学的シナプスを提供するが、不十分指向細胞間のインタフェースを提供（最適なX-Yの撮像面に対してすなわち 、;解像度〜0.2μm）で、劇的空間（Zの撮像面〜1μmの分解能）および時間的（ すなわち 、妥協します繰り返しイメージングのすべてのzイメージングプレーン）の解像度をスキャンする必要性に起因します。二層モデルは、最適な時空間分解能イメージングを提供する平面のトポロジーを持っているだけでなく、高度に簡略化された非生理学的な剛性です。この内皮細胞モデルは、生理学的な設定で最適な空間と時間的画像の解像度を提供するために、古典的なAPCの生理学的基質と脂質二重層の平面トポロジを兼ね備えています。M /ファイル/ ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
以前の研究は、部分的に最適なXYイメージングに平行である、単一の計画に、T細胞活性化の面を固定経由で最適な時空間解像度（ すなわちを提供し 、平面基板モデル（ すなわち 、脂質二重層と抗体被覆表面）、開発することによって、これらの障害物を回避していますプレーン）11-15（ 図1B）。これらのモデルは、動的なアクチン/ TCRシグナリングマイクロクラスター7,11-14の発見を含むT細胞における抗原性のシグナル伝達を制御する分子/細胞内動態に重要な洞察を容易にしました。しかし、このようなモデルは、本質的に単純化されるだけでなく、剛性（ 図1B）（3次元位相幾何学的特徴の開発/研究を排除）。したがって、PHYに、このような調査結果を関連付ける方法を依然として不透明siologic細胞 - 細胞免疫監視。
まだunderstudiedものの、血管やリンパ管の内皮細胞は、「セミプロ」のAPC 16-18の大（ すなわち 、〜1000倍により、すべてのプロフェッショナルAPCより数の大きい）周辺の区画として浮上しています。これらの細胞は、MHC-I、MHC-II-および共刺激分子の多数を表現（例えば、CD40、LFA3、ICOSL、4-1BB、OX40L、TL1A、PD-L1;ではなく、CD80およびCD86）と戦略的です彼らは16-18特殊なセンチネル機能を果たし、血液-組織界面に位置します。以前の研究では、内皮細胞が効果的にエフェクター/メモリー、しかしナイーブではない、T細胞の19-25を再刺激することができることを実証しました。従って、内皮細胞は、T細胞の活性化、分化、メモリーと寛容16,17,26のローカル影響などの末梢組織中での適応免疫応答のエフェクター相に固有のAPCの役割を果たしている可能性があります。 CRIin vitroで増殖させた場合tically、 内皮細胞は、実質的に平面状のセル表面を形成し、（蛍光タンパク質レポーターを用いて、 例えば、）容易にトランスフェクトされています。これらの機能は、細胞間相互作用19,27の間の位相幾何学的力学の高時空間分解能イメージングに最適です。従って、内皮細胞は、抗原認識を駆動し、応答（ 図1C）19,20 を制御する細胞内分子/改造メカニズムの研究のための明らかに適した生理的な「平面携帯APC」モデルとなる恐れがあります。
接着および経内皮移動27中の白血球-内皮相互作用の詳細を研究するための（形質膜と細胞質ゾルの蛍光タンパク質メーカーと内皮細胞のトランスフェクションを含む）以前に確立された補完的なイメージング技術は、白血球が積極的にダイナミックによって内皮の表面を探査することを示しました挿入ANサブミクロンスケールのd後退は、アクチン豊富な円筒状の突起が（〜直径、深さ200〜1,000 nm）をinvadosome状突起（ すなわち 、「ILPS '）27,28と呼ばれます 。これらのイメージング手法は、さらに19,20を報告し、本明細書でさらに説明するように、T細胞、内皮免疫学的シナプスの高時空間分解能イメージングのための最初の方法を開発する内皮APC機能を利用するためのプロトコルの作成 に伴って拡張されました。この小説平面携帯APCモデル由来中央知見は、T細胞ILPSは、初期のAg検出を促進する上で、その後のシグナル伝達を維持するには、両方の機能することです。実際、（安定化およびカルシウム流入初期に応じて計上されていた）、TCRと活性なシグナルなどのPKC-Q、ZAP-70、ホスホチロシンとHS1の示唆に富む分子でshow濃縮を複数ILPSの配列。したがって、ILPSは、TCRシグナルマイクロへの3次元生理学的同等を表しているように見えます平面二重層モデルで見られたクラスタ。このアプローチは、このように、敏感に明らかに/レポート分子と建築（および生体力学的暗黙の）ダイナミクスそうでなければ検出できません。
本明細書に記載の方法は、適応免疫応答の基本的なメカニズムを調べるために我々の能力を向上させるために、プロのAPCと人工APC基板モデル間のギャップを埋めるに有用であるはずです。ここでの焦点は、CD4 + Th1型エフェクター/メモリー細胞の活性化にある間に、以下に説明するように、この基本的なアプローチは、容易に、T細胞型とのAgの広い範囲を研究するために改変することができます。
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Protocol
このプロトコルで説明されているすべての実験は、初代ヒトT細胞および市販の一次ヒト内皮細胞（皮膚や肺の微小血管のEC）を用いて実施されているヒトを対象とする.ANY研究プロトコルは、治験審査委員会によって承認されなければならず、書面によるインフォームドコンセントから提供されなければなりません各血液ドナー。このプロトコルを使用して行った実験は、ベス・イスラエル・ディーコネス医療センターのIRBによって承認されました。
ヒトCD4 +のTh1エフェクター/メモリーT細胞の準備1
- アルコールで静脈を拭く、ドナーの腕に止血帯を適用し、針を挿入します。ゆっくりと抗凝固剤としてEDTAを用いて真空採血に15mlの血液を描画します。血液が描画された場合には、針を取り外す前に止血帯をほどきます。すぐに針が除去されると、滅菌ガーゼで創傷に圧力を加えます。
- 50mlのチューブに血液を移します。 1希釈（最終容量30ミリリットル）：1で、RTでRPMI-1640を追加します。慎重に希薄オーバーレイこのような室温でフィコール・パックとしてプレフィルタリンパ球分離培地15 mlを含む2 50mlチューブへのD血。
- スイングバケットローターで1200×gで30分間室温で勾配を遠心します。遠心分離しながら、T細胞培地（RPMI-1640を500ml、50mlのFCS、5 mlのペニシリン/ストレプトマイシン）を調製。
- 遠心分離機から50 mlチューブを除去すると、四層を観察：赤血球のペレットを底部に、Paqueを、白血球（リンパ球を含む）細胞および血漿を含んでいる細胞の層を。慎重に50ミリリットルファルコンチューブ内のパスツールピペットや転送に白血球層を除去。
- （20 mlまで）RT RPMI-1460を添加し、1200×gで5分間、室温で遠心分離することにより白血球層を洗浄します。 T細胞を培地1ml中の白血球を再懸濁します。 1.5ミリリットル遠心管に250μlのT細胞培地に1ミリリットルの細胞懸濁液の5μLを加え、穏やかに上下にピペットで混ぜます。
- 25μlの希薄を追加25μlの0.4％トリパンブルーのD細胞懸濁液。標準血球計数器の各側に液10μlを追加。
- 低消費電力の光顕微鏡で血球計数器を置きます。 10倍の対物レンズを使用すると、トリパンブルー色素を除外し、血球計数器の両側の中央広場に存在している生きた細胞の数を数えます。
- 細胞濃度を計算するために、100（希釈係数）により2乗の平均値を乗算し、その後乗算による10 4細胞 / mlの数を与えます。
- T細胞培地中の0.5×10 6細胞/ mlの最終濃度を調整します。 1 / mlの細胞へのエンテロトキシンB（SEB）および毒素性ショック症候群毒素1（TSST）、ブドウ球菌細菌性スーパー抗原のそれぞれの最終濃度を追加します。 CD4 + T細胞集団を拡大するための72時間の培養（37℃、5％CO 2）。
- とT細胞の培地中の0.5×10 6細胞 / mlでT細胞ペレット（1200×gで、5分間）し、再懸濁ヒトIL-15（20 ngの/ ml）を添加します。転送は、T150フラスコにリンパ球。その後、必要に応じて（ すなわち 、メディアはわずかに黄色にピンクから変わるたびにメディアの色に基づいて）/すべての24〜48時間をフルで分割細胞中IL-15を拡大し続けます。最大15日間の結果リンパ球集団を維持します。
注：設計では、このプロトコルは、具体的には、SEBおよびTSSTに反応性があり、その後、Th1様エフェクター/メモリー表現型に向かってそれらを駆動する CD4 + T細胞のサブセットを活性化し、拡大していきます。他の白血球細胞が生存し、直ちにフローサイトメトリーによって評価することができるように、ステップ1.10によって細胞は、少なくとも95％CD4 +、CD45RO + T細胞19となるように、これらの条件下で増殖することができません。所望の場合、さらなる精製は容易に市販の抗体/磁気ビーズベースの陽性または陰性選択キットを介して達成することができます。
2.初代ヒト内皮細胞の培養を開始
<オール>3.一般的な分割および内皮細胞の増殖
- 〜90-95コンフルエントに細胞を増殖させます。これは、2-5日かかる場合があります。分割については、メディアを取り出し、PBSですすいでください。 PBSを削除し、新鮮な1×トリプシンの最小容積（T25 0.5 mlまたはT75 1.5 ml）で置き換えます。ゆっくりトリプシンですべての表面を覆うように渦。 37でインキュベートします 〜5分間℃です。低消費電力の光顕微鏡を用いてプレートからの細胞の剥離を監視します。
- 細胞の大部分は、丸みを帯びまたは切り離し、（追加されたトリプシン量に比べすなわち、）5ボリュームを追加あらかじめ温め完全EGM-2培地と穏やかにすべての細胞を剥離するために、フラスコの表面にピペットの表示された場合。
- 1.6から1.7に記載されているように血球計数器で内皮細胞を数えます。遠心分離（5分、1200 XG）により細胞をペレット化。上清を取り除きます。予め温めておいた完全EGM-2 MVメディアの添加によってミリリットルにつき0.5百万個の細胞の濃度を調整します。
- メンテナンスのために適切なFNコートしたディッシュまたはフラスコに細胞のアリコートを転送します。ゆっくり旋回し、インキュベーターに置きます。メッキの6〜12時間以内にメディアを変更します。メディア翔48時間ごとに、その後約変更することがULD。
4.内皮細胞のトランスフェクション
注：一次内皮細胞は、最も一般的な化学的および電気穿孔法によるトランスフェクションに難治性です。以下で説明するの核トランスフェクションベースの方法は、比較的高いトランスフェクション効率（〜50〜70％）を可能にします。効果的な代替方法は、適切なウイルスベクター（材料表中のコメントを参照のこと）による感染の使用です。
- （のための滅菌条件のいずれかのようなデルタTプレートとして顕微鏡培養プレートで、PBS中のフィブロネクチン（FN）20ug / mlの90％〜95％のconfluency.Coatの最終密度にHLMVECsまたはHDMVECsのT25やT75フラスコを（必要に応じて）準備（2.1）上記のようにして）、ステップ6のための24ウェル細胞培養プレート（ウェルの内部に配置され、ステップ5）または12 mmの円形のカバーガラス。
- 各24ウェルに顕微鏡文化への完全EGM-2培地1mlのplatesor 0.5ミリリットルを加え、プレートを平衡化で加湿37℃/ 5％CO 2インキュベーター。
- 収穫し、室温で5分間1200×gで細胞（サンプル0.5万個の細胞）の必要容量3.1-3.3.Centrifugeのステップのように内皮細胞をカウントします。サンプルあたり100μlのRT核トランスフェクション溶液中で慎重に細胞ペレットを再懸濁します。
- 1-5μgのDNAを100μlの細胞懸濁液を組み合わせます。認定されたキュベットに細胞/ DNA懸濁液を移します。サンプルは、気泡なしキュベットの底をカバーしなければなりません。
注：（翻訳後のパルミトイル化のための信号が含まれているニューロモジュリンのN末端 の20アミノ酸を介して）細胞膜にYFPかのDsRedをターゲットに構築物（単独膜-YFP単独膜のDsRed）を単独で使用されたかで同時トランスフェクト細胞質容積マーカー（ 例えば、膜 -YFPおよび可溶性のDsRed）。蛍光タンパク質マーカーの多くの順列を使用することができます。 - キャップでキュベットを閉じます。キュベットを挿入エレクトロのキュベットホルダへの細胞/ DNA懸濁液とエレクトロポレーションプログラムS-005を適用します。プログラムが終了したら、ホルダーからキュベットを取ります。
- キュベットに予め平衡化培地の〜500μLを加え、穏やかに核トランスフェクションキットに付属のプラスチック製のトランスファーピペットを用いてキュベットから細胞懸濁液を除去します。
- 顕微鏡培養プレートを用いた実験のために均等に予熱した培地を含有する2皿（ステップ4.2から4.3）の間に1つの反応から細胞懸濁液を分割。 24ウェル/プレート、パーティション3つのウェルとの間にも同様に一つの反応を用いた実験のために。
- 加湿37℃/ 5％CO 2インキュベーター中で細胞をインキュベートし、メディアに4-6時間を変更し、再び12〜16時間トランスフェクション後に。
5.ライブセルイメージングと分析
- 内皮の準備
- 0日目：膜-YFPおよび可溶性のDsRedとの同時トランスフェクト一次HLMVECs nucleofe経由ction技術生細胞イメージング培養プレートにステップ4と板で説明したように。
- 1日目：MHC-IIの発現を誘導するために、IFN-γ（100 ngの/ ml）を含む新鮮な培地で培地を交換してください。 2日目には、既存のメディアへの20 ngの/ mlのTNF-αを添加することによりトランスフェクトされた細胞を刺激します。
- 3日目に、1 / mlの細菌性スーパー抗原ブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）および毒素性ショック症候群毒素1（TSST）のそれぞれ37時と内皮をインキュベート 実験の直前に30〜60分間℃です。 「-Ag「制御条件について、このステップを省略します。
- リンパ球の準備
- 5.1.3ステップと並行して、緩衝液A（フェノールレッドを含まないHBSS）を20mMのHepesを補充した調製液、pH7.4および0.5％v / vのヒト血清アルブミン37に予め温め °C。培養リンパ球のサンプルを取り、血球計数器（ステップ1.12から1.17）でカウントすることにより、密度を決定します。
- 遠心1の検体につき2万個の細胞、15ミリリットルコニカルチューブ中で室温で5分間、200×gで。静かに吸引し、メディアとは何の細胞クラスターが残っていないように緩衝液Aの2ミリリットルに細胞ペレットを再懸濁します。
- 1 mMのストック濃度を作るためにDMSOにフラ-2カルシウム色素および再懸濁の新鮮なアリコートを削除します。
- （2μM最終濃度）のT細胞懸濁液にフラ-2原液の2μlを添加し、チューブをキャップし、染料の均一な分散を確保するため、チューブを反転させてすぐに混ぜます。 37でインキュベートします 30分間°C。
- ステップ5.2.2のように遠心します。吸引除去バッファ-Aと穏やかに、しかし完全には新鮮な緩衝液Aの20〜40μlのリンパ球を再懸濁します。
- ライブセルイメージングの設定と取得
注：システムの多種多様な直立および反転光顕微鏡上で生細胞の蛍光イメージングのために使用することができます。基本的な要件は、蛍光光源、フィルター、CCDカメラ、電動フィルター切替及びシャッター、加熱ステージ（またはmicroscを含みますOPE-マウント加熱室）および自動化された画像取得のためのソフトウェア。このプロトコル高い開口数は、高倍率（ すなわち 、40X、63X）油浸レンズは、必要な空間分解能を達成するために必要とされます。特別な注意は、すべてが必要な340/380 nmの励起波長に対応しているようフラ-2ベースのカルシウムイメージングのための適切な蛍光源とレンズを選択する際に注意する必要があります。 （標準緑と赤の蛍光フィルターセットと互換性のある）別のアプローチは、非ratiomenticカルシウム感受性色素を用いて使用することができる（例えば、フルオ4、Rhod-3）、これらは正確にカルシウムフラックスを定量だけ相対を提供することはできませんけれども/定量的な読み出し。- 顕微鏡システム（操作用PC、顕微鏡、CCDカメラ、フィルターホイールやキセノンランプ）をオンにします。
- 指定されたソフトウェアを開きます。
- 自動化されたマルチチャンネルタイムラプスイメージングのための顕微鏡/ソフトウェアをセットアップします。広告の逐次取得を含めますifferential干渉コントラスト（DIC）、標準緑色蛍光、標準赤い蛍光を発すると、標準的な340および380 nm励起のFura-2画像。 10〜30秒、〜20〜60分の合計時間の取得のための間隔を設定します。
- フラ-2画像の露光時間を設定します。
- 新鮮な目的のオイルを追加し、加熱ステージアダプタ上にバッファ-Aのわずか0.5 mlを含む顕微鏡皿をマウントし、すぐに37に平衡オン ℃（〜2〜3分かかります）。
- 20μlのピペットを使用してマウント顕微鏡皿室にFURA2ロードされたリンパ球を休んで追加します。
- 明視野画像をオンにします。接眼レンズへの光路を選択します。 miscoscope皿の底に接触さの目的を持って来るために粗いフォーカスノブを使用します。皿の底に沈降したT細胞に集中する接眼レンズと微フォーカスノブを使用してください。
- 少なくとも10個の細胞を含むフィールドを選択するために、XYステージコントロールを使用します。避けるこれらのようなオーバー混雑フィールドおよび細胞凝集塊は、画像アーチファクトが作成されます。
- 蛍光光源に明視野から切り替えます。 CCDカメラに接眼画像から切り替えます。設定取得パラメータ（例えば、露光時間、検出器利得及びビニング）。 Fura2-340とFura2-380画像を休んで、ソフトウェアの取得を使用して（通常〜200〜1,000ミリ秒の範囲で、それぞれに対して同一の露光時間で始まります）。
- 各リンパ球のためFura2-340 / Fura2-380を計算するステップ5.4.1で説明した方法を使用してください。平均値は1に近いまで、Fura2-340とFura2-380露光時間を調整する画像を取得し、比率を計算する繰り返し反復を実行します。
- MEM-YFPとのDsRedのための露光時間を設定します。
- miscroscope皿とステップ5.3.3.1で使用される顕微鏡皿を交換することは、トランスフェクトされた活性化したサグが治療（または未処理;コントロール）を含む細胞培養インキュベーター（ステップ4.5からHLMVECsまたはHDMVECs。1）。予め温めておいたバッファ-Aの〜1ミリリットルの添加により1時間をすすぎ、急速にメディアを削除するには、使い捨てのトランスファーピペットを使用してください。その後吸引し、バッファー-Aの0.5ミリリットルを追加します。
- 明るい蛍光陽性のトランスフェ内皮細胞が存在し、整形式間接合部との健全表示されるフィールドを特定します。
- MEM-YFPとのDsRedの取得パラメータ （例えば、露光時間、検出器ゲインとビニング）を調整します。各チャネルの平均蛍光シグナル強度が25％と、検出器のダイナミックレンジの75％の間にあることを確認してください。
- フラ-2画像の露光時間を設定します。
- 生細胞イメージング実験を行います。
- 画像の取得を開始し、ベースラインを確立するために、画像のいくつかの間隔をキャプチャするために自動化されたソフトウェアを使用してください。
- 取得中に少量（P-5の先端を挿入することにより、顕微鏡皿撮像領域の中心に（ステップ5.2から）の濃縮のFura-2を負荷したリンパ球の〜5μLを適用またはP-20）ピペットゆっくり目的と噴出の中心部に近いメディアへ。
- リンパ球は、撮像フィールドに落ち着くように、T細胞、内皮細胞インターフェイス（免疫学的シナプス）ことを保証するために焦点の微調整を行う焦点面に保持されます。 40および63X目的で、フィールドあたり〜10-20細胞が最適です。少数の細胞は、イメージング分野の繰り返しステップ5.3.4.2で認められた場合。
- 実験の所望の観察間隔が出場した後、撮影を続けると、すぐに最大のカルシウムフラックス/フラ-2シグナリング信号を誘導するために2μMの最終濃度になるように（5.3.4.2のような技術を使用して）miscoscope皿に直接イオノマイシンピペット（ すなわち 、キャリブレーションの手段は、解析5.4を参照してください。）。
- 実験の所望の観測間隔を5.3.4.4afterするための代替を競っているように、すぐにバッファ-Aを吸引し、で5分間0.5mlで固定液（PBS中3.7％ホルムアルデヒド）を交換してくださいRTは、PBSで3回洗浄しました。次に、手順6に進みます。
- ライブセルイメージングの解析
注：取得したファイルを保存した後、それらを直接分析してもよいし、オフライン画像解析ソフトウェアアプリケーションの多種多様な分析のためにエクスポートされました。 ImageJが自由に利用できると、ほぼすべての取得ソフトウェアパッケージと互換性があり、特に貴重な、汎用性の高いパッケージです。ステップ5.1から5.3に記載の撮像実験の設計は、同族のSAgの非存在下および存在下でのリンパ球と内皮APCの間の相互作用の高い空間分解能と時間分解能のダイナミクスが得られます。携帯形態計測/シグナリングダイナミクスの撮像データをアドレス指定する際に、ほとんど無限の分析が可能です。この特定のプロトコルに記載されている具体的な目的は、協調ダイナミックとともにリンパ球の移動およびシグナリング（ すなわち 、動態および細胞内カルシウムフラックスのレベル）を定量化するためにありますアルは、特定の機能（ すなわち 、ILPS / podo-プリント）を中心とした免疫学的シナプスのアーキテクチャに変更されます。個別の標準および非標準のもので、以下の例は、分析（ すなわち 、これらの実験/質問のために特別に開発されました）。- リンパ球のカルシウムフラックスを測定
- リンパ球の添加前に取得した初期Fura2-340（340nmのEX-510 nmの EM）とFura2-380（380nmのEX-510 nmの EM）画像を選択します。背景画像としてこれらを使用し、デジタルでそれぞれのチャネルについて時系列の画像のすべてからそれらを引きます。
- 各時点についてバックグラウンドを差し引いたFura2-340とバックグラウンドを差し引いたFura2-380画像（すなわち、340nmのEX-510 nmの EM-背景/ 380nmのEX-510 nmの EM-背景）のデジタル比画像を作成します。
- 適切なソフトウェア描画ツールを選択します。私の円形領域を描画するために、画面上でクリックしてください各リンパ球の周り（ROI）をnterest。これらは、それぞれのリンパ球と時間枠のピクセル平均比の値を生成します。
- 適切なソフトウェアアプリケーション（例えば、スプレッドシートプログラム）を使用して、時間の関数として計算された比をプロットします。フィールド当たりリンパ球の全ての比の値を合計し、各時点でのリンパ球の総数でその値を除算することにより実験の平均カルシウム流束を計算します
- lympocyte移行トラッキング分析を実施します。
- 各ビデオからDICチャンネルを使用して適切な細胞追跡ソフトウェアアプリケーション（例えば、ImageJの）を用いて細胞のT細胞移動を分析します。 ImageJの細胞トラッキングプラグインを使用して、手動で各プログレッシブフレームでそれをクリックすることで、各フレーム内の各セルの重心を識別します。
- O（総距離移行/全区間平均速度を計算するために、結果として得られるシリアルのxy座標（マイグレーション・パスの、すなわち 、トレース）を使用しますf画像）と蛇行（総距離）/最初と最後の画像でセルの場所との間の線形のエンドツーエンドの距離を移動しました。
- カルシウムフラックス（5.4.1）セル単位でダイナミックにこれらのパラメータを相互相関します。
- IS内Podoプリント/ ILP密度を評価
- 各T細胞内に形成されたILPの総数をカウントする定義された間隔（例えば、T細胞の5分後添加）。これらは、リンパ球接着の部位に内皮APC上の細胞質のDsRedにくまで局在同時離散ミクロンスケールの蛍光膜YFPリングを識別することができます。
- セル単位でのカルシウム流を有する得られた「ILPインデックス '（5.4.1）のダイナミクスを相互相関します。
- podoプリント/ ILP寿命を測定します。
- 各podoプリント/ ILPのために与えられた中でILPが表示されていた最後の時間点とその寿命を計算IS - ときにpodoプリント/ ILP Fiの時点をRSTが登場しました。平均ILPは、ISの両方ごとに寿命。
- カルシウムフラックス（5.4.1）セル単位でダイナミックにこれらの有効期間は、クロス相関します。
- 初期ILPの形成とカルシウム流出の間の時間的関係を評価します。
- 各リンパ球のためのカルシウムは、最初のベースライン19より上に上昇する時点（フレーム）を特定します。
- 各リンパ球の最初のpodoプリント/ ILPが表示された時点を特定します。
- 各リンパ球について初期podoプリント/ ILPのことから初期のカルシウムフラックス時点を減算することにより、「時間オフセット」を計算します。フィールドのすべてのリンパ球の値を平均します。正の値は負の数が反対を示しているのに対し、ILPの形成はカルシウム流入の前に示しています。
注：これらの実験は、容易に説明さ1として市販の平行壁流イメージングチャンバーを用いて生理学的に関連する層せん断流の下で行うことができます9。
- リンパ球のカルシウムフラックスを測定
6.固定細胞イメージングと分析
- 固定エンドポイント、T細胞 - 内皮を形成し、染色IS
- 1で述べたように内皮細胞を準備し、T細胞を準備します（ - / +のSAg）ステップ5.1のように（トランスフェクション、ステップ5.1.1はオプションです）。培養リンパ球のサンプルを取り、血球計数器（第1節）でカウントすることにより、密度を決定します。
- 3分間200×gで15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に少なくとも3×10 5リンパ球/サンプルにリンパ球の培養液量相当を転送します。上清を除去し、6×10 5リンパ球/ mlのバッファーA（ステップ5.2.1）の濃度でリンパ球のペレットを再懸濁。
- 細胞培養インキュベーターから内皮細胞を削除し、連続吸引メディアを（一度に1つずつサンプルを進める）およびリンパ球懸濁液（3×10 5リンパ球/サンプル）の0.5mlで置き換えて、37に置き換えます °C、Incubator。
- 適切なインキュベーション時間の後、上述したように、ウェルから培地を吸引し、完全に試料 （例えば、24ウェルプレート中〜300〜500μl）をカバーするために十分な固定液（PBS中3.7％ホルムアルデヒド）を追加します。 5〜10分間室温でインキュベートします。
- PBSでサンプルを3回すすいでください。 RTで60分間一次抗体を添加することにより染色（表を参照）。一次抗体は、細胞内タンパク質に向けられている場合、追加の透過化工程を完全に室温で1分間サンプルをカバーするのに十分な透過液（PBS中0.01％トリトンX-100）を添加することにより行う必要があります。 PBSでサンプルを3回すすいでください。 RTで60分間、適切な二次抗体（場合によっては同時に蛍光ファロイジン）を追加します。
- 画像スライド上の円形ガラスカバースリップをマウントします。固定エンドポイント、T細胞 - 内皮を形成し、染色されています。顕微鏡ステージ上のサンプルを含むイメージングスライドイメージング場所を開始し、63X油を選択するには目的。新鮮な液浸油を適用します。
- 焦点面を見つけるために、明視野撮像モードと接眼レンズを使用してください。落射蛍光に切り替えて、接眼レンズを介して、サンプルを検査します。興味のある分野を選択します。レーザースキャンモードに切り替えます。
- 個別に高速走査モードを使用し、可能な最も広い分野での作業は、理想的には、特定の信号強度が少なくとも〜25％、およびダイナミックレンジのない75％以上に達するような信号を最適化するために、各チャンネルのレーザパワー及びゲインを調整します検出器の。
- マニュアルフォーカスコントロールを使用して、すぐに（通常は全ての情報のは〜15μmの厚さの中に含まれるべきである）、Z軸をスキャンし、切片の上限と下限を特定します。 〜0.2〜1.0ミクロンの範囲内のZ軸切片厚を選択します。
- 最後に、ズーム/関心や行動のスキャンの特定の領域に撮像領域をトリミング。非常に明るく、特定の蛍光SIを有することに加えてサンプル中gnal、高解像度の3Dイメージングを取得するスキャンの反復を必要とし、取得パラメータの調整を行います。目的は、かなりの光退色することなく、最大のx-y、z軸の解像度を得ることです。
- 定性的に適切なソフトウェアアプリケーション（例えば、画像j）を介して得られた光学切片のデジタル3D再構成を行うことにより、ISの3次元トポロジーのトポロジーを分析します。同様のアプリケーションを介して定量的に蛍光シグナルの分布を評価する（例えば、ピアソンの共局在と相関蛍光強度ラインスキャン分析と直交閲覧）。
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Representative Results
内皮細胞を使用し、生理的な複雑さとプロフェッショナルAPCの変形能を有する平面脂質二重層モデルの解像度の利点を組み合わせた新たなイメージング手法は、（ 図1）を開発しました。2本で観察された典型的な移行、カルシウムフラックスとトポロジカルダイナミクスの例を示します。図アプローチ。内皮上のサグ不在下でサグ特異的CD4 +のTh1リンパ球が急速に偏光さ、広がり、カルシウムを流動させずに内皮表面（ 図2A）を介して横方向に移動する（図示せず）。 〜5-10分以内に、これらのリンパ球は、内皮を通過する遊出を開始します。彼らが示す、その間、内皮へのSAg搭載の存在下では、リンパ球（すなわち、30〜60分間）は、細胞内カルシウムフラックス（動画1 図2B）持続、「目玉焼き」トポロジーと対称的に広がっ開始しますほとんど、あるいは全くの移行（ 図2C）。
T細胞活性化および内皮のAPCの移動及び免疫学的シナプスのトポロジの図2生細胞分析 （A）パネルがsagの非存在下での内皮細胞上のT細胞遊走の時系列画像の一例を示します。上のパネルはDIC画像を示します。移行T細胞の初期位置は、赤い点線で示されています。下のパネルは、移行T細胞のことで内皮上に形成された陥入を示しています。矢印は内皮APC表面に対して「invadosome状突起」（ILPS）（D参照）のT細胞の生成の結果として形成された膜-YFP蛍光の過渡リング（〜0.5〜1ミクロンの直径）の形成を示しています。 （B）は、サグロード内皮（左の存在下で同様の一連の例を示す図である。も参照してください。ムービー1）及びカルシウムレベル（右）の動的変化を定量的にトレースを対応します。矢印は、高カルシウムフラックス（II）と相関カルシウムフラックス（i）の開始と相関初期ILPS形成し、複数のILPSのその後の安定化を示しています。 A及びBのような（C）実験は細胞追跡分析に供しました。 10分（赤のトレース）の期間に残さショーの代表的なT細胞の移行パスのDIC画像。右のグラフがsagの非存在下および存在下で算出された移動速度を示しています。 （D）（19から変更された）免疫学的シナプストポロジの動的解析。 （I）は、膜標的-YFPおよび可溶性細胞質ゾルRFPからなる敏感内皮細胞/ APC「トポロジーレポーター系 'を示す回路図。円筒状の陥入を生成する内皮細胞表面に突出アクチン媒介ILPグラム（細胞フットプリントの種類は、「podoプリント」と呼びます）膜YFP蛍光のリングとして現れる鋭く曲がった膜へiving上昇（ すなわち 、 顔専用閲覧シリンダーの壁）。これらの遺伝子座でのサイトゾル変位と除外はサイトゾルRFPのようにくまが表示されます。 DIC及び（ii）のSAgの存在下で、このような分析の例を示しにおける蛍光画像（動画も2に対応する参照してください）。 podoプリント/ ILPは> 20の配列に展開する単一の初期には、15分かけてILPSを安定化。 15分でブルーボックス（iii）は、膜-YFPのリングは除外サイトゾルのRFPの領域と重なることにより、単一podoプリント/ ILPの高解像度の図を示します。破線（iv）は、蛍光強度の定量的なラインスキャン分析を示します。スケールバー=5μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
以前に確立されたように、リンパ球は、ACTIVエリーアクチンを拡張することによって内皮細胞の表面を探査し、HS1（コータクチンホモログ）が富化とWASp-とSRC依存突起がinvadosome状突起」と呼ばれます。 （ILPS;直径、深さ各〜0.5〜1ミクロン）27,28。膜標的化蛍光タンパク質（FP）のトランスフェクションは、細胞表面での細胞内トポロジカル力学ため高感度のレポーターを提供することが実証されています。これにより、蛍光膜-FPの明るいリングはT細胞ILPS突起の結果として、T細胞 - 内皮相互作用の間に曲げ膜を示すものであることが示されています。それはここに示されている、とされている以前の研究19,20で、小さな急速ILPSフォームと売上高のクラスター（ すなわち 、10〜30秒〜の寿命）のSAgの不在下での内皮上のT細胞の横方向の移行時（ 図2Aに対し、 ）、それらは非常に安定化（ すなわち 、〜30分の寿命）と存在下で高密度のアレイに蓄積するようになりますサグ（ 図2B）。また、ILPSカルシウム開始動態の解析（「オフセット時間」）ILPSは、それらがMHC-II / Agの認識処理（ 図2Bii）の助けを示唆し、カルシウムシグナル伝達に先行することを示しています。さらに、ILPSアレイを安定化し、最大のカルシウム流入（ 図2Bii）に見合っを形成します。アイデアは、膜蛍光のリングは、内皮のAPCにおける個別の陥入スポットを駆動するT細胞の突起に対応する、すべての場合において、これらの環は、可溶性のDsRedによって報告されるように変位/除外質のゾーン（と空間的および動力学的に相関デモによって確認されました。 図2Dムービー2）。
図3は、固定されたエンドポイント共焦点イメージング研究の例を示します。 T細胞および内皮のAPCとの間に形成されたサグのISの存在下での共インキュベーションの10分後、私は、固定によって画像化しましたmmuno蛍光染色および共焦点顕微鏡。これらの研究は重要な分子の細胞内分布動態の分析を提供し、ILPSに特に関連してのIS内シグナル伝達活性を。具体的には、細胞骨格/細胞骨格レギュレータ（アクチン、HS1; 図3A）、抗原提示/認識（CD3 / MHC-II; 図3B）接着（ICAM-1、LFA-1、タリン; 図3C）、および抗原シグナリング（PKC -Q; 図3D）は、podo-プリント/ ILP中で共濃縮されていることが見られます。共焦点の連続切片のzスタックのデジタル再構成は、T細胞、内皮細胞、内皮は、APCの表面に突出するT細胞ILPにより中断離散3次元構造（ 図3Aii、Ci を有していることが図2Dに示されるものと相補的な証拠を提供しますIII、D）。 （ 図3Civ）。
T細胞-内皮細胞の免疫学的シナプスにおける分子の分布動態の図3.固定サンプル分析はリンパ球は、30分間垂れロード内皮上でインキュベートし、固定し、染色しました。示されたパネルに、内皮細胞は、膜または-DsRed YFPを発現するように事前にトランスフェクトしました。 （A）代表イメージングショーアクチン（i）とHS1（コータクチンホモログと、ii）内皮蛍光膜-YFPのリング（ すなわち 、 'の中心と相関マイクロクラスターにおける免疫学的シナプスの周囲に共同濃縮podo-プリント'; 図2Dを参照してください ）、T細胞ILPSがpodo・プリントの出現に関与していることを確認しました。側面図（II。90°プロジェクション）がILPSは（19から変更）は、z の撮像面における3次元突起を表すことを示しています。 （B）代表のT細胞のTCR（i）の濃縮およびendothelial MHC-II（ii）は、免疫学的シナプスの中に、ILP / podo-プリントに個別の細胞内のパーティションを示しています。それぞれISの（C）（ⅰ）podo-プリントとILPにおけるICAM-1およびLFA-1の代表的な共同濃縮、。 （I）60°（上パネル）を回転させ、90°（直交ビュー;下パネル）、ISの共焦点セクションの3次元デジタル再構成を表示します。 （ii）の顔専用 ISのズームビューを表示します。 （ⅲ）（ⅱ）（19から変更）で箱入りの地域の直交断面図を示します。 （IV）IS ILPSにおける代表タリンの共同濃縮（integtin /アクチンリンカータンパク質）とアクチンを。 （D）中のアクチンとTCRシグナル伝達分子、PKC-Qの代表的な同時濃縮はILPSです。各パネルには専用面図 （左下部分）と、2つの異なる直交ビュー（90°プロジェクション）を示しています。左端と右のパネルの使用は、それらのそれぞれの隣接パネルの複製であり、虹fluorescencを使用して投影（19から変更された）電子の強度スケール。スケールバー=5μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
動画1：T細胞カルシウムシグナル伝達の生細胞の動的イメージングと免疫学的シナプストポロジ内皮は、膜-YFPを発現させ、 図2Bに対応するサグを搭載したとの対話FURA2ロードされたCD4 +のTh1リンパ球のタイムラプスライブセルイメージング。 T細胞中;：（暖色系高カルシウムクールな色、低カルシウム虹）左のパネルは、細胞内カルシウムレベルを示しています。右のパネルは、内皮、APCの表面に膜-YFP蛍光を示します。リンパ球を拡散し、ILPの形成を開始するために見られている（; すなわち 、「podo-プリント'; MEM-YFPチャンネルで蛍光リングを経由して見られるように、図2BIを参照してください ）、持続的な（30〜60分）は、細胞内カルシウム流動の誘導に続いて、 TCR /アクチンに類似ILPS / podo-プリントの周辺配列の形成に見合っ発生する平面二重層APCモデル（ 図2Biiを参照）に見られること「マイクロクラスタ化されたシグナル伝達」。フレーム間の間隔は20秒です。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。
ムービー2：免疫学的シナプストポロジVIの生細胞の動的イメージング内皮のAPCにおける蛍光レポーター。（左DIC）、CD4 +のTh1リンパ球のタイムラプスライブセルイメージング内皮共発現する膜-YFP（緑）および可溶性細胞質ゾルのDsRed（赤色）との相互作用サグを搭載した、に対応図2D。右側のパネルには、DIC、膜と細胞質のシグナル伝達のマージを示しています。膜と細胞質の蛍光の合成信号は、敏感に複数の形成およびリモデリングを報告〜ILPの突起でプローブ配列のT細胞から生じる0.2-1ミクロンスケールの表面陥入（podo-プリント）。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
全体的に、このプロトコルは、ⅰ）understudied生理学的なAPCとして内皮細胞を調査するための方法を説明し、ii）の「平面携帯APCモデル」の新規タイプとして。前者に関しては、ますます適応免疫応答16-18を形成する上で（造血APCに比べて、 すなわち ）を、周辺非造血（または「間質'）APCは、重要な、非冗長な役割を果たしていることが理解されるようになりました。このような「セミプロ」のAPC、血管と（非常にプロフェッショナルAPCを上回っ）リンパ管内皮細胞の中では最高の16〜18感謝の一つです。しかし、シグナル伝達事象の詳細とその結合された免疫学的シナプスの大部分は未調査のままです。本明細書に記載の方法は、この新興地域での理解を進めるための基礎を提供します。例えば、個別のadaptivを示すことが知られている別の組織からの内皮上に形成されたISの研究にこれらの方法を適用しますE免疫学的機能 （例えば、肝臓およびリンパ内皮）が特に有益かもしれません。
重要なことに、この方法は、適応免疫応答の基本的なメカニズムを調べるための能力を高めるためにプロフェッショナルAPC人工APC基板モデルとの間のギャップを埋めるのに役立ちます。平面（ すなわち 、脂質二重層、抗体でコーティングされたガラス）のAPC基板に対し、そのようなモデルは、本質的に限られている（多くの重要な洞察7,11-14につながりました）最適な画像を提供しています。代替的に、生理学的な細胞間スキャンダイナミクスの詳細は、これまで深く向き関連イメージングの問題8-10によって隠されています。現在のアプローチで提供イメージング機能は、独自に他の方法で検出不可能な3次元細胞内アーキテクチャおよび生理学的APC-T細胞インタフェースの迅速なリモデリングを明らかにするために、この障害を克服します。抗原signalinの新たな理解のためにこれらのオファーの可能性グラム。
例えば、T細胞は、（例えば、 図2D、 図3）TCR、アクチンおよびシグナル伝達分子で富化ILPSを形成するという認識は、これらはおそらくマイクロクラスタシグナリング平面TCRに3次元カウンタ部が上に観察された生理学的に表すことを示唆しています人工APCは6,7,12-14,29-31を基質。これは、生理的な設定の下で、リンパ球が増幅し、重要な分子/活動32,33を濃縮することにより、シグナリング維持」signalosome'様の特性を個別の細胞内「3D-反応体積」としてILPSを採用することができることを意味します。また、観光地において重要な生体力学的な入力（ すなわち 、細胞-細胞力付与）の存在は、APCに対してILP突起は、イメージングから推測することができる場合。機械的な力がますます抗原性シグナル伝達の重要なファシリテーターとして見ているよう正確にどのような力でありながら、これは、非自明です14,34-37不明なままで現れます。
プロフェッショナルAPCのための合理的な代理としてこのモデルの全体的な関連性は同様のILPアレイは類似の結像アプローチが採用されたとき（B細胞およびより少ない程度に）ECおよびDCの上に形成されたシナプスで見ることができることを当社の直接の実証により支持されている（例えば、 、同じ蛍光メーカー、IS面方位面19）の制御を使用します。それにもかかわらず、それはプロAPC膜表面に対するECの相対的な生体力学的特性が不明であること、およびこのパラメータの差がISトポロジおよび抗原応答の内容に影響を与える可能性があることを考慮する必要があります。
本明細書に記載されたアプローチの鍵となるのは、その解像度の利点に強く関連しています。これは、今度は、蛍光シグナルの強度に非常に関連しています。このように、蛍光物質のトランスフェクションおよび染色の最適化に特別な注意を払うことが重要ですセントは、記者と撮影パラメータ/技術（例えば、露光時間、焦点、 など）。前者に関しては、ここで説明した生細胞研究のためのプロトコルは、一般的な膜とリアルタイム（ 例えば 、 図2中のT細胞のAPC界面におけるトポロジの変更、映画1を報告し、細胞質マーカーのトランスフェクションに限定されています、 2）。さらに、このプロトコルは、容易に、シグナリングおよび生体力学のための内皮で同時に導入/イメージングさらにレポーター（例えば、蛍光タンパク質タグ付きMHCI / IIとの密着性、共刺激および共阻害分子およびバイオセンサーによって、より高度な分析のために変更することができますダイナミクス）。しかし、残念ながら、一般的な制限は、リンパ球が有名トランスフェクトすることが困難であるということです。これは、蛍光タンパク質生細胞イメージングのためのT細胞（例えば、TCRにタグ付けし、PKC-Q など ）の便利な使用を妨げます。
一方現在のプロトコルサグ（広く使用されているモデル）を介してヒトエフェクター/メモリーCD4 + Th1型リンパ球の活性化を伴う、より広範な可能性が存在します。以前19,20を実証したように、このアプローチは、他のCD4 + サブセットと応答を殺 すCD8 + リンパ球の活性化の応答として、他の設定の広い範囲のに容易に適合可能です。既存のTCRトランスジェニック株由来のリンパ球と内皮細胞の単離を経て、この方法は、特定のペプチド抗原19,20に対する応答を研究するためにも容易に適用可能です。最後に、現在のアプローチは、エフェクター/メモリーT細胞の検査に限定されています。しかし、本質的な共刺激分子（CD80 / 86、通常内皮に発現していない）と内皮細胞のトランスフェクションは、このモデルでナイーブ細胞プライミングダイナミクスの研究を可能にすることがあります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer stretch latex free tourniquet | BD Biosciences | 367203 | |
| BD alcohol swabs | BD Biosciences | 326895 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok | BD Biosciences | 367861 | K2 EDTA |
| BD Vacutainer Push Button Blood Collection Set | BD Biosciences | 367335 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-1L | |
| Ficoll-Paque | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Bring to RT before use |
| FCS-Optima | Atlanta Biologics | s12450 | Heat inactivated |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| staphylococcal enterotoxin B | Toxin Technology | BT202RED | Stock solution 1mg/ml in PBS |
| toxic shock syndrome toxin 1 | Toxin Technology | TT606RED | Stock solution 1mg/ml in PBS |
| human IL-15 | R&D Systems | 247-IL-025 | Stock solution 50ug/ml in PBS |
| PBS | Life Technologies | 10010-049 | |
| Fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells | Lonza | CC-2543 | Other Human Microvascular ECs can be used, i.e. HLMVECs |
| EGM-2 MV bullet kit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T-4174 | Stock solution 10x, dilute in PBS |
| amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit | Lonza | vpb1003 | Required Kit for step 4 |
| IFN-g | Sigma-Aldrich | I3265 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| TNF-alpha 10ug, human | Life Technologies | PHC3015 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| phenol Red-free HBSS | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP299-100 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-100G | Stock solution 1M in H20 |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | Stock solution 1M in H20 |
| Human Serum albumin | Sigma-Aldrich | A6909-10ml | |
| Immersol 518 F fluorescence free Immersion oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Fura-2 AM 20x50ug | Life Technologies | F1221 | Stock solution 1mM in DMSO |
| pEYFP-Mem (Mem-YFP) | Clontech | 6917-1 | |
| pDsRed-Monomer (Soluble Cytoplasmic DsRed) | Clontech | 632466 | |
| pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed) | Clontech | 632512 | |
| pEGFP-Actin | Clontech | 6116-1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Formaldehyde solution 37% | Fisher Scientific | BP531-500 | Toxic, use fumehood |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-5ML | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Falcon Tissue Culture Treated Flasks T25 | Fisher Scientific | 10-126-9 | |
| Falcon Tissue Culture Treated Flasks T75 | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Corning Cell Culture Treated T175 | Fisher Scientific | 10-126-61 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-85 | 12 mm diameter |
| Falcon Tissue Culture Plates 24-well | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| Delta-T plates | Bioptechs | 04200415B | |
| Wheaton Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8D | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| ICAM1 mouse anti-human | BD Biosciences | 555509 | |
| HS1 mouse anti-human | BD Biosciences | 610541 | |
| Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Purified | ebioscience | BMS102 | |
| Anti-Human CD3 Alexa Fluor® 488 | ebioscience | 53-0037-41 | |
| Anti-MHC Class II antibody | Abcam | ab55152 | |
| Anti-Talin 1 antibody | Abcam | ab71333 | |
| Anti-PKC theta antibody | Abcam | ab109481 | |
| phosphotyrosine (4G10 Platinum) | Millipore | 50-171-463 | |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems | Required electroporator for step 4 | |
| Zeiss Axiovert | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss LSM510 | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss Axiovison Software | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet | NuAIRE | Nu-425-600 | |
| Forma STRCYCLE 37 °C, 5% CO2 Cell culture Incubator | Fisher Scientific | 202370 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EW-02570-02 | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
| Isotemp Waterbath model 202 | Fisher Scientific | 15-462-2 |
References
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