Summary
Vi presenterer en protokoll for å skape celle-basert signalstoffet fluorescerende konstruerte journalister (CNiFERs) for optisk deteksjon av volumetrisk neurotransmitter utgivelsen.
Abstract
Cell-baserte nevrotransmitter fluorescerende konstruerte journalister (CNiFERs) gi et nytt verktøy for nevrologer til optisk oppdage utgivelsen av nevrotransmittere i hjernen in vivo. En spesifikk CNiFER er opprettet fra et humane embryonale nyrecelle som stabilt uttrykker en bestemt G protein-koblet reseptor, som kobler til G q / 11 g proteiner, og en FRET basert Ca 2+-detektoren, TN-XXL. Aktivering av reseptoren fører til en økning i den FRET signal. CNiFERs har nM følsomhet og en tidsmessig respons sekunder fordi en CNiFER klone benytter native reseptoren for en bestemt nevrotransmitter, f.eks D2R for dopamin. CNiFERs er direkte implantert i hjernen, slik at de kan avføle neurotransmitterfrigjørelse med en romlig oppløsning på mindre enn ett hundre um, noe som gjør dem ideelle for å måle volumet overføring in vivo. CNiFERs kan også brukes til å screene andre rusmidler for potensiell kryssreaktivitet i vivo. Vi har nylig utvidet familien til CNiFERs å inkludere GPCR som par til G i / o G-proteiner. CNiFERs er tilgjengelige for påvisning av acetylkolin (ACh), dopamin (DA) og norepinefrin (NE). Gitt at en GPCR kan brukes til å skape en ny CNiFER, og at det finnes omtrent 800 GPCR i det humane genom, vi beskriver her den generelle fremgangsmåten for å utforme, å realisere, og teste alle typer CNiFER.
Introduction
For å forstå hvordan nerveceller kommuniserer i hjernen, er det nødvendig å ha en metode for å måle frigivelsen av nevrotransmittere in vivo. Det er flere veletablerte teknikker for måling av nevrotransmittere in vivo. En vanlig brukt teknikk er mikrodialyse, hvor en kanyle er satt inn i hjernen og et lite volum av spinalvæske blir samlet opp og analysert ved hjelp av væskekromatografi og elektrokjemisk deteksjon en. Mikrodialyse har en romlig oppløsning i størrelsesorden noen få diametere på sonden, f.eks, ~ 0,5 mm for en 200 um diameter mikrosonde. Den tidsmessige oppløsning av denne teknikken, er imidlertid langsom på grunn av samplingsintervaller som vanligvis varer i ~ 5 min eller lengre en. Videre er analyser ikke gjøres i sanntid. En annen teknikk er rask scanning syklisk voltametri (FSCV), som bruker en karbon-fiber sonde som settes inn i hjernen. FSCV har utmerket temporal oppløsning (subsecond), høy følsomhet (nanomolar), og romlig oppløsning med sonde diameter på 5 til 30 mikrometer. Imidlertid er FSCV begrenset til sendere som frembringer en karakteristisk oksydasjon og reduksjon profil med spenning på et karbon potensiometrisk sonde 2.
En tredje teknikk for å måle signalstoffer er direkte gjennom genetisk kodet nevrotransmitter (NT) biosensorer 3. Med denne metoden blir et fusjonsprotein laget som inneholder en ligand-bindende domene til en transmitter koblet til en fluorescens-resonans energioverføring (FRET) -basert par av fluoroforer 4 eller en permutert GFP 5. I motsetning til de to foregående fremgangsmåter, er disse biosensorer genetisk kodet og uttrykkes på overflaten av en vertscelle, slik som en nevron, gjennom produksjon av transgene dyr eller akutt med bruk av virale midler for å infisere celler. Hittil har genetisk kodet biosensorer er kun utviklet for detekteringg glutamat og GABA 3-5. Begrensninger med disse teknikkene har vært den lave følsomhet, i nM område, og den manglende evne til å utvide deteksjons til det store antall sendere, f.eks klassiske nevrotransmittere, nevropeptider og neuromodulatorer, som signalerer via G protein-koblede reseptorer (GPCR). Faktisk er det nesten 800 GPCRs i det menneskelige genom.
For å møte disse manglene, har vi utviklet et innovativt verktøy til optisk måling utgivelsen av noen nevrotransmitter som signaliserer gjennom en GPCR. CNiFERs (cellebasert nevrotransmitter fluorescerende konstruert journalister) er klonale HEK293 celler konstruert for å uttrykke en bestemt GPCR at når stimulert, utløser en økning i intracellulært [Ca 2+] som er oppdaget av en genetisk kodet FRET baserte Ca 2+ sensor, TN-XXL. Således CNiFERs omforme nevrotransmitter-reseptorbinding til en endring i fluorescens, noe som gir en direkte og real-time optisk rEAD-out av lokale neurotransmitter aktivitet. Ved å benytte den native reseptoren for en gitt nevrotransmitter, CNiFERs beholde den kjemiske spesifisitet, affinitet og tidsmessige dynamikken i endogent uttrykte reseptorer. Til dags dato, har vi laget tre typer CNiFERs, en for detektering av acetylkolin ved hjelp av M1-reseptoren, en for å detektere dopamin ved hjelp av D2-reseptoren, og en for å detektere noradrenalin ved hjelp av α1a reseptoren 6,7. Den CNiFER teknologien er lett utvidbar og skalerbar, slik at det er mottakelig for alle typer GPCR. I denne Jove artikkelen beskriver vi og illustrere metodikken for å designe, realisere, og test in vivo CNiFERs for alle bruksområder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer utført i denne studien er i samsvar med Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) retningslinjer, og har blitt godkjent av IACUCs på Icahn School of Medicine ved Mount Sinai og University of California, San Diego.
1. Generer GPCR-uttrykke Lentivirus for Transforming HEK293 celler
- Skaff cDNA for en bestemt GPCR fra en kommersiell kilde, for eksempel, cdna.org. Alternativt kan forsterke den GPCR-genet fra et cDNA-bibliotek ved anvendelse av PCR. Få tak i en lentivirus-uttrykke vektor, slik som pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro (pCDH). Bruk av denne vektor for å forplante DNA, så vel som å generere lentivirus.
- Klone GPCR cDNA inn i lentivirus-uttrykke vektoren ved PCR. Se Lorenz 8, for detaljer om PCR subkloning.
- Utvid og rense GPCR-pCDH DNA ved hjelp av et endotoksin-free 'maxi' prep kit i henhold til produsentens instruksjoner. Bekreft at GPCR cDNA subklonet inn pCDH er mutation-fri ved hjelp av DNA-sekvensering.
Merk: Før du sender inn DNA for virusproduksjon, fordøye en porsjon med passende restriksjonsenzym for å bekrefte størrelsen på innsatsen og renhet av DNA. - Generer lentivirus bruker et virus kjernefasilitet, for eksempel en på The Salk Institute, University of Penn., Eller University of North Carolina, etc., eller generere in-house 9. Bruk omtrent 25 ug (> 1 ug / ul) av endotoksin-fri DNA for transfeksjon av HEK-celler i en T75-kolbe. Sikre at DNA er av høy renhet, som har en absorbans-forhold (A 260 / A 280) på ~ 1,8.
Merk: Titere av virus ~ 10 11 -10 12 GC / ml er optimale for transduksjon av HEK293 celler.
2. Velge HEK293 / TN-XXL Backbone Celletype for dyrking In Vitro
Merk: Bestem G protein kopling spesifisitet, f.eks G i / o, G q / 11, eller G s G-proteiner, i GPCR, da dette DICtates om et G-protein chimera er nødvendig for CNiFER. For G q -koblet reseptorer, f.eks M1 muskarin reseptor, velger HEK293 / TN-XXL (# 3G8) som ryggrad HEK293 celletype. For G i / o -koblet-reseptorer, er det kimære G-protein G qi5 nødvendig 10. For G s -koblet reseptoren, er G qs5 chimera trengte 10. I denne protokollen, er konstruksjonen av en D2R CNiFER brukt som et eksempel. D2R signaler gjennom G I / O-G-proteiner og krever HEK293 celler som stabilt uttrykker kimære G protein, G qi5, f.eks HEK293 / TN-XXL / G qi5 _ # qi5.6.
- Skaff HEK293 / TN-XXL / G qi5 _ # qi5.6 klonale celler fra et forskningslaboratorium. Merk: Følgende klonale celler, HEK293 / TN-XXL (# 3G8) for G q -koblet reseptorer, HEK293 / TN-XXL / G qi5 (# qi5.6) for G i / o -koblet reseptorer, og HEK293 / TN -XXL / G qs5 (# qs5.47) for G s -koblet receptors, er fritt tilgjengelig på forespørsel 6,7.
- Vokse og utvide HEK293 / TN-XXL / G qi5 _ # qi5.6 til ~ 90% konfluens i en T25 kolbe med 5 ml HEK293 vekstmedier (tabell 1). Dyrke cellene i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 5% (v / v) CO 2.
Merk: Alt arbeid med å dyrke HEK293-celler bør utføres under anvendelse av standard sterile vevskulturteknikker. - Høste HEK293 celler ved først å aspirere media fra T25 kolbe. Vask cellene forsiktig ved tilsetning av 5 ml PBS og gynge kolbe.
- Fjern PBS og tilsett 1 ml av 0,05% (vekt / volum) trypsin / EDTA (tabell 2). Inkuber i 1 til 2 minutter ved 37 ° C med 5% (v / v) CO 2.
- Samle celler og overføre til sterile 15 ml konisk tube. Sentrifuger i 5 min ved 1000 x g i en cellekultur sentrifuge. Aspirer supernatanten.
- Cellepelleten suspenderes i 5 ml HEK293 vekstmedier. Telle celler i et hemocytometer hjelptrypanblått. Beregn celletetthet og gå videre til trinn tre.
3. Lentiviral Transduksjon av HEK293 / TN-XXL / Gqi5 Cells
- Seed en T25 kolbe med 0,7 x 10 6 HEK293 / TN-XXL / G qi5 celler. Dyrke cellene i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 5% (v / v) CO 2 til ~ 50% sammenflytende etter ca. en dag. Freeze gjenværende cellene (trinn 8.2 til 8.3). Disse cellene vil tjene som CNiFER kontroll, dvs. en CNiFER som mangler GPCR.
- På dagen for infeksjonen, fortynne den GPCR som uttrykker lentivirus (trinn 1.4) til en sluttkonsentrasjon på 10 ~ 9 GC / ml i et totalvolum på 2 ml av HEK293 vekstmedium (Tabell 1). For eksempel legge til 20 pl 10 11 GC / ml virus til 2 ml media i en T25 kolbe.
Merk: virustiter informasjon bør gis av viruset kjernefasiliteten. Kombiner lentivirus og media i et sentrifugerør og triturer forsiktig. Høye titere av lentivIrus er biosikkerhetsnivå 2 (BSL-2). - Aspirer media fra T25 kolbe. Tilsett 2 ml virus / media blandingen fra trinn 3.2. Inkuber T25-kolbe O / N ved 37 ° C med 5% (v / v) CO 2.
- Etter en dag av infeksjonen, suge / media blandingen virus og erstatte den med HEK293 vekstmedium som inneholdt puromycin (2 ug / ml; Tabell 1). Puromycin velger for de omsatte cellene. Inkuber kolben ved 37 ° C med 5% (v / v) CO 2 til ca 90% sammenflytende etter ~ 1-2 dager.
- Fremstille en 96-brønns plate (sort med klar bunn) belagt med fibronektin, for å generere et 10-punkts agonist / aktiveringskurven i trinn 4,1. I en steril hette, tilsett 50 mL fibronektin (5 mikrogram / ml) per brønn i rader A og B på 96-brønns plate. Platen inkuberes ved romtemperatur i 1 time. Skyll to ganger for 5 min per skylling med PBS. Tilsett 50 mL av HEK293 vekstmedier og inkuberes O / N ved 37 ° C med 5% (v / v) CO 2.
Merk: Fibronectin-behandlede plater er kommersielt tilgjengelige. - Høste celler i T25-kolbe som beskrevet i trinn 2.3-2.6 (tabell 2).
- Cellepelleten suspenderes i 5 ml HEK293 vekstmedier. Seed en T25-kolbe med 1,5 ml celler for FACS-analyse. Også frø en T75 kolbe med 1 ml celler for frysing og lagring (se trinn 8.2 til 8.3)
- For den 10-punkts kurve agonist, seede de to første rader (A og B) av en fibronektin-belagte 96-brønners plate (fra trinn 3.5) med 100 ul av cellesuspensjonen per brønn.
- Inkuber HEK293 celler som vokser i en T25-kolbe, en T75-kolbe og en 96-brønns plate før ca ~ 90% konfluens ved 37 ° C med 5% (v / v) CO 2, etter ~ 1-2 dager.
4. FACS og Isolering av Enkelt CNiFER Clones
- Bruke 96-brønners plate for å generere et 10-punkts agonist aktivering kurve.
Merk: Før start fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) analyse, er det viktig å bekrefteekspresjon av GPCR ved å teste transduserte celler for en agonist respons (10-punkts kurve agonist). Denne testen blir utført ved anvendelse av en fluorometrisk plateavleser.- Forbered et stoff plate for 10-punkts agonist aktivering kurve. Velg 10 forskjellige agonist konsentrasjoner at braketten den predikerte EC 50, som kan bestemmes fra litteraturen.
Merk: Stoffet plate inneholder tre ganger for hver konsentrasjon (i to eksemplarer) for å justere for 1: 3 fortynning i CNiFER plate. For eksempel medikamentet plate for testing av en D2 CNiFER inneholder 10 forskjellige konsentrasjoner av dopamin ved 3-gangers konsentrasjoner; 0,2, 0,5, 1, 3, 5, 10, 20, 30, 50 og 1000 nM. I CNiFER plate, og derfor de endelige konsentrasjoner av dopamin er 0,067, 0,167, 0,333, 1,00, 1,67, 3,33, 6,67, 10,0, 16,7, og 333 nM. - Forbered agonist løsninger ved hjelp av kunstig cerebrospinalvæsken (ACSF) (tabell 1). Bruk to brønner for 'ACSF', for eksempel, A1 og A2,og to brønner for 'ingen celler ", for eksempel, B1 og B2.
Merk: Forbered ulike konsentrasjoner av medikamenter ved hjelp av en seriell fortynning metode. Lag en mal for å holde styr på CNiFER kloner og legemiddelkonsentrasjonene (figur 3). - Bruk programvare for å programmere 96-brønners fluorometrisk plateavleser for å måle FRET og utføre løsnings overføringer.
- Sett platen leseren temperaturen til 37 ° C.
- For å måle FRET med TN-XXL, satt eksitasjon bølgelengde til 436 ± 4,5 nm (i midten ± HWHM). Sett emisjonsfiltre til 485 ± 7,5 nm for eCFP og til 527 ± 7,5 nm for Citrin. Sett cutoff filter til 475 og 515 nm for eCFP og Citrin, henholdsvis.
- Programmere plateleser for å måle utslipp på 485 nm og 527 nm hvert 4. sekund for totalt 180 sek. Velge alternativet for å levere 50 pl fra de tre gangers medikament platen til 100 pl i CNiFER platen, etter oppsamling av 30 sekbaseline fluorescens.
- Aspirer media fra rader A og B og tilsett 100 mL av ACSF til 96-brønners CNiFER plate som er ~ 90% sammenflytende (trinn 3.9).
- Installering av 96-brønns plate CNiFER og '3-fold "medikament plate inn i plateleser. Tillat ~ 30 minutter for å ekvilibrere platene ved 37 ° C. Deretter starter programmet.
- Å analysere plate leser data, eksportere fluorescens verdier til et regneark. Lag en formel for å trekke bakgrunnen målinger (tatt for hvert signal fra brønner uten celler) fra brønner med CNiFERs. Normal fluorescensstyrkene til pre-stimulans linjene F Citrin (t) / F Citrin (baseline), og beregne FRET ratio (AR / R;. Eqn 1) ved hjelp av de travleste responser ved 527 nm og 485 nm utslipp (se trinn 11 ).
Merk: Hvis det er en betydelig endring i AR / R med agonisten, da dette indikerer ekspresjon av GPCR, og man kan gå videre til FACS-analyse (trinn 4.2). Hvis there er ingen FRET respons med agonist, feilsøke ved hjelp av en Ca 2+ ionofor, f.eks A21387, for å teste Ca 2+ respons og bekrefter at FRET basert sensor fungerer. Dersom ionoforen virker, da reseptoren er ikke sannsynlig uttrykt.
- Forbered et stoff plate for 10-punkts agonist aktivering kurve. Velg 10 forskjellige agonist konsentrasjoner at braketten den predikerte EC 50, som kan bestemmes fra litteraturen.
- På dagen før FACS, fremstille fire 96-brønners plater belagt med fibronektin (se trinn 3.5) for oppsamling av de sorterte cellene. Tilsett 50 mL av HEK293 vekstmedier og inkuberes O / N ved 37 ° C med 5% (v / v) CO 2.
- Fremstille 5% (w / v) BSA i PBS (5 g / 100 ml) og filter (0,2 um) i en steril flaske.
- Høste celler dyrket i T25 kolbe (se trinn 2,3-2,5, tabell 2). Cellepelleten suspenderes i 4 ml av 5% (w / v) BSA i PBS. Sentrifuger cellene ved 1000 xg i 5 min.
- Aspireres media, og cellepelleten suspenderes i ~ 5 ml 5% (w / v) BSA i PBS for å gi en sluttkonsentrasjon på 5 x 10 ~ 6 celler / ml.
Merk: Sjekk med FACS kjernefasilitet for spesifikke krav til celletetthet og sortering forhold. - Filter resuspenderte celler med en 40 mikrometer celle sil for å fjerne klumper. Overfør cellene til en 5 ml polypropylen-rundbunnet rør. Plasser røret på is for transport til FACS innretningen.
- Sortere omsatte HEK293 celler på en FACS anlegget. Programmet parametrene på en FACS strømningscytometer som følger: set 4 ° C i prøveholderen, 100 um for dysen og 20 psi. Basert på den pre-typen analyse, velger celler, dvs. velge en "gate", som har en stor eCFP fluorescens (eCFP eksitasjon, eCFP utslipp) og store FRET (eCFP eksitasjon, Citrin utslipp) fluorescens (se resultatene nedenfor, figur 2 ).
- Innskudd individ, sorterte cellene i en 96-brønns plate fremstilt i trinn 4.2, og en klon pr brønn inneholdende 50 ul av HEK293 vekstmedier med puromycin. Tilsett 50 mL av HEK293 vekstmedier med puromycin (Taold 1) for en total på 100 ul per brønn. Opprettholde celler O / N ved 37 ° C med 5% (v / v) CO 2.
Merk: HEK293 vekstmedier inneholder puromycin for valg av transduced celler.
5. dyrking og utvidelse av Ordnet, Klonale CNiFERs
- Opprettholde CNiFERs i 96-brønners plater ved å fjerne 50 mL av gamle medier fra hver brønn og erstatte med 50 ul frisk HEK293 vekstmedier som inneholder puromycin (tab 1). Gjenta dette hvert 5 til 7 dager før ~ 90% sammenflytende, etter 2-3 uker.
- Harvest-CNiFER celler ved forsiktig aspirere media og skylle en gang forsiktig med PBS. Fjern PBS og tilsett 20 pl 0,05% (vekt / volum) trypsin / EDTA. Inkuber i 1 til 2 minutter ved 37 ° C med 5% (v / v) CO 2.
- Tilsett 100 ul av HEK293 vekstmedier til trypsin-behandlede cellene og resuspender cellene. Overføre innhold til en 24-brønns plate som inneholder 400 mL frisk HEK293 vekstmedier viddh puromycin. I 24-brønns plate, vedlikeholde cellene ved å erstatte 250 ul av HEK293 vekstmedier hver 5-7 dager til brønnene er ~ 90% sammenflytende.
6. Identifisere Kandidat CNiFERs Basert på FRET Response Bruke Fluorometrisk Plate Reader
Bemerk: Med fire 96-brønners plater etter FACS, bør det være> 100 testbare kloner som overlever og utvides til den 24-brønns plate stadium, siden mange av de opprinnelige kloner mislykkes i å vokse. For å identifisere potensielle kandidat CNiFERs, bruk en tre-punkts analyse for FRET responsen med beslektet agonist, for eksempel dopamin for D2R.
- Når cellene er 90% konfluent ~ i 24-brønns plate, forsiktig suge mediet. Legg ~ 100 ul av 0,05% (vekt / volum) trypsin / EDTA og inkuberes i 1-2 minutter ved 37 ° C med 5% (v / v) CO 2. Legg 400 mL av HEK293 vekstmedier til trypsin-behandlede celler og bland cellene ved forsiktig gniing.
- Sett opp tre-punkts agonist kurve for den innledende screening av clones. For hver CNiFER klon, dvs. en av brønnene fra den 24-brønns plate, alikvoter 100 ul av cellesuspensjonen (~ 4 x 10 3 celler / brønn) til hver av tre brønner, for eksempel, A1, A2, A3, av et fibronektin-belagte 96-brønners plate (svart med klar bunn) (se trinn 3.5).
- Overfør de resterende ~ 200 ul av cellesuspensjonen til en 12-brønners plate inneholdende 1,000 mL av HEK293 vekstmedium (1,2 ml sluttvolum). Inkuber begge platene ved 37 ° C med 5% (v / v) CO 2, inntil ~ 90% sammenflytende. De 96-brønns plate er for fluorometrisk analyse og den 12-brønns plate er for vekst og utvidelse av de kloner.
- For tre-punkts analyse, bestemme tre forskjellige konsentrasjoner av agonist som er 0.1-, 1.0- og 10 ganger den EC 50 for den spesifikke GPCR. Forbered agonist-konsentrasjon i en medikamentplate som beskrevet i trinn 4.1.1-4.1.2. Utføre en fluorometrisk plateavleser analyse som beskrevet i trinn 4.1.3-4.1.5.
- Beregn FRET forholdet (AR / R) som beskrevet i trinn 4.1.6. Velg CNiFERs som har passende følsomhet og største FRET responsen for utvidelse, frysing tilbake, og mer omfattende analyser (trinn 7).
- For de kloner som ble valgt i trinn 6,5 og vokser i 12-brønns plate, fjerne og erstatte 600 mL av HEK293 vekstmedier hvert 5 til 7 dager, til ~ 90% sammenflytende.
- Gradvis utvide klonene fra en 12-brønns plate til en 6-brønns plate, og deretter til en T25-kolbe (trinn 2.3 til 2.6 og tabell 2). Når T25 kolbe er ~ 90% sammenflytende, høste celler som beskrevet (trinn 2,3-2,5). Cellepelleten suspenderes i 5 ml HEK293 vekstmedier.
- Tilsett 1 ml av cellesuspensjonen til en T75-kolbe med 9 ml HEK293 vekstmedier. Benytte de resterende 4 ml av cellesuspensjonen for kryobeskyttelse og lagring i flytende N 2 (trinn 8.2 til 8.3). Forbered åtte 1,5 ml cryotubes og legg på is.
- I T75-kolbe, opprettholde celler ved å erstatte mediet with frisk HEK293 vekstmedier, for eksempel, 10 ml hver 3-5 dag inntil 70-80% sammenflytende, etter ~ 1-2 uker.
7. endelige valget av CNiFER Clones Bruke Fluorometrisk Plate Reader
- På dagen før plateleser analysen:
- Harvests celler fra en ~ 90% konfluent T75 kolbe (se trinn 2.3-2.6, tabell 2). Seed en 96-brønns fibronektin-belagt plate (svart med klar bunn) ved 5 x 10 4 / brønn med ~ 100 ul cellesuspensjon. Merk: En klon blir fordelt i en enkelt 96-brønners plate.
- Forbered et stoff plate for omfattende screening av CNiFER kloner, skille spesifikke agonist svar fra uspesifikke CNiFER svar.
- For å generere en full dose-responskurve, velge 10 forskjellige agonist konsentrasjoner rundt spådd EC 50. Bruk to brønner for 'no celler "og to brønner for' ACSF '.
- For å bestemme uspesifikke reaksjoner, velger three konsentrasjoner av 12 forskjellige nevrotransmittere eller modulatorer (72 brønner) (figur 3). I likhet med agonist, inneholder medikamentet platen 3-gangers konsentrasjoner i duplikat. For eksempel, 100 ul av tre forskjellige konsentrasjoner av acetylkolin, glutamat, orexin, VIP, adenosin, serotonin, noradrenalin, GABA, substans P, melatonin, somatostatin og histamin, som hver ved en 3-gangers konsentrasjon på 50, 1000, og 3000 nM lastes inn i 96-brønns plate medikament.
- Still inn parameterne på fluorometrisk plateleser for å måle FRET og utføre løsnings overføringer som beskrevet i trinn 4.1.3-4.1.5.
- For å analysere den fulle dose responskurve beregnes peak FRET forholdet (AR / R) (trinn 4.1.6), plottet som en funksjon av log-konsentrasjon agonist og passer med Hill-ligningen (trinn 11.4). Bestem EC 50, Hill koeffisient, og maksimal FRET ratio. For 12 andre nevrotransmittere / modulatorer, tomt peak AR / R som funksjon of legemiddelkonsentrasjon.
- Velge ~ 10 CNiFER kloner som har et stort FRET-forhold, en passende EC 50 for beslektet agonist, og liten eller ingen bakgrunns respons til andre nevrotransmitter-agonister (ikke-spesifikk respons).
8. Freeze-back Valgte CNiFER Clones
- Bruk en ~ 90% konfluent T75 kolbe fra et CNiFER klone. Høste celler som beskrevet (trinn 2,3-2,5, tabell 2). For å fryse celler, cellepelleten suspenderes i 5 ml HEK293 vekstmedier. Merk ti 1,5 ml cryotubes og satt på is.
- For kryobeskyttelse, bland-celler på 1: 1 med 20% (v / v) DMSO i HEK293 vekstmedier, for eksempel, 5 ml av 20% (v / v) DMSO / media Blandingen ble forsiktig blandet med 5 ml av cellesuspensjon (endelig konsentrasjonen av DMSO er 10%).
- Delmengde 1 ml i hver av cryotubes. Fryse rør med celler i en -80 ° C fryser O / N, i en skumisolerte boksen (se Materials). Overføring cryotubes til væskerid nitrogen for langtidslagring.
9. CNiFER Implantasjon inn Mouse Cortex
- Steriliser alle kirurgiske verktøy i en autoklav før operasjonen. Forbered en semi-sterilt område for kirurgi ved å tørke med 70% etanol og legger ned en ren lab bleie.
- Klargjør CNiFER injeksjon pipette ved å trekke et glass kapillær (id på 0,53 mm) på en vertikal elektrode avtrekker. Bruk et par nei. 5 fin-tip tang for å bryte tuppen av elektroden til en diameter på ~ 40 pm.
Merk: Dette oppnås best under et stereo zoom mikroskop med en gradnett. - Bedøve en voksen (postnatal dag 60-90) C57BL / 6 mus med isofluran: 4% (v / v) for induksjon og 1,5 til 2,0% (v / v) for vedlikehold. Bruk hale eller tå klype for å sørge for at musen er fullt bedøvet.
Merk: Re-klype jevne og vurdere whisker rykninger gjennom operasjon for å revurdere anestesidybden. - Dekk øynene med oftalmisk salve til pRevent tørking. Monter mus i en stereotaxic ramme med øret barer. Opprettmusekroppstemperaturen på 37 ° C ved hjelp av en varmepute regulert av en rektal sonde.
- Barbere et område ca 5 mm med 12 mm med et dyr barbermaskin. Påfør Betadine, etterfulgt av 70% (v / v) isopropanol. Bruk en skalpell blad til å kutte og fjerne huden over skallen overflaten. Bruke et skalpellblad for å fjerne periosteum fra overflaten av skallen. Avsløre og rengjør overflaten av skallen, som beskrevet for stereotaktisk kirurgi 11.
- Senk et tomt glass pipette til Bregma og registrere Antero-posterior (A / P) og medio-lateral (M / L) koordinerer. Under henvisning til musehjerneatlas, beregne posisjonen til injeksjonsstedet. Skift pipette til målet stedet og merk skallen for påfølgende vindu formasjon. Se Cetin et al. For detaljer om stereotaxic injeksjoner med gnagere 11.
Merk: injeksjonsstedet og vinduet avhenger av region å bli studert og fordeling av nevrotransmitter eller peptid slippe anslagene i cortex. For eksempel, i en fersk publikasjon 7, koordinerer stereotaxic 1,0 til 2,0 mm A / P og 1,0 til 2,0 mm M / L ble brukt til å injisere CNiFER celler i frontal cortex for in vivo avbildning av dopamin frigjøring under klassisk betinging . - Danner et 2 mm x 3 mm tynnet-skalle vindu som tidligere beskrevet 12,13.
Merk: bein i vinduet bør være 15-20 mikrometer tykt. De små hvite flekker i benet bør ikke være synlig når skallen overflaten er fuktet, hvis benet er tilstrekkelig tynnet 12,13. - Plasser en ACSF fuktet svamp i vinduet for å holde det fuktig mens forbereder celler til å injisere.
- Høste CNiFER klone som ble dyrket i en T75 kolbe til ~ 80% confluency. Aspirer media og vaske cellene med sterilt PBS.
Merk: Trypsin er utelatt for disse trinnene. - Fjern PBS og bruke 10 ml of ACSF å løsne cellene fra bunnen av kolben. Triturate celler til å distansere celleklumper. Sentrifuger og resuspender pelleten i 100 pl ACSF. Sentrifuger i 30 sekunder ved 1400 xg og fjern supernatanten, og etterlater en pellet dekket med ACSF. Dette trinnet etterlater en klump av celler i suspensjon.
- Fylle injeksjon pipette utarbeidet i trinn 9.2 med mineralolje, laste pipette på en nanoinjector, og avansere til stempelet for å løse ut en liten perle av olje. Sett 5 mL av CNiFER cellesuspensjon på en stripe av plast parafin film nær muse forberedelse. Utarbeide enten CNiFERs eller kontrollere CNiFER celler inn revet pipette.
- Bevege pipetten til målet X- og Y-koordinater, dvs. A / P og M / L nevnt i trinn 9.5. Senk pipette, piercing tynnet skallen, og fortsette å ~ 200-400 mikrometer under skallen overflaten, å sette CNiFER celler i lag 2/3 av cortex.
- Sprøyt ~ 4,6 nl av CNiFER celler på det dypeste området med nanoinjector, note bevegelse i olje og celle grensesnitt og deretter vente i 5 min for cellene å dispensere. Trekk pipetten ~ 100 mikrometer og injisere et annet ~ 4,6 nl av CNiFER celler, vent 5 min. Deretter trekke pipetten langsomt og forsiktig for å hindre tilbakestrømning av CNiFERs. Gjenta injeksjon på ett eller flere tilgrensende områder.
- Gjenta injeksjon trinn 09.08 til 09.12 med kontroll HEK293 celler (dvs. HEK293 / TN-XXL / G qi5 klone mangler GPCR). Skill CNiFER og kontrollere celleinjeksjons av ~ 200 mikrometer.
- Etter å ha fullført celle implantasjoner, skyll tynnet-skalle vindu med ACSF og vente på skallen til tørk. Påfør en dråpe cyanoakrylatlim (se Materials) over vinduet og raskt plassere en pre-cut sterile dekkglass på toppen av lim. Skyv glasset mot skallen i noen sekunder. La limet tørke i 2 min 12,13.
- Forsegle kantene på glasset med dental sement og form awell rundt vinduet for å holde vann for dyppe objektiv.
- For å immobilisere musens hodet under bildebehandling, feste en spesialbygd head-bar med en liten dråpe cyanoakrylatlim bak vinduet (se 14 for detaljer om dimensjon og materialer). La limet tørke grundig og deretter legge til ekstra dental sement for å ytterligere forsterke den spesialbygde head-bar.
- Dekke resten av skallen overflate, med unntak av vinduet, med et lag av dental sement. Pass på at kantene av huden er dekket av sement og la det tørke i 20 min.
- Etter operasjonen, stopp isofluran administrasjon og la muspekeren over en varmepute i et bur inntil det fullt gjenoppretter fra anestesi. Injisere 5% (w / v) glukose i saltløsning (sc) for rehydrering og 0,05 ende 0,1 mg / kg buprenorfin (ip, øyeblikkelig frigivelse) for postoperativ analgesi.
Merk: For å minimere potensiell immunologisk reaksjon på de menneskelige CNiFERs, injisere mus daglig med 20 mL / 100 g cyclosporine (ip) starter dagen før injeksjon av CNiFERs. - Returner musen til sitt hjem buret for mat og vann.
10. In vivo avbildning av CNiFER Clones
Merk: Live-avbildning er gjennomført med mus bruker en to-foton mikroskop og et hode-fast apparat. Ingen bedøvelse er nødvendig under imaging økter. Når bildebehandling dyr i våken tilstand, begrense hodestøtten til bare noen få timer om gangen for å redusere stressnivået. Gå tilbake dyret til det hjemmet buret mellom bilde økter for mat og vann. Potensielle stress er minimert ved mørkere rom lysene og omkringliggende del av musen i en innhegning.
- På dagen etter operasjonen, montere musen på en bildeplattform ved å skru metal head-bar implantert på skallen til hodet-fiksering ramme.
Merk: Når bildebehandling våken mus, bør bilde økten ikke overstige et par timer på grunn av mulig stress indusert av hodestøttene enhet. - Plasser bilde plattform med head-behersket mus i en to-foton bildebehandling mikroskop utstyrt med en 10X (0,30 NA) og 40X (0,80 NA) vann nedsenking mål.
- Sett filter kube for FRET imaging (eCFP og Citrin) som har en dichroic speil på 505 nm og band-pass filter som spenner 460 nm til 500 nm for å måle eCFP og 520 nm til 560 nm for å måle Citrin.
- Legg ACSF til den brønn som inneholder tynnet-skalle vindu og senke nedsenking i vann objektiv inn i ACSF. Bruk okularet i forbindelse med kvikksølvlampe og GFP filter kube for å lokalisere overflaten av cortex og vaskulaturen under vinduet.
Merk: Mønsteret av blodkar hjelper lokalisere og bilde i samme region i løpet av gjentatte dager med bildebehandling. Bytt til 40X nedsenking i vann mål å finne CNiFERs ved manuelt å fokusere på overflaten av cortex over cellene ved hjelp av GFP filter kube og en kvikksølvlampe. - Satt opp for to-foton imaging. Velg apsikts lysbanen for to-foton imaging. For et typisk kommersielt system, bruke programvaren til å bytte til to-foton avbildningsmodus og omdirigere lys til fotomultiplikatorrør (PMTs) i de ikke-descanned detektorer. Slå på nær-infrarød femtosecond pulset laser, velg en bølgelengde på 820 nm og en effektinnstilling på 5-15%. Merk: 5% strøm gir vanligvis ~ 25 mW ved prøven.
- Sett PMT1 & PMT2 spenning nær den maksimale verdien, typisk 700-1,000 V avhengig av PMT. Sett gain til en for hver kanal og null z posisjon for målet.
- Senk målet ~ 100-200 mikrometer fra kortikale overflaten og starte xy scan. Juster lasereffekt, forsterkning, og PMT spenningen for hver kanal, dvs. eCFP og Citrine, for å optimalisere signal-til-støyforholdet til CNiFER fluorescens.
- Bruk zoom-funksjonen i programvaren for å begrense bildet til en region som inneholder CNiFER celler samt en BAKGRUNNd regionen. Bruk en scan rate ikke tregere enn en ramme hver 2 sek (0,5 Hz) 4 ms per piksel. Juster linjen i snitt for egnet signal-til-støy-forhold, for eksempel Kalman 2 linje i snitt.
- Tegn en region-of-interesse (ROI) rundt CNiFER celler, rundt ca 3 til 4 celler per fly. Sett opp sanntidsanalyse av ROI gjennomsnittlig intensitet. Begynn oppkjøpet å overvåke CNiFER fluorescens over tid.
- Samle fluorescens fra CNiFERs før og under eksperimentelle manipulasjoner, for eksempel, elektrisk stimulering, ChR2 stimulering, atferd, som bestemmes av brukeren.
- Når bilde forsøket er ferdig, går du tilbake musen til sitt hjem buret. Gjenta bilde over dager, som ønsket. Når re-bildebehandling cellene vise til tidligere ervervet lav forstørrelse blodkar bildet for å orientere tilbake til den samme bildefelt (trinn 10.4).
Merk: Implanterte CNiFERs kan avbildes i minst 7 dager.
11. Data Analysis
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En CNiFER er avledet fra en human embryonisk nyre (HEK293) celle som er konstruert til å stabilt uttrykke minst to proteiner: en spesifikk G-proteinkoblet reseptor (GPCR) og en genetisk kodet [Ca2 +] sensor, TN-XXL. TN-XXL undergår fluorescens resonans energioverføring (FRET) mellom cyan og gult fluorescerende proteiner, henholdsvis eCFP og Citrine,, som respons på Ca 2+ 6,15. Aktivering av GPCR som par for å endogen G q G-proteiner føre til en økning i cytosol-[Ca2 +] via PLC / IP 3 vei, som fører til en økning i FRET fra TNXXL Ca 2+ detektor (figur 1).
Figur 1:. Scheme for næringsvirksomhet i utviklings CNiFERs Top, GPCR-Ca 2+ signalveien som kreves for å skape enCNiFER celle. Bottom, de grunnleggende trinnene for å konstruere CNiFERs bruker HEK293 celler. Trinn 1. transduce med genetisk kodet FRET baserte Ca 2+-detektoren (TN-XXL). Trinn 2. transdusere Gα G-protein-kimer, dvs. G qs5, G qi5, om nødvendig. Trinn 3. transduce unik GPCR å skape CNiFER. To-foton eksitasjon lys (rød) hisser eCFP, som gjennomgår FRET, produserer både en eCFP utslipp (cyan) og Citrine utslipp (gul). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Økningen i FRET gir en hurtig optisk avlesing av endringen i Nevrotransmitter nivåer. Å utvikle en CNiFER for en bestemt type nevrotransmitter, først bestemme hvilken type G protein som par til GPCR. For G q -koblet GPCRs bruker GPCR G q proteiner endogent uttrykt iHEK293 celler. For G i / o -koblet GPCRs, en klonal HEK293 linjen er først opprettet som uttrykker en kimære G protein som omdirigerer GPCR til G q -PLC / IP 3 sti. Dette oppnås med et chimerisk protein G, G qi5, som inneholder i hovedsak Gα q sekvens og fem aminosyrer fra karboksylenden av G i. Disse fem aminosyrer er tilstrekkelig for G qi5 å kommunisere med G I / U -koblet GPCR, men signal gjennom den Gq pathway. For G s -koblet GPCRs, er en G qs5 chimera brukt 10. Den generelle strategi for fremstilling av en CNiFER er til: 1) å skape en klonal HEK293-celle som stabilt uttrykker en optisk Ca2 + detektor, dvs. TN-XXL, ved hjelp av en lentivirus transduksjon av HEK-celler, 2) stabilt uttrykker en G-protein-kimer om nødvendig, i HEK293-celleklon som uttrykker TN-XXL, og 3) skape et stabilt uttrykker GPCR klon i HEK293-cellekloner som uttrykker TN-XXL og det kimære G-protein. Den klonal HEK293 linje som mangler GPCR, men har den TN-XXL og kimære G-protein fungerer som "kontroll CNiFER '. Kontrollen CNiFER er nødvendig for å bekrefte at CNiFER responsen skyldes spesielt til aktivering av konstruerte reseptorer, dvs. D2R, og ikke til aktivering av andre reseptorer endogent uttrykt i HEK293 celler.
For å generere lentivirus, er et lentivector uttrykk som brukes, f.eks pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro, som inneholder de genetiske elementer som er ansvarlige for emballasje, transduksjon, stabil integrasjon av viral ekspresjon bygge inn i genomisk DNA, og ekspresjon av målet gensekvensen. For å produsere en høy titer av virale partikler, ekspresjon og innpaknings vektorer transient ko-transfektert inn i produsentpattedyrceller og virus oppsamles. Det er flere viruskjernefasiliteter i USA som kan generere høy ti ter lentivirus. Etter infeksjon av HEK293 celler, gir Puro genet antibiotikaresistens for å identifisere omsatte HEK293 celler.
For å identifisere spesifikke klonale linjer, transdusert HEK293 celler sorteres ved hjelp av en fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) system. Målet er å isolere en klon som inneholder et høyt ekspresjonsnivå av FRET-baserte Ca 2+ detektor og evnen til å gjennomgå FRET. I dette eksempel på en FACS-analyse, blir fluorescensen av eCFP utslipps plottet mot FRET signal (eCFP eksitasjon og emisjon Citrine). Boksene markere områder (P2 og P3) som deretter vil bli valgt ( "gated") for sortering i 96-brønners plater (figur 2). Vanligvis er omtrent fire 96-brønners plater er tilstrekkelige til å screene for vellykket etablering av CNiFERs. Fra disse platene 4, ca. 100 kloner er egnet for fluorometrisk analyse plateavleser.
e_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 2: Eksempel på FACS-analyse En prøve av utgangs etter en FACS-analyse.. Grafen plott eCFP emisjon ( "475/20-A") som en funksjon av Citrine emisjon ( "FRET V-530/30-A"), ved bruk av eCFP eksitasjon for hver celle. Regioner P2 og P3 viser områder valgt, dvs. gated, for sortering i individuelle celler. Fargene er vilkårlig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Når de sorterte cellene har vokst til tilstrekkelig tetthet, er FRET responsen etter agonist aktivering bestemt ved anvendelse av en 96-brønners fluormetrisk plateavleser system utstyrt med oppløsning håndtering. For å begrense antall kloner å studere, er en "3-point" agonist kurven brukes til å screene ~100 kloner og velg CNiFERs med de beste svarene. Omtrent 10 kloner blir deretter analysert videre med bestemmelse av den fullstendige dose-respons med beslektet agonist, og de ikke-spesifikke responser, probet med 12 andre nevrotransmittere eller modulatorer. En 96-brønners plate medikament blir fremstilt som tre gangers konsentrasjon (sluttkonsentrasjon blir fortynnet 1: 3 i plate) av medikamenter (for eksempel agonister, antagonister, etc.) i ACSF. I dette eksempel er en medikamentplate satt opp for å teste en D2 CNiFER med sin beslektet agonist, dopamin, og potensielle ikke-spesifikke responser med en rekke andre nevrotransmitter og peptid-agonister (figur 3). Ryggraden CNiFER, som mangler GPCR, fungerer som en viktig kontroll for den nyopprettede CNiFER.
Figur 3:. Eksempler på Layout for 96-brønners plater Top, bordet i Layout for lasting av en 3x narkotika plate for fluorometrisk plateleser, ved hjelp av tre-fold konsentrasjoner av ulike nevrotransmittere og peptider. Bottom, eksempler på klar plast 96-brønners narkotika plate og svart 96-brønns plate for seeding CNiFERs og måling i plateleser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Stimulering av GPCR er forventet å øke FRET respons, som en følge av en økning av intracellulær [Ca2 +] og deteksjon av TN-XXL. Under disse betingelser blir FRET produsert av eCFP og Citrine beveger seg nærmere, slik at eksitering av eCFP frembringer en mindre eCFP utslipp og større Citrine utslipp. I dette eksemplet er eksitasjon satt til 436 nm og emisjonsfiltre er satt til 485 ± 7,5 nm for eCFP og 527 ± 7,5 nm for Citrine (figur 4). Tretti sekunder av BASeline fluorescensen måles og deretter 50 ul fra de "tre-fold" agonist i ACSF platen blir levert til hver brønn inneholdende 100 ul ACSF (1: 3 fortynning). eCFP og Citrin utslipp fluorescens måles hvert 3,8 sekunder for 180 sek. Bakgrunn målingene er tatt fra brønner uten celler og trekkes, om nødvendig. Fluorescensintensiteter er normalisert til pre-stimulus linjene (F (t) / F (baseline)), og topp-responser måles for å beregne den FRET forholdet (AR / R) ved hjelp av F (t) / F (baseline) av 527 nm og 485 nm kanaler (ligning 1). En doseresponskurve ble deretter konstruert ved å plotte FRET-forholdet som en funksjon av forskjellige konsentrasjoner agonistiske og passer med Hill-ligningen for å bestemme EC 50 og Hill koeffisient (figur 5) (ligning 2). En optimal CNiFER viser en stor FRET forhold og en passende EC 50 for beslektet agonist, og viser liten eller ingen bakgrunn reaksjoner på andre neurotransmitter agonister. I motsetning til dette, bør styre CNiFER viser liten reaksjon beslektet agonist.
Figur 4: Eksempel på agonist-indusert FRET Response D2R CNiFER FRET responsen målt på en plate leseren med en løsning leveringssystem.. (A) En tomt på FRET respons, dvs. eCFP eksitasjon med eCFP og Citrin utslipp, under påføring av dopamin (rød søyle) til D2 CNiFERs. Merk at eCFP utslipp reduseres mens Citrin utslipps øker med agonist (dopamin). (B) En tomt på båndet ratio (ligning 1) for responsen i (A) Figur modifisert fra Muller et al., 2014 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5:. Eksempler på Dose responskurver for D2 CNiFER (A) Doseresponskurver for respons fra D2 CNiFERs til dopamin (DA, svart) og for noradrenalin (NE, grønn). I tillegg er responsen til "kontroll" CNiFERs som mangler D2R vist. (B) Den søylediagrammet viser FRET forholdet respons for andre nevrotransmittere og modulatorer på 50 nM og 1 mikrometer. Verdier er gjennomsnitt ± SEM. Figur modifisert fra Muller et al., 2014 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
CNiFER kloner kan bli vurdert for ytterligere mulig reseptor-avhengig desensitivisering og for deres tidsmessige oppløsningen, diskriminerende presentasjonenav to forskjellige agonist pulser (for detaljer, se Muller et al., 2014 7). Etter å ha bygget en CNiFER klone, er neste skritt å teste sin funksjon in vivo. Å overvåke fluorescens in vivo, er det nødvendig å bruke en to-foton mikroskop. Etter å ha forberedt en tynnet-skalle vindu, er CNiFERs lastet inn i et glass pipette og injiseres i lag 2/3 av cortex. Musen ble deretter fremstilt for in vivo avbildning ved å feste et glass dekkglass til det fortynnede skallen, og implantere en toppstangen for å feste et innlegg i løpet av imaging (figur 6).
For å finne ut at de implanterte CNiFERs er levedyktig in vivo, kan kjente konsentrasjoner av agonist injiseres nær implantasjonsstedet og gnage forholdet bestemt 7. For å validere aktiviteten av implanterte CNiFERs videre, stimulere inngangs nevroner bør undersøkes. For eksempel, med D2 CNiFER, effekten avelektrisk stimulering av midthjernen dopamin nevroner som stikker til hjernebarken ble undersøkt. En 0,1 Megohm Wolfram bipolar stimulerende elektrode med en spiss separering på 500 um ble implantert i substantia nigra (-3,2 mm A / P, -1,3 mm M / L, -4,4 mm D / V). Figur 6 viser et eksempel på elektrisk stimulerende substantia nigra ved forskjellige intensiteter og observere en økning i FRET ratio for D2 CNiFERs 7. Legg merke til at systemisk intra-peritoneal (ip) injeksjon av en D2-reseptorantagonist, eticlopride (1 mg / kg), blokkerer D2 CNiFER respons. På den annen side, injeksjon av kokain (15 mg / kg), som blokkerer gjenopptak av dopamin, forbedrer den elektrisk fremkalte D2 CNiFER respons 7.
Figur 6: Eksempel på D2 CNiFER Response jeg
ftp_upload / 53290 / 53290table1.jpg "/>
Tabell 1: Liste over kjemikalier og reagenser for å gjøre HEK293 vekstmedium og ACSF.
Tabell 2: Volumene for høsting Celler fra ulike størrelse kulturplater eller Parfyme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Opprettelsen av CNiFERs gir en innovativ og unik strategi for optisk måling frigivelse av nevrotransmittere i hjernen in vivo. CNiFERs er ideell for måling extrasynaptic utgivelse, dvs. volum ledning, for nevrotransmittere. Viktigere, hver CNiFER besitter egenskapene til det native GPCR, noe som gir et fysiologisk optisk måling av endringer i nivåene av nevrotransmittere i hjernen. Hittil har CNiFERs blitt opprettet for å oppdage acetylkolin (M1-CNiFER) 6, dopamin (D2-CNiFER) 7 og noradrenalin (α1a-CNiFER) 7.
I prinsippet kan en CNiFER bli opprettet for noen nevrotransmitter som signaliserer gjennom en GPCR. For det tilfelle hvor GPCR signaler gjennom G q G-proteiner, er ingen ytterligere modifikasjon er nødvendig til HEK293-celle. GPCRs som signaliserer gjennom G i / o, men krever koekspresjon av en G qi5 kimære G proteinå koble GPCR til G q / PLC sti 7,10. Tilsvarende vil GPCR som signaliserer gjennom G r krever koekspresjon av et kimært G qs5 G-protein 10. Etter fullført, blir hver CNiFER klon screenes og bare de CNiFER kloner som har en affinitet sammenlignes med den native reseptoren, utviser liten eller ingen desensitivisering og tilveiebringe et signal-til-støy-forhold som er tilstrekkelig for å måle med in vivo to-foton mikroskopi, er valgt for in vivo-studier.
For in vivo studier, er det sterkt anbefalt å behandle mus med ciklosporin å minimalisere eventuelle immunologisk respons. Det er en mulighet for avvisning eller en immunologisk reaksjon med implantere humane CNiFER celler inn i gnagerhjerne. Dette ble tidligere undersøkt ved å undersøke uttrykk for GFAP og MAC1 7, etter CNiFER implantasjon. CNiFERs synes ikke å produsere gliaceller arr eller generere noen signifikantlig MAC1 flekker 7.
To store spørsmål å vurdere i å bygge CNiFERs er følsomhet og desensitivisering. Hvis EC 50 er for høy, det vil si lav affinitet i forhold til den native reseptoren, så CNiFER kanskje ikke ha tilstrekkelig følsomhet til å detektere frigjøring av nevrotransmitter in vivo. En løsning er å rescreen kloner og velge en annen CNiFER klone som har høyere affinitet. En alternativ strategi vil være å teste andre typer genetisk kodet fluorescerende Ca 2+ -detectors som kan ha en høyere Ca 2+ følsomhet, noe som kan forskyve EC 50 for GPCR aktivering. Fordi CNiFER utforming er modulbasert, er det lett tilpasses andre typer av genetisk kodede Ca 2 + -detectors, slik som GCaMP 16. Isolere CNiFER kloner med den samme reseptoren, men forskjellige EC 50 s kan være en fordel for å utvide det dynamiske område for å detektere frigjøringen av endogent neurotransmitters in vivo.
Desensitivisering av CNiFER vil også begrense bruken in vivo. Dersom maksimal respons synker gradvis med hver puls av agonist, så reseptoren kan desensitizing. I dette tilfelle undersøke andre kloner, og avgjøre om de reagerer på samme måte. Modifikasjoner av reseptoren aminosyresekvensen, eller bruk av en annen subtype av reseptoren kan være nødvendig å ta den agonist-avhengige desensitivisering. Hvis det ikke er kjente områder av fosforylering eller aminosyrer identifisert som assosierer med G-protein-reseptor-kinaser (GRKs), vil det være tilrådelig å konstruere en ikke-desensibiliserende variant av GPCR ved å mutere en eller flere steder. Mekanismen for desensitivisering må bestemmes for hver reseptor fra sak til sak.
Hittil CNiFERs er bare implantert i overfladiske lag av hjernebarken 6,7, på grunn av spektroskopiske begrensninger med bildebehandling fluorophores med to-foton microscopy 17,18. I fremtiden kan det være mulig å tilpasse CNiFER teknologi med fiberbaserte målinger av fluorescens 19, slik at CNiFERs kan implanteres i subkortikale hjerneregioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker B. Conklin (University of California, San Francisco) for å gi G qi5 og G qs5 cDNA A. Schweitzer for å få hjelp med elektronikken, N. Taylor for å få hjelp med screening av kloner, Ian Glaaser og Robert Rifkin for korrektur og Olivier Griesbeck for TN-XXL. Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler gjennom det amerikanske National Institute on Drug Abuse (NIDA) (DA029706; DA037170), National Institute of Biomedical Imaging og bioteknologi (NIBIB) (EB003832), Hoffman-La Roche (88610A) og "Neuroscience relatert til narkotika av misbruk "trening stipend gjennom NIDA (DA007315).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro | System Biosciences | CD510B-1 | Cloning: for generating lentivirus |
| 12 x 75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube | BD Biosciences | 352063 | FACS |
| BD 40 um Falcon cell strainers | BD Biosciences | 352340 | FACS |
| 0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200056 | FACS |
| 96 Well Plate, flat bottom, clear | Corning | 3596 | FACS |
| 96 well cell culture plates | Corning | CLS3997 | Flexstation |
| Optilux black clear bottom | Corning | 3603 | Flexstation |
| Flexstation pipet tips | Molecular Devices | 9000-0911 | Flexstation |
| Acetylcholine Chloride | Sigma-Aldrich | A2661 | Flexstation |
| Norepinephrine | Sigma-Aldrich | A7256 | Flexstation |
| Dopamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | PHR1090 | Flexstation |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | Flexstation |
| Histamine | Sigma-Aldrich | H7125 | Flexstation |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | Flexstation |
| Epinephrine | Sigma-Aldrich | E4642 | Flexstation |
| Somatostatin | Sigma-Aldrich | S1763 | Flexstation |
| 5HT | Sigma-Aldrich | H9523 | Flexstation |
| VIP | Alpha Diagnostics Inc. | SP-69627 | Flexstation |
| Orexin A | Alpha Diagnostics Inc. | 12-p-01 | Flexstation |
| Substance P | Sigma-Aldrich | S6883 | Flexstation |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Flexstation |
| Melatonin | Sigma-Aldrich | M5250C | Flexstation |
| Fluorescence Plate Reader & software | Molecular Devices | Flexstation 3 | Flexstation |
| DMEM (high glucose) with Glutamax | Life Technologies | 10569-010 | Tissue culture |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-139 | Tissue culture |
| Pen/Strep antibiotics | Life Technologies | 15140-122 | Tissue culture |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr-1 | Tissue culture |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Tissue culture |
| CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box | Bioexpress | D-3508) | Tissue culture |
| cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite no. 495 | surgery and stereotaxic injection |
| plastic paraffin film | VWR | Parafilm® | surgery and stereotaxic injection |
| Nanoinjector | Drummond | 3-000-204 | surgery and stereotaxic injection |
| Glass electrodes | Drummond | 3-000-203G | surgery and stereotaxic injection |
| hand held drill | OSADA | Exl-M40 | surgery and stereotaxic injection |
| Burrs for drill | Fine Scientific | 19007-05; 19007-07) | surgery and stereotaxic injection |
| Sterilizing bath | FST | 18000-45, Hot Bead Sterilizer | surgery and stereotaxic injection |
| isoflurane chamber/mask | Highland Medical Equipment | 564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm | surgery and stereotaxic injection |
| 3D scope with arm | Zeiss | surgery and stereotaxic injection | |
| fiber optic light | surgery and stereotaxic injection | ||
| Betadine | surgery and stereotaxic injection | ||
| 70 % (v/v) isopropyl alcohol | surgery and stereotaxic injection | ||
| Povidone-Iodine Prep Pads | dynarex | 1108 | surgery and stereotaxic injection |
| NaCl 0.9% (injection, USP, 918610) | surgery and stereotaxic injection | ||
| CYCLOSPORINE (INJECTION, USP) | surgery and stereotaxic injection | ||
| Buprenex (injection) buprenorphine (0.03 μg per g rodent) | Sigma-Aldrich | surgery and stereotaxic injection | |
| Ophthalmic ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | surgery and stereotaxic injection |
| Surgifoam | Ethicon | surgery and stereotaxic injection | |
| Grip dental cement | Dentsply | #675571, 675572 | surgery and stereotaxic injection |
| Instant SuperGlue | NDindustries | surgery and stereotaxic injection | |
| LOCTITE 4041 | surgery and stereotaxic injection | ||
| METABOND | C&B | surgery and stereotaxic injection | |
| no. 0 cover glass | Fisher | surgery and stereotaxic injection | |
| stereotaxic frame | Kopf | surgery and stereotaxic injection | |
| Rectal probe and heating pad | FHC | 40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe | surgery and stereotaxic injection |
| optical breadboard for imaging | Thorlabs | surgery and stereotaxic injection | |
| Mineral oil | Fisher | S55667 | surgery and stereotaxic injection |
| Kwik-Cast (Silicone elastomer) | World Precision Instruments | surgery and stereotaxic injection | |
| Suture | Ethicon | 18’’, 1667, 4-0 | surgery and stereotaxic injection |
| Scissors | Fine Scientific Tools | 91500-09, 15018-10 | surgery and stereotaxic injection |
| Forcepts | Fine Scientific Tools | 11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10 | surgery and stereotaxic injection |
| Student Halsted-Mosquito Hemostats | Fine Scientific Tools | 91308-12 | surgery and stereotaxic injection |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Scientific Tools | 18000-00 | surgery and stereotaxic injection |
| Hot Bead Sterilizers | Fine Scientific Tools | 18000-45 | surgery and stereotaxic injection |
| Instrument Case with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20311-21 | surgery and stereotaxic injection |
| Plastic Sterilization Containers with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20810-01 | surgery and stereotaxic injection |
| 2P fixed-stage fluorescence scope for in vivo imaging | Olympus | FV1200 MPE | in vivo imaging |
| Multiphoton laser | SpectraPhysics | Mai Tai DeepSee | in vivo imaging |
| Green Laser | Olympus | 473 nm Laser | in vivo imaging |
| xy translational base | Scientifica | MMBP | in vivo imaging |
| FRET filter cube for YFP and CFP | Olympus | in vivo imaging | |
| 10x and 40x water immersion objectives | Olympus | in vivo imaging | |
| air table | Newport | in vivo imaging | |
| custom built light-tight cage | Thorlab | in vivo imaging |
References
- Day, J. C., Kornecook, T. J., Quirion, R. Application of in vivo. microdialysis to the study of cholinergic systems. Methods. 23, 21-39 (2001).
- Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo. Clin Chem. 49, 1763-1773 (2003).
- Liang, R., Broussard, G. J., Tian, L. Imaging Chemical Neurotransmission with Genetically Encoded Fluorescent Sensors. ACS Chem Neurosci. , (2015).
- Okubo, Y., et al. Imaging extrasynaptic glutamate dynamics in the brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 6526-6531 (2010).
- Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10, 162-170 (2013).
- Nguyen, Q. T., et al. An in vivo biosensor for neurotransmitter release and in situ receptor activity. Nat Neurosci. 13, 127-132 (2010).
- Muller, A., Joseph, V., Slesinger, P. A., Kleinfeld, D. Cell-based reporters reveal in vivo dynamics of dopamine and norepinephrine release in murine cortex. Nat Methods. 11, 1245-1252 (2014).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. , e3998 (2012).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. , (2009).
- Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Gjα. Nature. 363, 274-276 (1993).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1, 3166-3173 (2006).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. , (2012).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nat Methods. 7, 981-984 (2010).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1277-1309 (2012).
- Yamauchi, J. G., et al. Characterizing ligand-gated ion channel receptors with genetically encoded Ca2+ sensors. PLoS One. 6, e16519 (2011).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Cui, G., et al. Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation. Nature. 494, 238-242 (2013).
