Summary
We presenteren een protocol om op cellen gebaseerde neurotransmitter fluorescerende engineered reporters (CNiFERs) te creëren voor de optische detectie van volumetrische neurotransmitter release.
Abstract
Celgebaseerde neurotransmitter fluorescente reporters gemanipuleerd (CNiFERs) een nieuw instrument voor neurologen optisch detecteren van de afgifte van neurotransmitters in de hersenen in vivo. Een specifieke CNiFER werd uit een humane embryonale niercellijn die stabiel tot expressie brengt een specifieke G-eiwit gekoppelde receptor, die paren Gq / 11 G-eiwitten, en een op FRET gebaseerde Ca2 + -detector, TN-XXL. Activering van de receptor leidt tot een verhoging van het FRET signaal. CNiFERs hebben nM gevoeligheid en een temporele respons seconden omdat CNiFER kloon maakt gebruik van de natuurlijke receptor voor een bepaalde neurotransmitter, bijvoorbeeld D2R voor dopamine. CNiFERs worden direct geïmplanteerd in de hersenen, waardoor zij neurotransmitter afgifte zin met een ruimtelijke resolutie van minder dan honderd micrometer, waardoor ze ideaal volume transmissie in vivo meten. CNiFERs kan ook worden gebruikt om andere middelen te onderzoeken op mogelijke kruisreactiviteit in vivo. We hebben onlangs breidde de familie van CNiFERs om GPCR's omvatten die koppelen aan G i / o G-eiwitten. CNiFERs zijn beschikbaar voor het detecteren van acetylcholine (ACh), dopamine (DA) en norepinefrine (NE). Aangezien elke GPCR kan worden gebruikt om een nieuwe maken CNiFER en dat er ongeveer 800 GPCRs in het menselijk genoom beschrijven we hier de algemene procedure voor het ontwerpen, realiseren en testen elk type CNiFER.
Introduction
Om volledig te begrijpen hoe neuronen communiceren in de hersenen, is het noodzakelijk om een werkwijze voor de afgifte van neurotransmitters in vivo te meten. Er zijn verschillende gevestigde technieken voor het meten neurotransmitters in vivo. Een algemeen gebruikte techniek is microdialyse, waarin een canule in de hersenen is geplaatst en een kleine hoeveelheid cerebrospinale vloeistof wordt verzameld en geanalyseerd met behulp van hoge-prestatie vloeistofchromatografie en elektrochemische detectie 1. Microdialyse een ruimtelijke resolutie in de orde van enkele diameter van de sonde, bijvoorbeeld ~ 0,5 mm voor een 200 urn diameter microprobe. De tijdsresolutie van deze techniek is echter traag vanwege sampling intervallen die duren meestal ~ 5 min of meer 1. Bovendien zijn analyses niet in real-time. Een andere techniek is snel scannen cyclische voltammetrie (FSCV), die een koolstofvezel sonde die in de hersenen wordt ingevoegd gebruikt. FSCV heeft uitstekende temporale resolutie (subsecond), hoge gevoeligheid (nanomolair), en ruimtelijke resolutie met een diameter van de sonde van 5 tot 30 pm. Echter, FSCV beperkt tot zenders die een karakteristiek oxidatie en reductie profiel met spanning te produceren op een koolstofatoom potentiometrische probe 2.
Een derde techniek om neurotransmitters te meten is rechtstreeks via genetisch-gecodeerde neurotransmitter (NT) biosensoren 3. Bij deze methode wordt een fusie-eiwit gevormd dat een ligand bindend domein een zender gekoppeld met een fluorescentie-energieoverdracht (FRET) gebaseerde paar fluoroforen 4 of 5 gepermuteerde GFP bevat. In tegenstelling tot de vorige twee werkwijzen worden deze biosensoren genetisch gecodeerde en tot expressie gebracht op het oppervlak van een gastheercel, zoals een neuron, door de productie van transgene dieren of acuut bij gebruik van virale middelen om cellen te infecteren. Tot op heden zijn genetisch gecodeerd biosensoren is alleen ontwikkeld voor detecting glutamaat en GABA 3-5. Beperkingen met deze technieken de lage gevoeligheid, in het nM bereik, en het onvermogen om de detectie uit te breiden naar het grote aantal zenders, bijvoorbeeld klassieke neurotransmitters, neuropeptiden en neuromodulators, welk signaal door middel van G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCR's) zijn. In feite, zijn er bijna 800 GPCRs in het menselijk genoom.
Om deze tekortkomingen aan te pakken, hebben we een innovatief hulpmiddel om optisch maatregel vrijkomen van neurotransmitter die door middel van een GPCR signaleert ontwikkeld. CNiFERs (cell-based neurotransmitter fluorescente reporters gemanipuleerde) zijn klonale HEK293 cellen ontworpen om een specifieke GPCR dat, wanneer gestimuleerd, veroorzaakt een toename van intracellulaire [Ca2 +] die wordt gedetecteerd door een genetisch gecodeerde FRET gebaseerde Ca2 + sensor drukken, TN-XXL. Aldus CNiFERs transformeren neurotransmitter receptor binding in een verandering in fluorescentie, een directe en real-time optische read-out van de lokale neurotransmitter activiteit. Door gebruikmaking van de natuurlijke receptor voor een bepaalde neurotransmitter, CNiFERs behouden chemische specificiteit, affiniteit en temporele dynamiek van het endogeen tot expressie receptoren. Tot op heden zijn er drie soorten CNiFERs, één voor het detecteren van acetylcholine met de M1 receptor, één voor het detecteren van dopamine aangemaakt met de D2-receptor en één voor het detecteren van norepinefrine met de receptor α1a 6,7. De CNiFER technologie is gemakkelijk uitbreidbaar is, waardoor het vatbaar voor elk type GPCR. In dit artikel Jupiter beschrijven we en illustreren de werkwijze voor het ontwerpen, realiseren en testen in vivo CNiFERs voor elke toepassing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures uitgevoerd in deze studie zijn in overeenstemming met Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) richtlijnen, en zijn door de IACUCs aan de Icahn School of Medicine op de berg Sinaï en de University of California, San Diego goedgekeurd.
1. Genereren GPCR tot expressie Lentivirus te transformeren HEK293 cellen
- Verkrijgen het cDNA voor een specifieke GPCR uit een commerciële bron, bijvoorbeeld cdna.org. Alternatief versterken het GPCR-gen uit een cDNA bibliotheek met behulp van PCR. Het verkrijgen van een lentivirus tot expressie vector, zoals pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro (pCDH). Met deze vector het DNA verspreiden en aan lentivirus genereren.
- Kloon de GPCR cDNA in de lentivirus expressie vector door PCR. Zie Lorenz 8, voor meer informatie over PCR subklonering.
- Uit te breiden en te zuiveren van de GPCR-pCDH DNA met behulp van een endotoxine-vrij 'maxi' prep kit volgens de instructies van de fabrikant. Bevestigen dat de GPCR cDNA gesubkloneerd in pCDH is mutatie-vrij door DNA sequentiebepaling.
Opmerking: Alvorens zijn DNA voor virusproductie verteren een monster met geschikte restrictie-enzym op maat van insert en zuiverheid van DNA te bevestigen. - Genereer lentivirus met behulp van een virus kernfaciliteit, zoals een op het Salk Institute, Universiteit van Penn., Of de Universiteit van North Carolina, enz., Of het genereren van in-house 9. Met ongeveer 25 ug (> 1 ug / ul) endotoxine-vrij DNA voor transfectie van HEK cellen in een T75 fles. Waarborgen dat het DNA van hoge zuiverheid, met een absorptie verhouding (A260 / A280) van ~ 1,8.
Noot: De titers van virus ~ 10 11 -10 12 GC / ml zijn optimaal voor transductie van HEK293 cellen.
2. Het kiezen van HEK293 / TN-XXL Backbone Cell Type voor het kweken van In Vitro
Opmerking: Bepaal de G-eiwit koppelen specificiteit, bijvoorbeeld Gi / o, Gq / 11 of G s G proteïnen van de GPCR, omdat dit dictates of een chimeer G-eiwit is nodig voor de CNiFER. Voor G q -gekoppelde receptoren, bijvoorbeeld M1 muscarinische receptor, kiest HEK293 / TN-XXL (# 3G8) als de ruggengraat HEK293 celtype. Voor Gi / o -gekoppelde receptoren, wordt het chimere G-eiwit G qi5 10 nodig. Voor G s -gekoppelde receptor, is de G qs5 hersenschim nodig 10. In dit protocol wordt de bouw van een D2R CNiFER als voorbeeld gebruikt. D2R signalen via G i / o G-eiwitten en vereist HEK293 cellen die stabiel het chimere G-eiwit, G qi5, bijvoorbeeld HEK293 / TN-XXL / G qi5 _ # qi5.6 uiten.
- Het verkrijgen van de HEK293 / TN-XXL / G qi5 _ # qi5.6 klonale cellen uit een onderzoekslaboratorium. Opmerking: De volgende klonale cellen, HEK293 / TN-XXL (# 3G8) voor G q -gekoppelde receptoren, HEK293 / TN-XXL / G qi5 (# qi5.6) voor G i / o -gekoppelde receptoren en HEK293 / TN -XXL / G qs5 (# qs5.47) voor G s -gekoppelde rereceptoren, zijn op aanvraag 6,7 vrij beschikbaar.
- Groeien en uitbreiden HEK293 / TN-XXL / G qi5 _ # qi5.6 tot ~ 90% confluentie in een T25 kolf met 5 ml HEK293 groeimedia (tabel 1). Groeien de cellen in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% (v / v) CO 2.
Let op: Alle werkzaamheden met het kweken van HEK293 cellen dient te worden uitgevoerd met behulp van standaard steriele weefselkweek technieken. - Oogst de HEK293 cellen door eerst opzuigen media uit T25 fles. Was de cellen voorzichtig door toevoeging van 5 ml PBS en schommelen kolf.
- Verwijder de PBS en voeg 1 ml van 0,05% (w / v) trypsine / EDTA (tabel 2). Incubeer gedurende 1 tot 2 min bij 37 ° C met 5% (v / v) CO 2.
- Verzamel cellen en overbrengen naar 15 ml conische buis steriel. Centrifugeer 5 min bij 1000 xg in een celkweek centrifuge. Zuig het supernatant.
- Resuspendeer de celpellet in 5 ml HEK293 groeimedia. Tel de cellen in een hemocytometer gebruikttrypan blauw. Bereken de cel dichtheid en ga verder met stap 3.
3. Lentivirale transductie van HEK293 / TN-XXL / Gqi5 Cells
- Seed een T25 fles met 0,7 x 10 6 HEK293 / TN-XXL / G qi5 cellen. Groeien de cellen in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% (v / v) CO 2 tot ~ 50% confluent na ongeveer 1 dag. Freeze overgebleven cellen (stappen 8,2-8,3). Deze cellen zullen dienen als CNiFER control, dwz een CNiFER dat de GPCR mist.
- Op de dag van de infectie, verdunnen de GPCR tot expressie lentivirus (stap 1,4) tot een uiteindelijke concentratie van 10 ~ 9 GC / ml in een totaal volume van 2 ml HEK293 groeimedia (tabel 1). Bijvoorbeeld, voeg 20 gl 10 11 GC / ml virus 2 ml medium in een T25 fles.
Opmerking: Het virus titer informatie moet worden verstrekt door het virus kernfaciliteit. Combineer lentivirus en media in een centrifugebuis en vermaal voorzichtig. Hoge titers van lentivirus zijn bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2). - Zuig het materiaal uit de T25 fles. Voeg de 2 ml van het virus / media mengsel van stap 3.2. Incubeer de T25 kolf O / N bij 37 ° C met 5% (v / v) CO 2.
- Na een dag van infectie zuig het virus / Media mengsel en vervangen HEK293 groeimedia bevattende puromycine (2 pg / ml; Tabel 1). Puromycine selecteert op de getransduceerde cellen. Incubeer de kolf bij 37 ° C met 5% (v / v) CO 2 tot ongeveer 90% confluent na ~ 1-2 dagen.
- Bereid een 96-putjesplaat (zwart met heldere bodem) bekleed met fibronectine, voor het opwekken van een 10-punts agonist / activatie kromme in stap 4,1. In een steriele kap, voeg 50 ul fibronectine (5 ug / ml) per putje in rijen A en B van de 96-well plaat. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Spoel tweemaal gedurende 5 minuten per spoelen met PBS. Voeg 50 ul van HEK293 groeimedia en geïncubeerd O / N bij 37 ° C met 5% (v / v) CO 2.
Opmerking: Fibron-Ectin behandelde platen zijn in de handel verkrijgbaar. - Oogst de cellen in de T25 kolf zoals beschreven in stappen 2.3-2.6 (tabel 2).
- Resuspendeer de celpellet in 5 ml HEK293 groeimedia. Seed een T25 fles met 1,5 ml van cellen voor FACS analyse. Ook zaad een T75 fles met 1 ml van de cellen voor het invriezen en opslag (zie stap 8,2-8,3)
- Voor de 10-punts curve agonist, zaad de eerste twee rijen (A en B) van een met fibronectine gecoate 96-well plaat (uit stap 3.5) met 100 ul van de celsuspensie per putje.
- Incubeer HEK293 cellen groeien in een T25 fles, een T75 kolf en een 96-well plaat tot ongeveer ~ 90% confluent bij 37 ° C met 5% (v / v) CO 2 na ~ 1-2 dagen.
4. FACS en isolatie van Single CNiFER Clones
- Gebruik de 96-well plaat voor het opwekken van een 10-punts curve agonist activering.
Opmerking: Voordat fluorescentie geactiveerde celsortering analyse (FACS), is het belangrijk om het bevestigenexpressie van de GPCR door het testen getransduceerde cellen voor een agonist respons (10-punts curve agonist). Deze test wordt uitgevoerd met een fluorometrische plaat reader.- Bereid een medicijn plaat voor de 10-punts agonist activering curve. Kies 10 verschillende concentraties agonist beugel de voorspelde EG 50, die kan worden bepaald uit de literatuur.
Opmerking: De drug plaat bevat 3-voudige van elke concentratie (in tweevoud) aan te passen voor de 1: 3 verdunning in de CNiFER plaat. Bijvoorbeeld, het geneesmiddel dienblad testen van een D2 CNiFER bevat 10 verschillende concentraties van dopamine bij 3-voudige concentraties; 0,2, 0,5, 1, 3, 5, 10, 20, 30, 50 en 1000 nM. In de CNiFER plaat derhalve de eindconcentraties van dopamine zijn 0,067, 0,167, 0,333, 1,00, 1,67, 3,33, 6,67, 10,0, 16,7 en 333 nM. - Bereid de agonist oplossingen met kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) (Tabel 1). Gebruik twee putjes "ACSF", bijvoorbeeld, A1 en A2,en twee putjes "geen cellen, bijvoorbeeld, B1 en B2.
Opmerking: Bereid verschillende concentraties van geneesmiddelen een seriële verdunningsmethode. Een sjabloon volgen CNiFER klonen en geneesmiddelconcentraties (figuur 3) te houden. - Gebruik de software om de 96-well fluorometrische plaatlezer voor het meten van FRET en het uitvoeren van transfers oplossing te programmeren.
- Stel de plaatlezer temperatuur tot 37 ° C.
- Voor het meten van FRET met TN-XXL, stelt de excitatie golflengte 436 ± 4,5 nm (midden ± HWHM). Stel de emissie filters om 485 ± 7,5 nm voor eCFP en 527 ± 7,5 nm voor Citrine. Stel de cutoff filter tot 475 en 515 nm voor eCFP en Citrine, respectievelijk.
- Programmeer de plaat lezer om emissie te meten bij 485 nm en 527 nm om de 4 seconden voor een totaal van 180 sec. Kies de optie om 50 ul bevrijden van de 3-voudige drug plaat om de 100 ul in de CNiFER plaat, na het verzamelen van 30 secbasislijn fluorescentie.
- Zuig het medium van rijen A en B en voeg 100 ul van ACSF de 96-well plaat met CNiFER ~ 90% confluent (stap 3,9).
- Laad de 96-well CNiFER bord en de '3-voudige' drug plaat in de plaat lezer. Sta ~ 30 min aan de platen equilibreren bij 37 ° C. Vervolgens start het programma.
- Om plaatlezer gegevens te analyseren, de uitvoer van de fluorescentie waarden naar een spreadsheet. Maak een formule om de achtergrond metingen (genomen voor elk signaal uit putten zonder cellen) uit putten met CNiFERs aftrekken. Normaliseren fluorescentie-intensiteiten voor een pre-stimulus basislijnen, F Citrine (t) / F Citrine (baseline), en bereken de FRET-ratio (AR / R;. Vergelijking 1) met de piek reacties bij 527 nm en 485 nm emissies (zie stap 11 ).
Opmerking: Als er een significante verandering van AR / R met de agonist, dan geeft dit blijk van de GPCR en men kan overgaan tot de FACS analyse (stap 4,2). Als there is geen FRET respons met agonist, oplossen door gebruik te maken van een Ca 2+ ionofoor, bijvoorbeeld, A21387, de Ca 2+ respons te testen en te bevestigen dat FRET-gebaseerde sensor werkt. Als de ionofoor werkt, dan is de receptor niet tot expressie waarschijnlijk.
- Bereid een medicijn plaat voor de 10-punts agonist activering curve. Kies 10 verschillende concentraties agonist beugel de voorspelde EG 50, die kan worden bepaald uit de literatuur.
- Op de dag voor FACS bereiden vier 96-putjesplaten bekleed met fibronectine (zie stap 3,5) voor het verzamelen van de cellen gesorteerd. Voeg 50 ul van HEK293 groeimedia en geïncubeerd O / N bij 37 ° C met 5% (v / v) CO 2.
- Bereid 5% (w / v) BSA in PBS (5 g / 100 ml) en filter (0,2 pm) in een steriele fles.
- Oogst de cellen gekweekt in T25 kolf (zie stap 2,3-2,5, Tabel 2). Resuspendeer de celpellet in 4 ml 5% (w / v) BSA in PBS. Centrifugeer de cellen bij 1000 g gedurende 5 min.
- Zuig het medium en resuspendeer de celpellet in ~ 5 ml van 5% (w / v) BSA in PBS tot een eindconcentratie van 5 x 10 ~ 6 cellen / ml.
Opmerking: Informeer bij de FACS kernfaciliteit voor specifieke eisen aan celdichtheid en sorteren omstandigheden. - Filter de geresuspendeerde cellen met een 40 micrometer cel zeef om de klonten te verwijderen. Overdracht van de cellen aan een 5 ml polypropyleen ronde bodem buis. Plaats de buis op ijs voor transport naar de FACS faciliteit.
- Sorteren getransduceerde HEK293 cellen bij een FACS faciliteit. Programmeer de parameters op een FACS flowcytometer als volgt: set 4 ° C gedurende de monsterhouder, 100 urn voor het mondstuk en 20 psi. Op basis van de pre-sort analyse, selecteert u de cellen, dat wil zeggen, kies dan een 'gate', dat een groot eCFP fluorescentie (eCFP excitatie, eCFP emissie) en grote FRET (eCFP excitatie, Citrien emissie) fluorescentie (zie resultaten hieronder, Figuur 2 ).
- Storting individu gesorteerd cellen in een 96-well plaat bereid in stap 4,2, met één kloon per putje 50 pl HEK293 groeimedia met puromycine. Voeg 50 ul van HEK293 groeimedia met puromycine (Table 1) voor een totaal van 100 gl per putje. Handhaaf cellen O / N bij 37 ° C met 5% (v / v) CO 2.
Opmerking: HEK293 groeimedia bevat puromycine voor de selectie van getransduceerde cellen.
5. Het kweken en uitbreiding van gesorteerde, klonen CNiFERs
- Handhaaf de CNiFERs in de 96-well platen door het verwijderen van 50 pl oude media uit elk putje en vervangen door 50 pi vers HEK293 groeimedia bevattende puromycine (tabel 1). Herhaal dit elke 5-7 dagen tot ~ 90% confluent na 2-3 weken.
- Harvest CNiFER cellen door voorzichtig opzuigen van de media en spoelen eenmaal voorzichtig met PBS. Verwijder de PBS en voeg 20 ul van 0,05% (w / v) trypsine / EDTA. Incubeer gedurende 1 tot 2 min bij 37 ° C met 5% (v / v) CO 2.
- Voeg 100 ul van HEK293 groeimedia naar trypsine behandelde cellen en resuspendeer de cellen. Transfer inhoud van een 24-well plaat met 400 ul vers HEK293 groeimedia with puromycine. In de 24-well plaat, behouden cellen door het vervangen 250 pl HEK293 groeimedia elke 5-7 dagen tot putten ~ 90% confluent.
6. Identificeer kandidaat CNiFERs Op basis van FRET Response gebruik van Fluorometric Plate Reader
Opmerking: Met vier 96-well platen na FACS, er moet> 100 testbare klonen die overleven en breiden de 24-well plaat fase, omdat veel van de oorspronkelijke klonen onvoldoende groeien. Om potentiële kandidaat CNiFERs identificeren, gebruik maken van een 3-punts-analyse voor de FRET respons met verwante agonist, bijvoorbeeld dopamine voor D2R.
- Wanneer de cellen ~ 90% confluent in 24-well plaat, Zuig voorzichtig de media. Voeg ~ 100 ul van 0,05% (w / v) trypsine / EDTA en incubeer gedurende 1-2 minuten bij 37 ° C met 5% (v / v) CO 2. Voeg 400 ul van HEK293 groeimedia naar trypsine behandelde cellen en meng de cellen door voorzichtig trituratie.
- Het opzetten van de 3-punts-agonist curve voor de eerste screening van de clones. Voor elke CNiFER kloon, dat wil zeggen, één van de putjes van de 24-well plaat, monster 100 pl van de celsuspensie (~ 4 x 10 3 cellen / putje) in elk van drie putjes, bijvoorbeeld A1, A2, A3, van een met fibronectine gecoate 96-well plaat (zwart met heldere bodem) (zie stap 3,5).
- Draagt de resterende ~ 200 ul van de celsuspensie aan een 12-well plaat met 1000 pi HEK293 groeimedia (1,2 ml eindvolume). Incubeer beide platen bij 37 ° C met 5% (v / v) CO 2, tot ~ 90% confluent. De 96-well plaat is voor de fluorometrische assay en de 12-well plaat is voor het kweken en uitbreiden van de klonen.
- Voor de 3-point analyse, bepalen drie verschillende concentraties van agonist die 0,1-, 1,0- en 10-maal de EC50 voor de specifieke GPCR. Bereid agonist concentraties in een drug plaat zoals beschreven in de stappen 4.1.1-4.1.2. Voer een fluorometrische plaat reader test zoals beschreven in de stappen 4.1.3-4.1.5.
- Bereken de FRET-verhouding (AR / R) zoals beschreven in stap 4.1.6. Kies CNiFERs passende gevoeligheid en grootste FRET respons voor expansie, bevriezen terug en uitgebreidere analyse (stap 7).
- Voor de klonen die werden geselecteerd in stap 6,5 en groeien in de 12-well plaat, verwijderen en vervangen 600 ul van de HEK293 groeimedia elke 5 tot 7 dagen, tot ~ 90% confluent.
- Geleidelijk de klonen uit een 12-wells plaat uitbreiden tot een 6-well plaat, en dan naar een T25 kolf (stappen 2,3-2,6 en tabel 2). Wanneer de T25 kolf ~ 90% confluent, oogst cellen zoals beschreven (stappen 2.3-2.5). Resuspendeer de celpellet in 5 ml HEK293 groeimedia.
- Voeg 1 ml celsuspensie met een T75 kolf met 9 ml HEK293 groeimedia. Met de resterende 4 ml van de celsuspensie voor cryobescherming en opslag in vloeibare N2 (stappen 8,2-8,3). Bereid acht 1,5 ml cryotubes en plaats op ijs.
- In de T75 kolf te handhaven cellen door vervanging van de media wet verse HEK293 groeimedia, bv 10 ml elke 3-5 dagen tot 70-80% samenvloeiing na ~ 1-2 weken.
7. definitieve selectie van CNiFER Clones behulp Fluorometric Plate Reader
- Op de dag voor de plaat lezer test:
- Oogst cellen van een ~ 90% confluent T75 kolf (zie stap 2,3-2,6, tabel 2). Zaad een 96 putjes met fibronectine gecoate plaat (zwart met heldere bodem) en 5 x 10 4 / putje met ~ 100 pi celsuspensie. Opmerking: Eén kloon wordt verdeeld in een 96-well plaat.
- Bereid een medicijn plaat voor de uitgebreide screening van CNiFER klonen, waarbij onderscheid wordt specifieke agonist reacties van niet-specifieke CNiFER reacties.
- Een volledige dosis-respons curve te genereren, selectie van 10 agonist concentraties rond de verwachte 50 EC. Gebruik twee putten voor 'geen cellen' en twee putten voor 'ACSF'.
- Voor het bepalen van de niet-specifieke antwoorden, kiezen three concentraties van 12 verschillende neurotransmitters of modulatoren (72 putjes) (figuur 3). Net als de agonist, het medicijn plaat bevat 3-voudige concentraties in tweevoud. Bijvoorbeeld 100 gl drie verschillende concentraties van acetylcholine, glutamaat, orexin, VIP, adenosine, serotonine, noradrenaline, GABA, Substantie P, melatonine, somatostatine en histamine, telkens in een 3-voudige concentratie van 50, 1000, en 3000 nM wordt geladen in de 96-well plaat drug.
- Stel de parameters op de fluorometrische plaat lezer voor het meten van FRET en het uitvoeren van transfers oplossing zoals beschreven in de stappen 4.1.3-4.1.5.
- Voor het analyseren van de volledige dosis responscurve Bereken de piek FRET verhouding (AR / R) (stap 4.1.6), plot als functie van log agonist concentratie en passen bij de Hill-vergelijking (stap 11.4). Bepaal de EC 50, Hill-coëfficiënt, en maximale FRET-ratio. Voor de 12 andere neurotransmitters / modulators, plot piek AR / R als functie of drug concentratie.
- Kies ~ 10 CNiFER klonen die een groot FRET verhouding, een geschikte EC 50 voor de verwante agonist, en weinig of geen achtergrond reacties op andere neurotransmitter agonisten (niet-specifieke reactie) hebben.
8. Freeze-back Geselecteerde CNiFER Clones
- Gebruik een ~ 90% confluent T75 kolf van een individuele CNiFER kloon. Oogst cellen zoals beschreven (stap 2,3-2,5, Tabel 2). Voor het invriezen cellen resuspendeer de celpellet in 5 ml HEK293 groeimedia. Label tien 1,5 ml cryotubes en zet op ijs.
- Voor cryoprotection Meng cellen 1: 1 met 20% (v / v) DMSO in HEK293 groeimedia, bijvoorbeeld 5 ml van de 20% (v / v) DMSO / media mengsel wordt voorzichtig gemengd met 5 ml celsuspensie (final concentratie van DMSO is 10%).
- Aliquot 1 ml in elk van de cryobuizen. Freeze buizen met cellen in een -80 ° C vriezer O / N, in een schuim-geïsoleerde box (zie materialen). Transfer cryotubes naar Liquid stikstof voor langdurige opslag.
9. CNiFER implantatie in Mouse Cortex
- Steriliseren alle chirurgische instrumenten in een autoclaaf voor de operatie. Bereid een semi-steriele veld voor de operatie door bestrijken met 70% ethanol en tot vaststelling van een schone lab luier.
- Bereid de CNiFER injectie pipet door het trekken van een glazen capillaire (id van 0,53 mm) op een verticale elektrode puller. Gebruik een paar niet. 5 fijne punt tang om de punt van de elektrode te breken tot een diameter van ~ 40 urn.
Opmerking: Dit wordt het beste bereikt in het kader van een stereo-zoom microscoop met een raster. - Verdoven volwassen (postnatale dag 60-90) C57BL / 6 muis met isofluraan: 4% (v / v) (v / v) voor inductie en 1,5 tot 2,0% voor onderhoud. Gebruik staart of teen knijpen om ervoor te zorgen dat de muis is volledig verdoofd.
Let op: Re-pinch periodiek beoordelen snorhaar spiertrekkingen hele operatie om de diepte van de anesthesie opnieuw te beoordelen. - Bedek de ogen met oogzalf pRevent drogen. Monteer de muis in een stereotaxische frame met oor bars. Handhaaf de muis lichaamstemperatuur bij 37 ° C onder toepassing van een warmte pad geregeld door een rectale sonde.
- Scheren een oppervlakte van ongeveer 5 mm bij 12 mm met een dier elektrisch scheerapparaat. Toepassen Betadine gevolgd door 70% (v / v) isopropanol. Gebruik een scalpel te snijden en de huid te verwijderen over de schedel oppervlak. Gebruik een scalpel het periosteum van het oppervlak van de schedel verwijderd. Expose en reinig het oppervlak van de schedel, zoals beschreven voor stereotaxische chirurgie 11.
- Verlaag een leeg glas pipet tot bregma en noteer de antero-posterior (A / P) en medio-laterale (M / L) coördineert. Verwijzend naar de muizenhersenen atlas, berekent de positie van de injectieplaats. Verschuiving van de pipet op de beoogde plaats en markeer de schedel voor volgende venster vorming. Zie Cetin et al. Voor meer informatie over stereotaxische injecties met knaagdieren 11.
Opmerking: De injectieplaats en raam afhankelijk Region te bestuderen en de verdeling van neurotransmitter of peptide los uitsteeksels in de cortex. Bijvoorbeeld, in een recente publicatie 7, de stereotaxische coördinaten 1,0-2,0 mm A / P en 1,0-2,0 mm M / L werden gebruikt om cellen te injecteren in CNiFER frontale cortex voor in vivo beeldvorming van dopamine afgifte in klassieke conditionering . - Vorm een 2 mm x 3 mm verdund-schedel venster zoals eerder beschreven 12,13.
Opmerking: Het bot in het venster moet 15-20 urn dik. De kleine witte vlekken in het bot niet zichtbaar wanneer de schedel oppervlak wordt bevochtigd, wanneer het bot voldoende verdund 12,13. - Plaats een ACSF doordrenkte spons op het venster om het vochtig te houden tijdens het bereiden van cellen te injecteren.
- Oogst de CNiFER kloon die werd gekweekt in een T75 kolf ~ 80% confluentie. Zuig het medium en was de cellen met steriel PBS.
Opmerking: trypsine is weggelaten voor deze stappen. - Verwijder PBS en gebruik 10 ml of ACSF om cellen los van de bodem van de kolf. Fijnstampen cellen naar cel klonten distantiëren. Centrifugeer en resuspendeer de pellet in 100 pl ACSF. Centrifugeer gedurende 30 seconden bij 1400 x g en de bovenstaande vloeistof, waardoor een pellet bedekt met ACSF. Deze stap laat een klompje cellen in suspensie.
- Backfill de injectie pipet bereid in stap 9.2 met minerale olie, laadt u het pipet op een nanoinjector, en vooraf de zuiger om een kleine kraal van de olie uit te werpen. Zet 5 ui CNiFER celsuspensie op een strook van plastic paraffine film in de buurt van de muis voorbereiding. Opstellen ofwel de CNiFERs of de controle CNiFER cellen in de getrokken pipet.
- Beweeg de pipet naar het doel X- en Y-coördinaten, dat wil zeggen, A / P en M / L uit stap 9.5. Laat de pipet, het doorprikken van de verdunde schedel, en blijven ~ 200-400 micrometer onder de schedel oppervlak, om CNiFER cellen in lagen 2/3 van de cortex te deponeren.
- Injecteren ~ 4.6 nl van CNiFER cellen op het diepste site met de nanoinjector, nota beweging in de olie-en mobiele interface en dan wachten op 5 min voor de cellen af te zien. Trek de pipet ~ 100 micrometer en injecteer een ander ~ 4.6 nl van CNiFER cellen, wacht 5 min. Daarna trekken de pipet langzaam en voorzichtig om terugstromen van de CNiFERs voorkomen. Herhaal injectie op één of meer aansluitende gebieden.
- Herhaal de injectie stappen 9,8-9,12 met controle HEK293 cellen (dat wil zeggen, HEK293 / TN-XXL / G qi5 kloon ontbreekt GPCR). Scheid de CNiFER en de controle cel injectieplaatsen door ~ 200 urn.
- Na het voltooien van cel implantaties, spoel de verdunde-schedel venster met ACSF en wacht tot de schedel te drogen. Breng een druppel cyanoacrylaat lijm (zie Materialen) over het venster wordt snel een voorgesneden steriele dekglas bovenop de lijm. Duw de dekking van glas tegen de schedel voor een paar seconden. Laat de lijm drogen voor 2 min 12,13.
- Dicht de randen van het dekglas met tandheelkundige cement en vorm awell rond het venster om water te houden voor de dompelen doelstelling.
- Voor het immobiliseren van het hoofd van de muis tijdens de beeldvorming, bevestig een custom-built head-bar met een kleine druppel cyanoacrylaatlijm achter het venster (zie 14 voor meer informatie over afmetingen en materialen). Laat de lijm goed drogen en voeg vervolgens aanvullende tandheelkundige cement om de custom-built head-bar verder te versterken.
- Bedek de rest van de schedel oppervlak, met uitzondering van het venster, met een laag tandheelkundig cement. Zorg ervoor dat de randen van de huid onder cement en laten drogen 20 min.
- Na de operatie, stoppen met isofluraan administratie en laat de muis op een verwarmingselement in een kooi totdat deze volledig herstelt van anesthesie. Injecteer 5% (w / v) glucose in zoutoplossing (sc) voor rehydratatie en 0,05-0,1 mg / kg buprenorfine (ip, onmiddellijke afgifte) voor post-operatieve analgesie.
Opmerking: Om potentiële immunologische reactie op het menselijk CNiFERs minimaliseren, injecteer de muis per dag met 20 pl / 100 g cyclosporine (ip) starten de dag voor de injectie van CNiFERs. - Zet de muis aan zijn kooi voor voedsel en water.
10. In vivo beeldvorming van CNiFER Clones
NB: Live beeldvorming wordt uitgevoerd met muizen met een twee-foton microscoop en een hoofd-vaste inrichting. Geen verdoving nodig is tijdens de beeldvorming sessies. Wanneer beeldvorming dieren in de wakkere staat, te beperken hoofdsteun tot slechts een paar uur per keer om stress te verminderen. Breng het dier naar huis kooi tussen de beeldvorming sessies voor voedsel en water. Potentiële belasting wordt geminimaliseerd door verduisteren verlichting in de kamer en de omliggende deel van de muis in een behuizing.
- Op de dag na de operatie, zet de muis op een imaging platform door vastschroeven van de metalen kop-bar geïmplanteerd op de schedel aan het hoofd-fixatie frame.
Opmerking: Wanneer de beeldvorming wakker muizen, moet de opnamesessie niet meer dan een paar uur te wijten aan de mogelijke stress veroorzaakt door de hoofdsteun apparaat. - Plaats de imaging platform met de kop tegengehouden muis in een twee-foton imaging microscoop uitgerust met een 10X (0,30 NA) en 40X (0,80 NA) water immersie doelstellingen.
- Filterdrager cube FRET beeldvorming (eCFP en Citrien) een dichroïsche spiegel 505 nm en banddoorlaatfilters die zich uitstrekken 460 nm tot 500 nm voor het meten eCFP en 520 nm tot 560 nm voor het meten Citrine heeft.
- ACSF toe te voegen aan het putje met verdund-schedel raam en laat de doelstelling water onderdompeling in de ACSF. Gebruik het oculair in combinatie met kwiklamp en GFP filter kubus het oppervlak van de cortex en vaatstelsel onder het venster te lokaliseren.
Opmerking: Het patroon van de bloedvaten helpt lokaliseren en beeld dezelfde regio meer dan herhaald dagen van beeldvorming. Schakel over naar de 40X water immersie objectief om CNiFERs vinden handmatig scherpstellen op het oppervlak van de cortex over de cellen met behulp van de GFP filter kubus en een kwiklamp. - Opgezet voor twee-foton imaging. Selecteer de appropriate lichtpad voor twee-foton imaging. Voor een typische commercieel systeem, de software gebruiken om naar twee-foton imaging mode en buigen licht naar de fotovermenigvuldiger buizen (PMT's) in de niet-descanned detectoren. Schakel het nabije infrarood femtoseconde gepulste laser, selecteer een golflengte van 820 nm en een energie-instelling van 5-15%. Let op: 5% vermogen levert typisch ~ 25 mW bij het monster.
- Stel de PMT1 & PMT2 spanning dichtbij de maximale waarde, typisch 700-1.000 V, afhankelijk van de PMT. Stel de winst voor 1 voor elk kanaal en nul de z-positie voor het doel.
- Verlaag de doelstelling ~ 100 tot 200 urn van de corticale oppervlak en start de xy scan. Stel het laservermogen, te verwerven, en PMT spanning van elk kanaal, dat wil zeggen, eCFP en citroengeel, de signaal-ruisverhouding van de CNiFER fluorescentie optimaliseren.
- Gebruik de zoomfunctie in de software om de afbeelding te beperken tot een regio die de CNiFER cellen bevat, evenals een background regio. Gebruik een scansnelheid niet trager dan één frame per 2 sec (0,5 Hz) bij 4 microseconde per pixel. Pas de lijn van gemiddeld naar geschikte signaal-ruisverhouding, bv, Kalman 2 lijn middeling.
- Teken een regio-of-interest (ROI) rond CNiFER cellen, rond ongeveer 3 tot 4 cellen per vliegtuig. Opzetten van real-time analyse van ROI gemiddelde intensiteiten. Start overname CNiFER fluorescentie monitoren in de tijd.
- Verzamel fluorescentie van CNiFERs voor en tijdens experimentele manipulaties, bijvoorbeeld, elektrische stimulatie, ChR2 stimulatie, gedrag, zoals bepaald door de gebruiker.
- Wanneer de beeldvorming experiment is voltooid, de terugkeer van de muis naar zijn kooi. Herhaal de beeldvorming in dagen, zoals gewenst. Als re-beeldvorming van de cellen verwijzen de eerder verworven laag-vergroting vaatstelsel om terug te oriënteren op hetzelfde beeldveld (stap 10.4).
Opmerking: Geïmplanteerde CNiFERs kunnen worden afgebeeld gedurende ten minste 7 dagen.
11. Data Analysis
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een CNiFER is afgeleid van een humane embryonale niercellen (HEK293) cellen die is ontworpen om ten minste twee eiwitten stabiel tot expressie: een specifieke G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR) en een genetisch gecodeerd [Ca2 +] opnemer, TN-XXL. TN-XXL ondergaat fluorescentie-energieoverdracht (FRET) tussen cyaan en geel fluorescerende eiwitten, eCFP en citroengeel, respectievelijk, in reactie op Ca2 + -ionen 6,15. Activering van GPCR's die endogeen Gq G-eiwitten leiden tot een toename cytosolisch [Ca2 +] via PLC / IP 3 weg, wat leidt tot een toename van de FRET TNXXL Ca2 + detector (figuur 1).
Figuur 1:. Regeling voor de ontwikkeling van CNiFERs Top, GPCR-Ca 2+ signaleringsroute die nodig zijn voor het creëren van eenCNiFER cel. Bottom, de basisstappen voor het construeren CNiFERs gebruik van HEK293 cellen. Stap 1. transduceren met genetisch gecodeerde-FRET gebaseerde Ca 2+ -detector (TN-XXL). Stap 2. transduceren Ga-G-eiwitchimeer, dwz qs5 G, G qi5, indien nodig. Stap 3. transduceren unieke GPCR te CNiFER creëren. Twee-foton excitatie (rood) windt eCFP, die FRET ondergaat, het produceren van zowel een eCFP emissie (cyaan) en Citrien emissie (geel). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De toename van FRET geeft een snelle optische uitlezing van de verandering in neurotransmitter niveaus. Een CNiFER ontwikkelen voor een bepaald type neurotransmitter, eerst het type G-eiwit te bepalen dat paren aan de GPCR. Voor Gq -gekoppelde GPCR de GPCR die gebruikt Gq eiwitten endogeen tot expressie inHEK293 cellen. Voor G i / o -gekoppelde GPCRs, een klonale HEK293 lijn wordt eerst gemaakt dat een chimeer G-eiwit dat de GPCR wordt omgeleid naar de G q -PLC / IP 3-route uitdrukt. Dit wordt bereikt met een chimeer G-eiwit, G qi5, die vooral q Ga-sequentie en vijf aminozuren van het carboxyluiteinde van Gi bevat. Deze vijf aminozuren zijn voldoende voor G qi5 communiceren met Gi / o -gekoppelde GPCRs, maar signaleren via Gq route. Voor G s -gekoppelde GPCRs, is een G qs5 hersenschim gebruikt 10. De algemene strategie voor het produceren van een CNiFER is: 1) een klonale HEK293 cellen die stabiel een optische Ca2 + detector uitdrukt, dwz TN-XXL hand van een lentivirus transductie van HEK cellen, 2) stabiel tot expressie een chimeer G-eiwit eventueel in de HEK293 celkloon expressie TN-XXL, en 3) een stabiele wijze GPCR kloon in de HEK293 celkloon tot expressie TN-XXL en het chimere G-eiwit. De klonale HEK293 lijn die de GPCR ontbreekt, maar heeft het TN-XXL en chimere G-eiwit dient als de 'control CNiFER'. De besturing CNiFER is nodig om te bevestigen dat de CNiFER respons wijten specifiek activatie van de kunstmatige receptoren, namelijk D2R en geen activatie van andere receptoren endogeen tot expressie in HEK293 cellen.
Om lentivirus genereren, wordt een lentivector gebruikte expressiesysteem, bijvoorbeeld pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro, waarbij de genetische elementen verpakkingsverantwoordelijken, transductie, stabiele integratie van het virale expressieconstruct in genomisch DNA en expressie van het doelwit bevat gensequentie. Een hoge titer van virusdeeltjes, expressie en verpakkingsvectoren produceren zijn transient gecotransfecteerd in cellen van zoogdieren en producent virus wordt verzameld. Er zijn verschillende virale kernfaciliteiten in de VS die hoge ti kan genereren ter lentivirus. Na infectie van HEK293 cellen, de Puro gen verschaft antibioticaresistentie voor het identificeren getransduceerde HEK293 cellen.
Teneinde specifieke klonale lijnen identificeren getransduceerde HEK293 cellen worden gesorteerd met fluorescentie- geactiveerde celsortering (FACS) systeem. Het doel is een kloon die een hoog expressieniveau van FRET gebaseerde Ca2 + detector en het vermogen van FRET ondergaat bevat isoleren. In dit voorbeeld van FACS analyse wordt de fluorescentie van de eCFP emissie uitgezet tegen de FRET signaal (eCFP excitatie en emissie Citrien). De boxen markeren gebieden (P2 en P3), die vervolgens zullen worden geselecteerd ( "gated") voor het sorteren in 96-well platen (figuur 2). Over het algemeen, ongeveer vier 96-well platen voldoende te screenen op succesvolle totstandbrenging van CNiFERs. Uit deze platen 4, ongeveer 100 klonen zijn geschikt voor fluorometrische plaatlezer analyse.
e_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figuur 2: Voorbeeld van FACS-analyse Een monster van de productie na een FACS-analyse.. De grafiek geeft eCFP emissie ( '475/20-A ") als een functie van Citrien emissie (" FRET V-530/30-A "), met behulp eCFP excitatie voor elke cel. Regio's P2 en P3 tonen gebieden geselecteerd, dat wil zeggen, gated, voor het sorteren in afzonderlijke cellen. Kleuren zijn arbitrair. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Zodra de gesorteerde cellen gekweekt tot voldoende densiteit wordt de FRET respons na agonist activatie bepaald met een 96 putjes fluorometrische plaatlezer systeem uitgerust met oplossing handling. Om een beperking van het aantal klonen te studeren, wordt een '3-point "agonist curve gebruikt om te screenen ~100 klonen en selecteer CNiFERs met de beste reacties. Ongeveer 10 klonen worden vervolgens verder geanalyseerd met bepaling van volledige dosis-respons met de verwante agonist en de niet-specifieke reacties gehybridiseerd met 12 andere neurotransmitters of modulatoren. Een 96-well plaat geneesmiddel wordt bereid als drievoudige concentratie (eindconcentratie verdund 1: 3 in plaat) van drugs (bijvoorbeeld agonisten, antagonisten, etc.) in ACSF. In dit voorbeeld wordt een geneesmiddel plaat ingesteld voor het testen van een D2 CNiFER met zijn verwante agonist, dopamine en mogelijke niet-specifieke reacties met diverse andere neurotransmitters en peptide-agonisten (figuur 3). De ruggengraat CNiFER, waarin de GPCR ontbreekt, dient als een belangrijk controle voor de nieuw gecreëerde CNiFER.
Figuur 3:. Voorbeelden van Schema voor 96-well platen Top, lijst van Layout voor het laden van een 3x drug plaat voor fluorometrische plaatlezer, met behulp van drie-voudige concentraties van diverse neurotransmitters en peptiden. Bottom, voorbeelden van doorzichtig plastic 96-well drug plaat en zwarte 96-well plaat voor het zaaien CNiFERs en het meten in plaat lezer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Stimulatie van de GPCR wordt verwacht dat de FRET respons te verhogen als gevolg van een verhoging van intracellulaire [Ca2 +] en detectie door TN-XXL. Onder deze omstandigheden wordt FRET door eCFP en Citrien steeds dichter zodat excitatie van eCFP produceert een kleinere eCFP emissie en grotere Citrien emissie. In dit voorbeeld is ingesteld op excitatie 436 nm en emissie filters worden ingesteld op 485 ± 7,5 nm voor eCFP en 527 ± 7,5 nm voor Citrine (figuur 4). Dertig seconden van baseline fluorescentie wordt gemeten en vervolgens 50 ui van het "drievoudige" agonist in ACSF plaat die aan elke putje 100 gl ACSF (1: 3 verdunning). eCFP en Citrien emissie fluorescentie gemeten elke 3,8 seconden voor 180 sec. Achtergrondmetingen worden ontleend waterloze cellen en afgetrokken indien nodig. Fluorescentie intensiteiten genormaliseerd pre-stimulus basislijnen (F (t) / F (baseline)) en de maximale responsen gemeten die de FRET verhouding (AR / R) met de F (t) / F (basislijn) van de 527 berekent nm en 485 nm kanalen (vergelijking 1). Een dosis responscurve wordt vervolgens geconstrueerd door het uitzetten van de FRET-verhouding als functie van verschillende concentraties agonist en passen bij de Hill vergelijking om de EC50 en Hill-coëfficiënt (Figuur 5) (Vergelijking 2) te bepalen. Een optimale CNiFER vertoont een grote FRET-ratio en een geschikte EC 50 voor de verwante agonist, en vertoont weinig of geen achtergrond reacties op andere neurotransmitter agonisten. Daarentegen zou de controle CNiFER weinig reactie op de verwante agonist.
Figuur 4: Voorbeeld van een agonist veroorzaakte FRET Response D2R CNiFER FRET respons gemeten op een plaatlezer met een oplossing leveringssysteem.. (A) Een grafiek van de FRET respons, dwz eCFP excitatie met eCFP en Citrien emissies tijdens het aanbrengen van dopamine (rode balk) naar D2 CNiFERs. Merk op dat eCFP uitstoot afneemt terwijl Citrien emissie stijgt met agonist (dopamine). (B) Een plot van de FRET-ratio (Vergelijking 1) voor de reactie van (A) Figuur gewijzigd ten opzichte van Muller et al., 2014 7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:. Voorbeelden van dosis-respons curves voor D2 CNiFER (A) dosis-respons curves voor de reactie van de D2 CNiFERs dopamine (DA, zwart) en norepinefrine (NE, groen). Daarnaast is de reactie van "control" CNiFERs zonder de D2R weergegeven. (B) Het staafdiagram toont de FRET-ratio respons voor andere neurotransmitters en modulators op 50 nm en 1 uM. Waarden zijn gemiddelden ± SEM. Figuur gewijzigd ten opzichte van Muller et al., 2014 7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
CNiFER klonen kan verder voor mogelijke receptor-afhankelijke desensibilisatie en hun temporele resolutie worden beoordeeld, discrimineren de presentatievan twee verschillende agonist pulsen (voor details, zie Muller et al., 2014 7). Na construeerde een CNiFER kloon, de volgende stap is om de functie te testen in vivo. De fluorescentie in vivo controleren, is het noodzakelijk om een twee-foton microscoop. Na het voorbereiden van een verdund-schedel raam, worden CNiFERs geladen in een glazen pipet en geïnjecteerd in lagen 2/3 van de cortex. De muis wordt vervolgens bereid voor in vivo beeldvorming door het aanbrengen van een dekglaasje om de verdunde schedel en implanteren van een kopboom voor het bevestigen van de kop tijdens het belichten (figuur 6).
Om te bepalen dat de geïmplanteerde CNiFERs levensvatbaar in vivo kunnen bekende concentraties agonist worden geïnjecteerd nabij de implantatieplaats en de FRET bepaalde verhouding 7. Om de activiteit van geïmplanteerde CNiFERs verder te valideren, het stimuleren van de input neuronen moeten worden onderzocht. Bijvoorbeeld, de D2 CNiFER het effect vanelektrische stimulatie van de middenhersenen dopamine neuronen die uitsteken in de cortex werd onderzocht. Een 0,1 MQ wolfram bipolaire stimulerende elektrode met een punt scheiding van 500 urn werd geïmplanteerd in de substantia nigra (-3,2 mm A / P -1,3 mm M / L, -4,4 mm D / V). Figuur 6 toont een voorbeeld van elektrisch stimuleren van de substantia nigra van verschillende intensiteit en de waarneming van een stijging van de FRET verhouding voor D2 CNiFERs 7. Merk op dat systemische intraperitoneale (ip) injectie van een D2 receptor antagonist, eticlopride (1 mg / kg) blokkeert de D2 CNiFER respons. Anderzijds, injectie van cocaïne (15 mg / kg), welke blokken heropname van dopamine, verbetert de elektrisch opgewekte respons D2 CNiFER 7.
Figuur 6: Voorbeeld van D2 CNiFER Response I
ftp_upload / 53290 / 53290table1.jpg "/>
Tabel 1: Lijst van chemische stoffen en reagentia voor het maken van HEK293 groeimedium en ACSF.
Tabel 2: De volumes voor oogsten Cellen Van Verschillende Grootte Cultuur Platen of kolven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De oprichting van CNiFERs een innovatieve en unieke strategie voor het optisch meten van afgifte van neurotransmitters in de hersenen in vivo. CNiFERs zijn ideaal voor het meten extrasynaptic afgifte, dat wil zeggen, volume geleiding voor neurotransmitters. Moet voor elk CNiFER bezit de eigenschappen van de natieve GPCR, die een fysiologische optisch meten van de veranderingen in niveaus van neurotransmitters in de hersenen. Tot op heden zijn CNiFERs gemaakt voor het detecteren van acetylcholine (M1-CNiFER) 6, dopamine (D2-CNiFER) 7 en norepinefrine (α1a-CNiFER) 7.
In principe kan een CNiFER worden gemaakt voor elke neurotransmitter die door middel van een GPCR signaleert. Voor het geval dat de GPCR signalen via Gq G-eiwitten, geen verdere modificatie nodig HEK293 cel. GPCRs dat signaal door middel van G i / o vereisen echter co-expressie van een G qi5 chimeer G-eiwithet koppelen van de GPCR aan de Gq / PLC pathway 7,10. Evenzo zal GPCR die signaleren door middel Gs co-expressie van een chimeer G-eiwit qs5 G 10 vereisen. Eenmaal voltooid, wordt elke CNiFER klonen gescreend en alleen die CNiFER klonen die een affiniteit vergelijkbaar met de natieve receptor, vertonen weinig of geen desensibilisatie en een signaal-ruisverhouding die geschikt is voor het meten van in vivo twee-foton microscopie, worden geselecteerd voor in vivo studies.
Voor in vivo studies, is het sterk aanbevolen om de muizen met cyclosporine om eventuele immunologische reactie te minimaliseren behandelen. Er is een mogelijkheid van afwijzing of een immunologische reactie met het implanteren van menselijke CNiFER cellen in de hersenen van knaagdieren. Dit werd eerder onderzocht door het onderzoeken van de expressie van GFAP en MAC1 7, na CNiFER implantatie. CNiFERs leek niet te gliacellen littekens te produceren of het genereren van elke aanmerkelijkeficant MAC1 kleuring 7.
Twee belangrijke kwesties om te overwegen bij het construeren van CNiFERs zijn gevoeligheid en desensibilisatie. Als de EC 50 te hoog is, dat wil zeggen, lage affiniteit ten opzichte van de natieve receptor, dan CNiFER mogelijk onvoldoende gevoeligheid voor afgifte van neurotransmitter in vivo te detecteren zijn. Een oplossing is om klonen opnieuw screenen en kies een ander CNiFER kloon die hogere affiniteit heeft. Een alternatieve strategie is om andere typen genetisch gecodeerde fluorescente Ca2 + detectors die een hogere Ca2 + gevoeligheid kan hebben, waarbij de EC 50 kan verschuiven voor GPCRs testen. Omdat de CNiFER ontwerp is modulair, wordt gemakkelijk aangepast aan andere typen genetisch gecodeerde Ca2 + detectors, zoals GCaMP 16. Isoleren CNiFER klonen met dezelfde receptor maar verschillende EC 50 s kan voordelig zijn voor uitbreiding van het dynamische bereik detecteren afgifte van endogene neurotransmitters in vivo.
Desensitisatie van de CNiFER ook het gebruik ervan in vivo beperken. Als de grootste gevoeligheid geleidelijk afneemt met elke puls van agonist, wordt de receptor kan worden desensitizing. In dit geval, andere klonen te onderzoeken en bepalen of ze op dezelfde manier reageren. Wijzigingen aan de receptor aminozuursequentie, of het gebruik van een ander subtype receptor kan nodig zijn om de agonist-afhankelijke desensitisatie pakken. Als er bekende plaatsen van fosforylatie of aminozuren geïdentificeerd die associëren met G-proteïne receptor kinases (GRK's), zou het wenselijk zijn een niet-desensibilisatie variant van de GPCR opbouwen door het muteren van één of meer locaties. Het mechanisme van de desensibilisatie moet worden bepaald voor elke receptor op een case-by-case basis.
Tot nu toe zijn alleen CNiFERs geïmplanteerd in oppervlakkige lagen van de cortex 6,7, als gevolg van beperkingen met beeldvorming fluoroforen spectroscopische twee-foton microscopy 17,18. In de toekomst zal het mogelijk zijn om CNiFER technologie aangepast met vezels gebaseerde metingen van fluorescentie 19 zodat CNiFERs in subcorticale hersengebieden kunnen worden geïmplanteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken B. Conklin (University of California, San Francisco) voor het verstrekken van de G qi5 en G qs5 cDNAs, A. Schweitzer voor hulp bij de elektronica, N. Taylor voor hulp bij het screenen van klonen, Ian Glaaser en Robert Rifkin voor proeflezen en Olivier Griesbeck voor TN-XXL. Dit werk werd ondersteund door subsidies voor onderzoek door het Amerikaanse National Institute on Drug Abuse (NIDA) (DA029706; DA037170), het Nationaal Instituut voor Biomedische beeldvorming en Bioengineering (NIBIB) (EB003832), Hoffman-La Roche (88610A) en de "Neuroscience gerelateerd aan drugs "training subsidie door middel van NIDA (DA007315).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro | System Biosciences | CD510B-1 | Cloning: for generating lentivirus |
| 12 x 75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube | BD Biosciences | 352063 | FACS |
| BD 40 um Falcon cell strainers | BD Biosciences | 352340 | FACS |
| 0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200056 | FACS |
| 96 Well Plate, flat bottom, clear | Corning | 3596 | FACS |
| 96 well cell culture plates | Corning | CLS3997 | Flexstation |
| Optilux black clear bottom | Corning | 3603 | Flexstation |
| Flexstation pipet tips | Molecular Devices | 9000-0911 | Flexstation |
| Acetylcholine Chloride | Sigma-Aldrich | A2661 | Flexstation |
| Norepinephrine | Sigma-Aldrich | A7256 | Flexstation |
| Dopamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | PHR1090 | Flexstation |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | Flexstation |
| Histamine | Sigma-Aldrich | H7125 | Flexstation |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | Flexstation |
| Epinephrine | Sigma-Aldrich | E4642 | Flexstation |
| Somatostatin | Sigma-Aldrich | S1763 | Flexstation |
| 5HT | Sigma-Aldrich | H9523 | Flexstation |
| VIP | Alpha Diagnostics Inc. | SP-69627 | Flexstation |
| Orexin A | Alpha Diagnostics Inc. | 12-p-01 | Flexstation |
| Substance P | Sigma-Aldrich | S6883 | Flexstation |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Flexstation |
| Melatonin | Sigma-Aldrich | M5250C | Flexstation |
| Fluorescence Plate Reader & software | Molecular Devices | Flexstation 3 | Flexstation |
| DMEM (high glucose) with Glutamax | Life Technologies | 10569-010 | Tissue culture |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-139 | Tissue culture |
| Pen/Strep antibiotics | Life Technologies | 15140-122 | Tissue culture |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr-1 | Tissue culture |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Tissue culture |
| CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box | Bioexpress | D-3508) | Tissue culture |
| cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite no. 495 | surgery and stereotaxic injection |
| plastic paraffin film | VWR | Parafilm® | surgery and stereotaxic injection |
| Nanoinjector | Drummond | 3-000-204 | surgery and stereotaxic injection |
| Glass electrodes | Drummond | 3-000-203G | surgery and stereotaxic injection |
| hand held drill | OSADA | Exl-M40 | surgery and stereotaxic injection |
| Burrs for drill | Fine Scientific | 19007-05; 19007-07) | surgery and stereotaxic injection |
| Sterilizing bath | FST | 18000-45, Hot Bead Sterilizer | surgery and stereotaxic injection |
| isoflurane chamber/mask | Highland Medical Equipment | 564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm | surgery and stereotaxic injection |
| 3D scope with arm | Zeiss | surgery and stereotaxic injection | |
| fiber optic light | surgery and stereotaxic injection | ||
| Betadine | surgery and stereotaxic injection | ||
| 70 % (v/v) isopropyl alcohol | surgery and stereotaxic injection | ||
| Povidone-Iodine Prep Pads | dynarex | 1108 | surgery and stereotaxic injection |
| NaCl 0.9% (injection, USP, 918610) | surgery and stereotaxic injection | ||
| CYCLOSPORINE (INJECTION, USP) | surgery and stereotaxic injection | ||
| Buprenex (injection) buprenorphine (0.03 μg per g rodent) | Sigma-Aldrich | surgery and stereotaxic injection | |
| Ophthalmic ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | surgery and stereotaxic injection |
| Surgifoam | Ethicon | surgery and stereotaxic injection | |
| Grip dental cement | Dentsply | #675571, 675572 | surgery and stereotaxic injection |
| Instant SuperGlue | NDindustries | surgery and stereotaxic injection | |
| LOCTITE 4041 | surgery and stereotaxic injection | ||
| METABOND | C&B | surgery and stereotaxic injection | |
| no. 0 cover glass | Fisher | surgery and stereotaxic injection | |
| stereotaxic frame | Kopf | surgery and stereotaxic injection | |
| Rectal probe and heating pad | FHC | 40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe | surgery and stereotaxic injection |
| optical breadboard for imaging | Thorlabs | surgery and stereotaxic injection | |
| Mineral oil | Fisher | S55667 | surgery and stereotaxic injection |
| Kwik-Cast (Silicone elastomer) | World Precision Instruments | surgery and stereotaxic injection | |
| Suture | Ethicon | 18’’, 1667, 4-0 | surgery and stereotaxic injection |
| Scissors | Fine Scientific Tools | 91500-09, 15018-10 | surgery and stereotaxic injection |
| Forcepts | Fine Scientific Tools | 11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10 | surgery and stereotaxic injection |
| Student Halsted-Mosquito Hemostats | Fine Scientific Tools | 91308-12 | surgery and stereotaxic injection |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Scientific Tools | 18000-00 | surgery and stereotaxic injection |
| Hot Bead Sterilizers | Fine Scientific Tools | 18000-45 | surgery and stereotaxic injection |
| Instrument Case with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20311-21 | surgery and stereotaxic injection |
| Plastic Sterilization Containers with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20810-01 | surgery and stereotaxic injection |
| 2P fixed-stage fluorescence scope for in vivo imaging | Olympus | FV1200 MPE | in vivo imaging |
| Multiphoton laser | SpectraPhysics | Mai Tai DeepSee | in vivo imaging |
| Green Laser | Olympus | 473 nm Laser | in vivo imaging |
| xy translational base | Scientifica | MMBP | in vivo imaging |
| FRET filter cube for YFP and CFP | Olympus | in vivo imaging | |
| 10x and 40x water immersion objectives | Olympus | in vivo imaging | |
| air table | Newport | in vivo imaging | |
| custom built light-tight cage | Thorlab | in vivo imaging |
References
- Day, J. C., Kornecook, T. J., Quirion, R. Application of in vivo. microdialysis to the study of cholinergic systems. Methods. 23, 21-39 (2001).
- Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo. Clin Chem. 49, 1763-1773 (2003).
- Liang, R., Broussard, G. J., Tian, L. Imaging Chemical Neurotransmission with Genetically Encoded Fluorescent Sensors. ACS Chem Neurosci. , (2015).
- Okubo, Y., et al. Imaging extrasynaptic glutamate dynamics in the brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 6526-6531 (2010).
- Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10, 162-170 (2013).
- Nguyen, Q. T., et al. An in vivo biosensor for neurotransmitter release and in situ receptor activity. Nat Neurosci. 13, 127-132 (2010).
- Muller, A., Joseph, V., Slesinger, P. A., Kleinfeld, D. Cell-based reporters reveal in vivo dynamics of dopamine and norepinephrine release in murine cortex. Nat Methods. 11, 1245-1252 (2014).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. , e3998 (2012).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. , (2009).
- Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Gjα. Nature. 363, 274-276 (1993).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1, 3166-3173 (2006).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. , (2012).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nat Methods. 7, 981-984 (2010).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1277-1309 (2012).
- Yamauchi, J. G., et al. Characterizing ligand-gated ion channel receptors with genetically encoded Ca2+ sensors. PLoS One. 6, e16519 (2011).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Cui, G., et al. Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation. Nature. 494, 238-242 (2013).
