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Neuroscience

神経伝達物質を光学的に検出するための細胞ベースの神経伝達物質の蛍光エンジニア記者の建設(CNiFERs) doi: 10.3791/53290 Published: May 12, 2016

Summary

私たちは、体積、神経伝達物質の放出を光学的に検出するための細胞ベースの神経伝達物質の蛍光工学レポーター(CNiFERs)を作成するためのプロトコルを提示します。

Abstract

細胞ベースの神経伝達物質の蛍光は記者(CNiFERs)は、光学的に生体内で脳内の神経伝達物質の放出を検出するための神経科学者のための新しいツールを提供する設計さ。特定CNiFERは、ヒト胚性腎臓安定特定のGタンパク質共役型受容体を発現する細胞、G q/ 11のGタンパク質に結合し、FRETベースのCa 2+ -detector、TN-XXLから作成されます。受容体の活性化は、FRETシグナルの増加をもたらします。 CNiFERクローンは、 例えば 、ドーパミンD2Rを特定の神経伝達物質のための天然受容体を使用しているためCNiFERsはnMの感度および秒の時間応答を持っています。 CNiFERs直接in vivoでの体積透過を測定するように最適未満、せいぜい100人ミクロンの空間分解能で神経伝達物質の放出を検出するためにそれらを可能にする、脳内に注入されます。 CNiFERsもViに潜在的な交差反応性のために他の薬剤をスクリーニングするために使用することができますVO。我々は最近、G、I / O Gタンパク質へのGPCRにそのカップルを含めるようにCNiFERsの家族を拡大しました。 CNiFERsは、アセチルコリン(AChの)、ドーパミン(DA)およびノルエピネフリン(NE)を検出するために利用可能です。任意のGPCRはCNiFER小説を作成するために使用することができることを考えると、ほぼヒトゲノム中の800のGPCRがあることを、我々は、設計実現、およびCNiFERのいずれかのタイプをテストするために、ここで一般的な手順について説明します。

Introduction

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完全ニューロンが脳内でどのように通信するかを理解するためには、 生体内での神経伝達物質の放出を測定するための方法が必要です。 生体内で神経伝達物質を測定するためのいくつかのよく確立された技術があります。 1つの一般的に用いられる技術は、カニューレが脳に挿入され、脳脊髄液の少量を採取し、高速液体クロマトグラフィーおよび電気化学的検出1を使用して分析された微小透析です。微小透析は、直径200μmのマイクロプローブのための〜0.5ミリメートル、 例えば 、プローブのいくつかの直径のオーダーの空間分解能を持っています。この技術の時間分解能は、しかし、一般的に約5分または1より長く続くサンプリング間隔に遅いです。さらに、分析はリアルタイムで行われていません。別の技術は、脳に挿入されたカーボンファイバープローブを使用して、高速走査サイクリックボルタンメトリー(FSCV)、です。 FSCVは、優れた温度を持っています経口解像度(サブ秒)、高感度(ナノモル)、および5〜30μmのプローブ径の空間分解能。しかし、FSCVカーボン電位差プローブ2の電圧との特性を酸化還元プロファイルを生成する送信機に限定されます。

神経伝達物質を測定するための第3の技術は、遺伝的にコードされた神経伝達物質(NT)バイオセンサ3を介して直接です。この方法で、融合タンパク質は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)フルオロフォア4のベースペアまたは順列GFP 5に接続された送信機のリガンド結合ドメインを含むように作成されます。前の2つの方法とは異なり、これらのバイオセンサーは、遺伝的にコードされ、トランスジェニック動物の産生を介して、または急性の細胞に感染するウイルス剤の使用と、そのようなニューロンとして、宿主細胞の表面に発現しました。現在までに、遺伝的にコードされたバイオセンサーは検知情報のために開発されていますグラムグルタミン酸やGABA 3-5。これらの技術に関する制限事項は、nM範囲の低感度、およびGタンパク質共役受容体(GPCR)を介してシグナル例えば送信機、古典的な神経伝達物質、神経ペプチドおよび神経修飾物質、多数のに検出を拡張することができないことでした。実際には、ヒトゲノム中に約800のGPCRがあります。

これらの不足に対処するために、我々は、GPCRを介して信号の任意の神経伝達物質の光学的に測定するリリースに革新的なツールを開発しました。 CNiFERs(セル・ベースの神経伝達物質の蛍光が記者を設計し)が刺激され、特定のGPCRを発現するように操作クローンHEK293細胞であり、遺伝的にコードされたFRETベースのCa 2+センサで検出された細胞内の増加の[Ca 2+]をトリガーTN-XXL。したがって、CNiFERsは、直接、リアルタイムの光Rを提供する、蛍光の変化に結合神経伝達物質受容体を変換します地元の神経伝達物質活性のEADアウト。指定された神経伝達物質のための天然受容体を利用することにより、CNiFERsは化学的特異性、親和性および内因的に発現される受容体の時間的なダイナミクスを保持している。これまでに、我々はドーパミンを検出するためのCNiFERs、M1受容体を使用してアセチルコリンを検出するための1つの、1の3種類を作成しましたD2受容体を使用して、α1A受容体6,7を使用して、ノルエピネフリンを検出するための1。 CNiFER技術は、GPCRのいずれかのタイプにそれが影響を受けやすい作り、容易に拡張可能かつスケーラブルです。このJoveの記事では、我々は説明し、任意のアプリケーションのためのin vivoでの CNiFERs 、設計を実現するための方法論、およびテストを説明します。

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Protocol

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本研究で実行されるすべての動物の手順は、制度的動物実験委員会(IACUC)のガイドラインに従っていると、マウントサイナイ医科大学とカリフォルニア大学サンディ​​エゴ校のIACUCsによって承認されています。

1. HEK293細胞を形質転換するためのレンチウイルスのGPCRを発現生成

  1. 商業的供給源、 例えば 、cdna.orgから特定 ​​のGPCRのcDNAを取得します。あるいは、PCRを用いたcDNAライブラリーからGPCR遺伝子を増幅します。このようなpCDH-CMV-MCS-EF1-プーロ(pCDH)などのレンチウイルス発現ベクターを得ます。 DNAを伝達するだけでなく、レンチウイルスを生成するには、このベクターを使用してください。
  2. PCRによるレンチウイルス発現ベクターにGPCRのcDNAをクローニングします。 PCRサブクローニングの詳細については、ローレンツ8を参照てください。
  3. 展開し、製造元の指示に従ってエンドトキシンを含まない「マキシ」プレップキットを用いて、GPCR-pCDH DNAを精製。 pCDHがmutation-あるにGPCR cDNAをサブクローニングしていることを確認しDNA配列決定により無料。
    注:前にウイルス産生のためのDNAを提出し、インサートとDNAの純度の大きさを確認するために、適切な制限酵素で一定分量を消化。
  4. 。例えば、ソーク・インスティテュートで1、ペンの大学として、ウイルスコア機能を使用してレンチウイルスを生成し、またはノースカロライナ大学 、または社内9生成します。 T75フラスコ中でHEK細胞のトランスフェクションのためにエンドトキシンフリーDNAの約25μgの(>を1μg/μl)を使用してください。 〜1.8の吸光度比(260 / A 280)を有する、DNAは高純度であることを確認してください。
    注:ウイルスの力価〜10 11〜10 12 GC / mlをHEK293細胞の形質導入のために最適です。

2. インビトロで培養するためのHEK293 / TN-XXLバックボーンセル・タイプの選択

注:Gタンパク質結合特異性を決定し、 例えば 、G、I / O、G のq / 11、またはG Gタンパク質、GPCRの、このDICなどGタンパク質キメラがCNiFERのために必要とされているかどうかをtates。 例えば G qを共役型受容体、M1ムスカリン受容体については、HEK293 / TN-XXLバックボーンHEK293細胞型として(#3G8)を選択します。 G、I / O共役型受容体は、キメラGタンパク質Gのqi5は 10を必要とされています。 G sの共役型受容体は、GのQS5キメラ10を必要とされています。このプロトコルでは、D2R CNiFERの構成は一例として使用されています。 I / Oの Gタンパク質およびGを介して、D2R信号を安定キメラGタンパク質、Gのqi5、 例えば 、HEK293 / TN-XXL / Gのqi5は _#qi5.6を発現するHEK293細胞を必要とします。

  1. 研究室からHEK293 / TN-XXL / Gのqi5 _#qi5.6クローン細胞を取得します。注:クローン細胞を、以下、HEK293 / TN-XXL G qを共役型受容体に対する(#3G8)、HEK293 / TN-XXL / Gのqi5(#qi5.6)G用のI / Oの共役型受容体、およびHEK293 / TN -XXL / G QS5(#qs5.47)G 共役型再用ceptors、要求6,7に応じて自由に利用可能です。
  2. 成長し、HEK293増殖培地( 表1)5mlでT25フラスコに〜qi5.6に_#90%の密集度をHEK293 / TN-XXL / Gのqi5を展開ます。 5%(v / v)のCO 2、37℃の加湿インキュベーター中で細胞を増殖させます。
    注:HEK293細胞を培養すると、すべての作業は、標準的な無菌の組織培養技術を用いて実施されるべきです。
  3. 最初のT25フラスコから培地を吸引することにより、HEK293細胞を採取します。 5mlのPBSを添加し、フラスコを揺動により穏やかに細胞を洗浄。
  4. PBSを削除し、0.05%(w / v)のトリプシン/ EDTA( 表2)の1ミリリットルを追加します。 CO 2(v / v)の5%、37℃で1~2分間インキュベートします。
  5. 細胞を収集し、15ミリリットルコニカルチューブを無菌するために転送します。細胞培養遠心分離機1,000×gで5分間遠心します。上清を吸引除去します。
  6. HEK293増殖培地5ml中の細胞ペレットを再懸濁します。使用して、血球計数器で細胞を数えますトリパンブルー。細胞密度を計算し、ステップ3に進んでください。

HEK293 / TN-XXL / Gqi5細胞の3レンチウイルス形質導入

  1. 0.7×10 6 HEK293 / TN-XXL / Gのqi5細胞をT25フラスコをシード。後の約1日、50%コンフルエントになるまで〜5%(v / v)のCO 2を有する37℃の加湿インキュベーター中で細胞を増殖させます。残りの細胞を凍結(8.2から8.3ステップ)。これらの細胞は、 すなわち 、CNiFERコントロールとしてGPCRを欠いCNiFERを提供します。
  2. 感染の日に、HEK293増殖培地( 表1)を2mlの全量ミリリットル〜10 9 GC /最終濃度レンチウイルス(ステップ1.4)を発現するGPCRを希釈します。例えば、T25フラスコに2ミリリットルのメディアに10 11 GC / mlのウイルスの20μlを添加します。
    注:ウイルス力価情報は、ウイルスコア施設によって提供されるべきです。遠心管にレンチウイルスとメディアを組み合わせて、静かに粉砕します。 lentivの高力価irusはバイオセーフティーレベル2(BSL-2)です。
  3. T25フラスコから培地を吸引除去します。ステップ3.2からウイルス/メディアは、混合物の2ミリリットルを追加します。 5%(v / v)のCO 2、37℃でT25フラスコO / Nインキュベートします。
  4. 感染の1日後、ウイルス/メディア混合物を吸引し、HEK293増殖培地を含有するピューロマイシンと交換してください(2 / mlの、 表1)。ピューロマイシンは、形質導入された細胞について選択します。 〜2日後に、約90%コンフルエントになるまで、5%(v / v)のCO 2で37℃でフラスコをインキュベートします。
  5. ステップ4.1で10点アゴニスト/活性化曲線を生成するための、フィブロネクチンでコーティングした96ウェルプレート(透明底黒色)を準備します。無菌フードでは、96ウェルプレートの行AとBでウェルあたり50μlのフィブロネクチン(5μg/ ml)を追加します。 1時間室温でプレートをインキュベートします。 PBSですすぎあたり5分間二回洗浄します。 HEK293増殖培地50μlを添加し、5%(v / v)のCO 2、37℃でO / Nインキュベートします
    注:Fibronectin処理プレートは、市販されています。
  6. ステップ2.3-2.6( 表2)に記載のようにT25フラスコ中の細胞を採取。
  7. HEK293増殖培地5ml中の細胞ペレットを再懸濁します。 FACS分析のために細胞を1.5 mlのT25フラスコに播種。また、凍結および貯蔵のための細胞の1ミリリットルでT75フラスコに播種(手順を参照してください8.2から8.3)
  8. 10ポイントのアゴニスト曲線については、ウェル当たり100μlの細胞懸濁液と(ステップ3.5)、フィブロネクチンコーティングした96ウェルプレートの最初の2列(AとB)を種子。
  9. 〜2日後に、5%(v / v)のCO 2で37℃で約〜90%コンフルエントになるまでHEK293のT25フラスコ、T75フラスコ中で増殖する細胞と、96ウェルプレートをインキュベート。

4. FACSおよびシングルCNiFERクローンの単離

  1. 10点アゴニスト活性化曲線を生成するための96ウェルプレートを使用してください。
    注:(FACS)分析を蛍光活性化細胞選別を開始する前に、確認することが重要ですアゴニスト応答(10点アゴニスト曲線)のために導入された細胞を試験することにより、GPCRの発現。この試験は、蛍光プレートリーダーを用いて行われます。
    1. 10点アゴニスト活性化曲線のための薬物プレートを準備します。文献から決定することができる予測EC 50をブラケット10の異なるアゴニスト濃度選択します。
      注:CNiFERプレートで3倍希釈薬剤プレートは、1を調整するために(二重に)各濃度の3倍が含まれています。例えば、D2 CNiFERをテストするための薬剤プレートは、3倍の濃度でのドーパミンの10の異なる濃度が含まれています。 0.2、0.5、1、3、5、10、20、30、50、及び1000nmで。 CNiFERプレートでは、したがって、ドーパミンの最終濃度は0.067、0.167、0.333、1.00、1.67、3.33、6.67、10.0、16.7、および333 nMです。
    2. 人工脳脊髄液(ACSF)( 表1)を使用して、アゴニスト溶液を調製します。 「ACSF '、 例えば 、A1とA2のための2つのウェルを使用して、そして「細胞なし」、 例えば 、B1とB2のための2つの井戸。
      注:シリアル希釈法を用いて、薬物の異なる濃度を準備します。 CNiFERクローンと薬物濃度( 図3)を追跡するためのテンプレートを作成します。
    3. FRETを測定し、ソリューションの転送を行うための96ウェル蛍光プレートリーダーをプログラムするソフトウェアを使用してください。
      1. 37℃にプレートリーダー温度を設定します。
      2. TN-XXLでFRETを測定するために、436±4.5 nmの(中央±HWHM)に励起波長を設定します。 eCFP用とシトリンのための527±7.5 nmの485±7.5 nmの発光フィルターを設定します。それぞれ、475とのeCFPとシトリンのために515 nmのカットオフフィルターを設定します。
      3. 485 nmおよび527 nmで180秒毎に合計4秒での発光を測定するために、プレートリーダーをプログラムします。の30秒を収集した後、CNiFERプレートで100μlに3倍の薬物プレートから50μLを提供するオプションを選択します。ベースライン蛍光。
    4. 行AとBからメディアを吸引し、ある96ウェルCNiFERプレート〜90%コンフルエント(ステップ3.9)にACSFの100μlを添加します。
    5. 96ウェルCNiFERプレートとプレートリーダーに「3倍」薬物プレートをロードします。プレートを37℃で平衡化するために〜30分を許可します。その後、プログラムを起動します。
    6. プレートリーダーのデータを分析するために、スプレッドシートに蛍光値をエクスポートします。 CNiFERsでウェルからのバックグラウンド測定(細胞なしのウェルからの各信号のために採取)を減算する式を作成します。事前刺激ベースライン、F シトリン (トン)/ F シトリン (ベースライン)に蛍光強度を正規化し、FRET比を算出(ΔR/ R;方程式を1)ピーク527 nmでの応答と485 nmの排出量を使用して(ステップ11を参照してください。 )。
      注:アゴニストΔR/ Rに大きな変化がある場合、これは、GPCRの発現を示し、一方はFACS分析(ステップ4.2)に進むことができます。番目の場合EREは、Ca 2+応答をテストし、そのFRETベースのセンサーが機能しているを確認するために、 例えば 、A21387をのCa 2+イオノフォアを使用することにより、トラブルシューティング、アゴニストとのFRET応答ではありません。イオノフォアが動作する場合、受容体は、おそらく発現していませんでした。
  2. FACS前日に、フィブロネクチンでコーティングされた4 96ウェルプレートを準備選別した細胞を採取する(ステップ3.5を参照してください)​​。 HEK293増殖培地50μlを添加し、5%(v / v)のCO 2、37℃でO / Nインキュベートします。
  3. 滅菌ボトルに5%PBSで(w / v)のBSA(5グラム/ 100ミリリットル)とフィルター(0.2μm)を準備します。
  4. (工程2.3〜2.5、 表2を参照) T25フラスコ中で増殖させた細胞を採取します。 PBS中の5%(w / v)のBSA 4mlに細胞ペレットを再懸濁します。 5分間の千×gで細胞を遠心。
  5. (w / v)のPBS中のBSAは約5×10 6細胞/ mlの最終濃度を得るために、メディアを吸引し、5%〜5ミリリットル中に細胞ペレットを再懸濁します。
    注:FAに確認してください細胞密度およびソート条件に関する具体的な要件については、CSの中核施設。
  6. 塊を除去するために40μmのセルストレーナーで再懸濁した細胞をフィルタリングします。下部チューブラウンド5ミリリットルのポリプロピレンに細胞を移します。 FACS施設への輸送のためのチューブを氷上に置きます。
  7. FACS施設で形質導入されたHEK293細胞をソートします。プログラムは以下のサイトメーターのようにFACSフロー上のパラメータは:、試料ホルダーのためのノズルと20 psiのための100ミクロンを4°Cに設定します。事前ソート分析に基づいて、選択した細胞は、 すなわち 、大型のeCFP蛍光(のeCFP励起、のeCFP発光)と大FRET(のeCFP励起、シトリン発光)蛍光を持つ「ゲート」、(下記の結果、 図2を参照てください]を選択します)。
  8. 預金個人は、よくピューロマイシンとHEK293増殖培地の50μLを含むあたり1クローンで、ステップ4.2で調製した96ウェルプレートに細胞を選別しました。 (TaのピューロマイシンでHEK293増殖培地50μlのを追加BLE 1)ウェルあたり100μlの合計。 5%(v / v)のCO 2で37℃で細胞をO / Nを維持します。
    注:HEK293増殖培地は、形質導入細胞の選択のためのピューロマイシンが含まれています。

5.培養およびソートの拡張、クローンCNiFERs

  1. 各ウェルから古いメディアを50μlを除去し、新鮮なHEK293増殖培地50μlの含有ピューロマイシン( 表1)で置き換えることにより、96ウェルプレートでCNiFERsを維持します。 2-3週間後、5〜7日毎〜90%コンフルエントになるまでこれを繰り返します。
  2. 優しくメディアを吸引し、PBSで穏やかに一回のすすぎのHarvest CNiFER細胞。 PBSを削除し、トリプシン/ EDTA(w / v)の0.05%の20μlを添加します。 CO 2(v / v)の5%、37℃で1~2分間インキュベートします。
  3. トリプシン処理した細胞にHEK293増殖培地の100μlを添加して、細胞を再懸濁。 400μlの新鮮HEK293増殖培地のウィットを含む24ウェルプレートに内容を転送時間ピューロ。ウェルは〜90%コンフルエントになるまで24ウェルプレートでは、5-7日毎にHEK293増殖培地250μlのを置き換えることによって、細胞を維持します。

6.蛍光プレートリーダーを用いてFRET応答に基づいて候補CNiFERsを特定

注:FACSを以下の4つの96ウェルプレートでは、生き残る> 100テスト可能なクローンがあるはずですし、元のクローンの多くが成長しないので、24ウェルプレートステージに展開します。潜在的な候補CNiFERsを識別するために、同族体アゴニスト、 例えば 、D2RのためのドーパミンとのFRET応答を3点分析を使用しています。

  1. 細胞は〜24ウェルプレートで90%コンフルエントである場合に、穏やかに培地を吸引。 0.05%から約100μlを添加する(W / V)、トリプシン/ EDTA、5%(v / v)のCO 2、37℃で1~2分間インキュベートします。トリプシン処理した細胞にHEK293増殖培地の400μlを添加して、穏やかな粉砕により細胞を混ぜます。
  2. CLOの最初のスクリーニングのための3点アゴニスト曲線を設定しますファミコン。各CNiFERクローンのための、 すなわち 、3つのウェル、 例えば 、A1、A2、A3のそれぞれに、24ウェルプレートのウェルの一つ、アリコートの細胞懸濁液100μl(約4×10 3細胞/ウェル)のフィブロネクチンコーティングした96ウェルプレート(透明底ブラック)(ステップ3.5を参照してください)​​。
  3. HEK293増殖培地(1.2ミリリットル最終容量)の千μLを含む12ウェルプレートに細胞懸濁液の残り〜200μlのを転送します。約90%コンフルエントになるまで、5%(v / v)のCO 2、37℃で両方のプレートをインキュベートします。 96ウェルプレートを、蛍光分析用で、12ウェルプレートに増殖するクローンを拡大するためのものです。
  4. 3点分析のために、0.1〜、1.0-あるアゴニストの3つの異なる濃度、および特定のGPCRのための10倍のEC 50を決定します 。手順で説明するように、薬物プレートにおけるアゴニスト濃度を準備し4.1.1-4.1.2。ステップ4.1.3-4.1.5で説明したように、蛍光プレートリーダーアッセイを実行します。
  5. FRを計算ET比(ΔR/ R)のステップ4.1.6で説明したように。バック凍結、およびより包括的な分析(ステップ7)、適切な感度と拡張のための最大のFRET応答を有するCNiFERsを選択してください。
  6. ステップ6.5で選択し、12ウェルプレート中で成長しているクローンの場合は、〜90%コンフルエントになるまで、5〜7日毎HEK293増殖培地600μlのを取り外して交換。
  7. 徐々に6ウェルプレートに12ウェルプレートからのクローンを展開し、[T25フラスコに(2.3ステップ- 2.6および表2)。記載されているようにT25フラスコは〜90%コンフルエント、収穫細胞である場合(2.3から2.5ステップ)。 HEK293増殖培地5ml中の細胞ペレットを再懸濁します。
  8. HEK293増殖培地の9ミリリットルでT75フラスコに細胞懸濁液の1ミリリットルを追加します。 (8.2から8.3ステップ)、液体N 2中で凍結保護し、保存のために細胞懸濁液の残りの4ミリリットルを使用してください。 8 1.5ミリリットルのクリオチューブを準備し、氷上に置きます。
  9. T75フラスコ中、メディアWを交換することによって細胞を維持しますi番目の新鮮HEK293増殖培地、 例えば 70〜80%コンフルエントになるまで10ミリリットル毎3-5日後〜1〜2週間。

蛍光プレートリーダーを用いてCNiFERクローンの7.最終的な選択

  1. プレートリーダーアッセイ前日に:
    1. 〜90%のコンフルエントT75フラスコから細胞を回収する(ステップ2.3から2.6、 表2を参照)。ウェルの細胞懸濁液〜100μlで5×10 4 /ウェルで96ウェルのフィブロネクチンでコーティングしたプレート(透明底黒)をシード。注:一つのクローンは、単一の96ウェルプレートに分配されます。
  2. 非特異的CNiFER応答から特異的アゴニスト応答を区別し、CNiFERクローンの包括的なスクリーニングのための薬物プレートを準備します。
    1. 全用量反応曲線を生成するには、予測されたEC 50の周りに10の異なるアゴニスト濃度を選択します。 「細胞なし」と「ACSF 'の2つのウェルのための2つのウェルを使用してください。
    2. 非特異的応答を決定するために、THRを選択12種類の神経伝達物質またはモジュレーター(72ウエル)のee濃度( 図3)。アゴニストと同様に、薬物プレートを重複して3倍の濃度が含まれています。三つの異なるアセチルコリン、グルタミン酸、オレキシン、VIP、アデノシン、セロトニン、ノルエピネフリン、GABA、サブスタンスP、メラトニン、ソマトスタチンおよびヒスタミンの濃度、50の3倍の濃度でそれぞれ、1,000および3,000 nMでの例については、100μlの96ウェル薬物プレートにロードされます。
  3. FRETを測定し、ステップ4.1.3-4.1.5で説明したようにソリューション転送を行うための蛍光プレートリーダー上のパラメータを設定します。
  4. 完全な用量反応曲線を分析するために、ピークFRET比(ΔR/ R)(ステップ4.1.6)を計算し、ログアゴニスト濃度の関数としてプロットし、Hillの式(ステップ11.4)に適合。 EC 50、ヒル係数、および最大FRET比を決定します。 12他の神経伝達物質/モジュレータのための、機能OとしてプロットピークΔR/ RF薬物濃度。
  5. 〜10同族体アゴニストのための大規模なFRET比、適切なEC 50を有するCNiFERクローン、および他の神経伝達物質アゴニストにほとんど、あるいは全くバックグラウンド応答(非特異的応答)を選択します。

8.フリーズバック選択CNiFERクローン

  1. 個々のCNiFERクローンの〜90%コンフルエントT75フラスコを使用してください。記載のように収穫細胞(2.3〜2.5、 表2ステップ )。凍結細胞は、HEK293増殖培地5ml中に細胞ペレットを再懸濁します。 10 1.5ミリリットルのクリオチューブにラベルを付け、氷上に設定してください。
  2. 凍結保護のために、細胞を1ミックス: 例えば 20%HEK293増殖培地中(v / v)のDMSOで1を、20%の5mlの(v / v)のDMSO /培地混合物を細胞懸濁液の5mlを穏やかに混合する(最終DMSOの濃度)は10%です。
  3. クリオチューブのそれぞれにアリコート1ミリリットル。 ( 材料を参照てください)発泡断熱ボックスで、-80℃の冷凍庫O / Nで細胞とチューブをフリーズします。転送がliquにクリオチューブ長期保存のためのID窒素。

マウス皮質へ9. CNiFER移植

  1. 手術前に、オートクレーブ内のすべての手術器具を滅菌します。 70%エタノールで拭い、きれいなラボおむつを敷設することにより、手術のために半無菌領域を準備します。
  2. 垂直電極プラーにガラスキャピラリー(0.53ミリメートルのIDを)引っ張ることによりCNiFER注入ピペットを準備します。なしのペアを使用してください。 〜40ミクロ​​ンの直径に電極の先端を破壊する5先の細い鉗子。
    注:これは最高の目盛付きステレオズーム顕微鏡下で達成されます。
  3. イソフルランで成人(生後60-90)C57BL / 6マウスを麻酔:4%(v / v)の誘導のため、および1.5〜2.0%(v / v)のメンテナンスのため。マウスが完全に麻酔されていることを確認するために、尾や足指のピンチを使用してください。
    定期的に再ピンチと麻酔の深さを再評価するために、手術全体ウィスカーけいれんを評価:注意してください。
  4. pまでの眼軟膏で目を覆いrevent乾燥。耳バーと定位フレームにマウスをマウントします。直腸プローブにより調節加熱パッドを使用して、37℃でマウスの体温を維持します。
  5. 動物電気シェーバーと12ミリメートルで約5ミリメートルの領域を剃ります。 70%(v / v)のイソプロパノール、続いてベタジンを適用します。頭蓋骨の表面上に皮膚を切断して除去するために、メスの刃を使用してください。頭蓋骨の表面から骨膜を除去するために、手術用メスの刃を使用してください。定位手術11について説明したように、頭蓋骨の表面を露出し、清掃してください。
  6. ブレグマと前後(A / P)および内外方向(M / L)を記録するために、空のガラスピペットを下げて調整します。マウス脳アトラスを参照すると、注射部位の位置を算出します。標的部位にピペットをシフトし、後続のウィンドウ形成のための頭蓋骨をマーク。パルミチン酸セチルらを参照てくださいげっ歯類11と定位注射の詳細については。
    注:注射やウィンドウのサイトには、REGに依存します検討されるべきイオン、神経伝達物質またはペプチドの分布は、皮質内の突起を解放します。例えば、最近の刊行物7に、定位は1.0 2.0ミリメートルのA / Pおよび1.0 2.0ミリメートルのM / Lに古典的条件時のドーパミン放出のin vivoイメージングのために前頭皮質にCNiFER細胞を注入するために使用された座標。
  7. 以前に12,13を説明したように2ミリメートルのx 3ミリメートル間引き頭蓋骨ウィンドウを形成します。
    注意:ウィンドウ内の骨が15-20μmの厚さでなければなりません。頭蓋骨の表面が湿潤されたときに骨が十分12,13を薄くする場合、骨に小さな白い斑点は、見えないはずです。
  8. 注入する細胞を調製しながら、しっとりそれを維持するために、ウィンドウにACSFに浸したスポンジを置きます。
  9. 〜80%コンフルエントにT75フラスコ中で増殖させたCNiFERクローンを収穫。メディアを吸引除去し、滅菌PBSで細胞を洗浄。
    注:トリプシンは、これらのステップのために省略されています。
  10. O PBSを削除し、10ミリリットルを使用F ACSFをフラスコの底から細胞を除去します。粉砕物の細胞は、細胞塊を解離します。 ACSF100μlのペレットを遠心分離し、再懸濁します。 ACSFで覆われたペレットを残し、1400×gで30秒間遠心分離し、上清を除去します。このステップは、懸濁液中の細胞の塊を残します。
  11. ミネラルオイルでステップ9.2で調製した注入ピペットを埋め戻し、ナノインジェクタ上にピペットをロードし、油の小さなビーズを排出するプランジャーを進めます。マウスの準備に近いプラスチックパラフィンフィルムのストリップ上CNiFER細胞懸濁液の5μLを入れてください。引っ張らピペットにCNiFERsまたは制御CNiFER細胞のいずれかを描画します。
  12. ターゲットXとY座標にピペットを移動し、 すなわち 、A / PおよびM / Lは、ステップ9.5で述べました。薄くなった頭蓋骨を貫通、ピペットを下げ、および皮質の層2/3にCNiFER細胞を堆積させるために、200から400μmの頭蓋骨の表面の下に〜し続けます。
  13. nanoinjecで最も深い部位でCNiFER細胞の〜4.6 NLを注入その後、器、石油・セルインターフェースでノート運動、細胞を分配するために、5分間待ちます。 〜100μmでピペットを撤回し、CNiFER細胞の別〜4.6 NLを注入し、5分待ってくださいその後CNiFERsの逆流を防止するために、ゆっくりと静かにピペットを撤回。隣接する1つ以上の部位での注射を繰り返します。
  14. 繰り返し注射は対照HEK293細胞(GPCRを欠くすなわち 、HEK293 / TN-XXL / Gのqi5クローン )で9.8から9.12を繰り返します。 CNiFERを分離し、〜200ミクロンによる細胞注射部位を制御します。
  15. 細胞移植を完了した後、ACSFで間引き頭蓋骨ウィンドウをすすぎ、頭蓋骨を乾燥するのを待ちます。ウィンドウの上( 材料を参照)シアノアクリレート接着剤のドロップを適用し、迅速に接着剤の上にプレカット滅菌カバーガラスを配置します。軽く数秒間頭蓋骨に対してカバーガラスを押してください。 2分12,13のための接着剤の乾燥をしてみましょう。
  16. 歯科用セメントおよびフォームAWとカバーガラスの縁をシール窓周りのエルは浸漬目的のために水を保持します。
  17. 撮像中にマウスの頭部を固定するために、ウィンドウの後ろにシアノアクリレート系接着剤(寸法や材料の詳細については、14を参照)の小滴で、特注のヘッドバーを取り付けます。接着剤が完全に乾燥した後、さらに、特注のヘッドバーを強化するために追加の歯科用セメントを追加してみましょう。
  18. 歯科用セメントの層で、ウィンドウを除いて、頭蓋骨の表面の残りの部分をカバーしています。皮膚のエッジがセメントで覆われていることを確認して、20分間、それが乾燥してみましょう。
  19. 手術後、イソフルラン投与を中止し、それが完全に麻酔から回復するまでケージに加熱パッド上でマウスを残します。術後鎮痛のための再水和および0.05〜0.1ミリグラム/キログラムブプレノルフィン(腹腔、即時放出)のために生理食塩水で(w / v)のグルコース(SC)の5%を注入します。
    注意:人間CNiFERsへの潜在的な免疫学的反応を最小限にするために、/ 100グラムのシクロ20μlのを毎日マウスを注入sporine(IP)CNiFERsの注射の前日を開始します。
  20. 食料や水のためにそのホームケージにマウスを返します。

CNiFERクローンのin vivoイメージング10

注:ライブイメージングは​​、二光子顕微鏡と頭部固定装置を使用して、マウスを用いて実施されます。無麻酔は、イメージングセッション中に必要とされません。アウェイク状態で動物を撮影するときは、ストレスレベルを低減するためには一度に数時間にヘッドレストを制限します。食料と水のためのイメージングセッションの間、それをホームケージに動物を返します。潜在的なストレスは、部屋の照明を暗くし、エンクロージャ内のマウスの一部を囲むことによって最小化されます。

  1. 手術の翌日には、頭部固定フレームに頭蓋骨に移植メタルヘッドバーをねじ込むことにより、イメージングプラットフォーム上でマウスをマウントします。
    注意:目を覚ましマウスを撮影するときは、イメージングセッションは、ヘッド拘束装置によって誘発される潜在的なストレスによる数時間を超えてはなりません。
  2. 10X(0.30 NA)および40X(0.80 NA)水浸対物レンズを搭載した2光子イメージング顕微鏡で頭拘束マウスを使って撮影台を置きます。
  3. シトリンを測定するための560 nmまでのeCFPおよび520nmでの測定のため500nmの460nmのにま​​たがる505 nmおよびバンドパスフィルタでダイクロイックミラーを持つFRETイメージング(のeCFPとシトリン)用のフィルターキューブを挿入します。
  4. 含むウェル間引き頭蓋骨ウィンドウにACSFを追加し、ACSFに水浸対物レンズを下げます。ウィンドウの下の皮質および血管系の表面を見つけるために水銀ランプおよびGFPフィルターキューブと一緒に接眼レンズを使用してください。
    注:血管系のパターンは、イメージングの繰り返し日間にわたって同じ領域を特定し、画像に役立ちます。 手動でGFPフィルターキューブや水銀ランプを用いて細胞の上に皮質の表面に焦点を当ててCNiFERsを見つけるために40X水浸対物レンズに切り替えます。
  5. 2光子イメージングのために設定します。 APを選択二光子イメージングのためpropriate光路。典型的な市販のシステムでは、2光子イメージングモードに切り替えると非デスキャン検出器における光電子増倍管(PMT)に光をリダイレクトするソフトウェアを使用しています。 、近赤外フェムト秒パルスレーザーをオンにする820 nmでの波長5〜15%に電力設定を選択します。注:5%の消費電力は、典型的には、試料で〜25ミリワットを提供します。
  6. 最大値に近いPMT1&PMT2電圧、PMTに応じて、通常、700〜1000 Vを設定します。各チャネルの1にゲインを設定します そして、客観のためのz位置をゼロ。
  7. 皮質表面から100〜200μmの〜目標を下げて、XYスキャンを開始します。 CNiFER蛍光の信号対雑音比を最適化するために、レーザーパワー、ゲイン、および各チャネルのPMT電圧、 すなわち 、のeCFPおよびシトリンを調整します。
  8. CNiFER細胞を含む領域だけでなく、backgrounにイメージを制限するためにソフトウェアでズーム機能を使用しますD地域。ピクセルあたり4マイクロ秒で1フレーム毎に2秒(0.5ヘルツ)を超えない遅いスキャンレートを使用してください。適切な信号対雑音比、 例えば 、カルマン2ライン平均化する平均線を調整します。
  9. 平面あたり約3〜4個の細胞を囲む、関心領域(ROI)CNiFER細胞の周りを描きます。 ROIの平均強度のリアルタイム分析を設定します。時間をかけてCNiFER蛍光を監視するために取得を開始します。
  10. 前と実験操作、 例えば 、ユーザによって決定されるような電気刺激、のChR2刺激、行動、中にCNiFERsからの蛍光を収集します。
  11. 画像化実験が終了すると、そのホームケージにマウスを返します。所望のように、日全体で撮影を繰り返します。ときに再イメージングする細胞は、同じイメージング分野(ステップ10.4)に戻って配向する以前に取得した低倍率の血管系の画像を参照してください。
    注:移植CNiFERsは、少なくとも7日間、画像化することができます。

11.データ解析

  • オープンイメージングファイルとCNiFERsと背景のための1つのROIのためのROIを選択します。各ROIの両チャンネルの「系列分析」を選択します。タブ区切りファイルとして各ROIのためのエクスポートの平均蛍光強度。
  • 蛍光値を分析するために数学ソフトウェア( マテリアルを参照)プログラムを使用します。低域通過フィルタ(0.3 Hz)で、各信号とその後のeCFPとシトリンの蛍光強度から各ROIにおけるバックグラウンド蛍光を差し引きます。
  • ベースラインの平均蛍光を計算し、FRET比ΔR(T)/ Rを測定するために、式(1)に記載のように比を計算します。
  • CNiFERsの感度を決定するために、ログのアゴニスト濃度の関数としてのFRET比をプロットします。科学的な統計ソフトとヒル式(式2)を用いて、EC 50及びヒル係数(n)を決定するために、ヒルの式にフィット。
  • Equation1

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    Representative Results

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    特定のGタンパク質共役受容体(GPCR)と遺伝的にコードされた[Ca 2+]センサ、TN-XXL:CNiFERを安定少なくとも二つのタンパク質を発現するように操作されたヒト胚腎臓(HEK293)細胞から誘導されます。 TN-XXLは、Ca 2+イオン6,15に対応して、それぞれ、シアンおよび黄色蛍光タンパク質間の蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を受けるのeCFPおよびシトリン。内因性G qをGタンパク質に、その夫婦のGPCRの活性化は、の[Ca 2+] PLC / IP 3経路を介し、TNXXLのCa 2+検出器からのFRETの増加につながる( 図1)細胞質ゾルの増加を誘発します。

    図1
    図1:作成するために必要なCNiFERsを開発するためのスキームトップ、GPCR-のCa 2+シグナル伝達経路CNiFERセル。ボトム、HEK293細胞を使用してCNiFERsを構築するための基本的な手順。遺伝的にコードされたFRETベースのCa 2+ -detector(TN-XXL)とステップ1.伝達します。ステップ2.形質導入するGαGタンパク質キメラ、 すなわち 、GのQS5、Gqi5、必要に応じて。ステップ3. CNiFERを作成するためのユニークなGPCRを伝達します。 2光子励起光(赤色)のeCFPエミッション(シアン)、シトリンエミッション(黄色)の両方を生産、FRETを受けるのeCFPを励起する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    FRETの増加は、神経伝達物質レベルの変化の迅速な光学的読み出しを提供します。神経伝達物質の特定の種類のCNiFERを開発するには、最初のGタンパク質の種類を決定することGPCRに結合します。 G qはのGPCRを共役型ため、GPCRは内因的に発現したG q個のタンパク質を使用してHEK293細胞。 GのためにI / Oの共役型のGPCR、クローンHEK293ラインは、最初のG qを-PLC / IP 3経路にGPCRをリダイレクトするキメラGタンパク質を発現するように作成されます。これは、主にGαq個の列とG Iのカルボキシル末端の5アミノ酸を含むキメラGタンパク質はG qi5、によって達成されます。 Gのqi5は、G、I / O共役型のGPCRとの通信が、G q経路を介してシグナル伝達するためにこれらの5つのアミノ酸で十分です。 G sの共役型のGPCRは、GのQS5キメラ、10を使用されています。 CNiFERを製造するための一般的な戦略は、以下のとおりです。1)、2)安定したGタンパク質キメラを発現するHEK細胞のレンチウイルス形質導入を使用して、安定した光のCa 2+検出器を発現しているクローンHEK293細胞、 すなわち 、TN-XXLを作成します、TN-XXLを発現するHEK293細胞クローン中で、必要に応じて、及び3)は、HEK293細胞において安定に発現するGPCRのクローンを作成しますTN-XXL及びキメラGタンパク質を発現するクローン。 TN-XXL及びキメラGタンパク質をGPCRを欠くが持つクローンHEK293ラインは「コントロールCNiFER」として機能します。制御CNiFERはCNiFER応答が特異的に操作された受容体の活性化、 すなわち 、D2Rはなく、内因HEK293細胞で発現される他の受容体の活性化に起因することを確認するために必要とされます。

    レンチウイルスを生成するには、レンチベクターの発現系が使用され、 例えば 、対象のパッケージング、形質導入、ウイルス発現の安定した統合ゲノムDNAの中に構築し、発現を担う遺伝的要素が含まれていpCDH-CMV-MCS-EF1-Puroを、遺伝子配列。ウイルス粒子の高い力価を産生するために、発現及びパッケージングベクターは、一過生産哺乳動物細胞及びウイルスに同時トランスフェクトされて回収されます。高いTIを生成することができ、米国内のいくつかのウイルス中核施設があります。ターレンチウイルス。 HEK293細胞の感染後、ピューロ遺伝子を形質導入HEK293細胞を同定するための抗生物質耐性を提供します。

    特定のクローン株を同定するために、HEK293細胞は、蛍光活性化細胞選別(FACS)システムを使用してソートされる形質。目的は、FRETベース Ca 2+の検出器とFRETを起こす能力の高い発現レベルを含んでいるクローンを単離することです。 FACS分析のこの例では、のeCFP放出の蛍光は、FRETシグナル(のeCFP励起およびシトリン放射)に対してプロットされています。ボックスは( 図2)96ウェルプレートにソートするために(「ゲーティング」)、続いて選択されることになる領域(P2とP3)をマークします。一般的に、約4 96ウェルプレートをCNiFERsを正常に作成をスクリーニングするのに十分です。これら4プレートから、約100個のクローンは、蛍光プレートリーダー分析に適しています。

    1 ">:" =キープtogether.within-ページFO」e_content 図2
    図2:FACS分析の例 FACS分析次の出力のサンプルシトリン放出(「FRET V-530/30 A」)の関数としてのグラフプロットのeCFP放出(「475/20 A」)、各セルについてのeCFP励起を使用。地域P2とP3のショー領域は個々の細胞にソートするために、ゲーティング、 すなわち 、選択されました。色は任意である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    選別された細胞が十分な密度まで増殖させた後、アゴニスト活性化後のFRET応答は、溶液処理を備えた96ウェル蛍光プレートリーダーシステムを使用して決定されます。勉強するクローンの数を絞り込むために、「3点」アゴニスト曲線をスクリーニングするために使用されている〜最高の応答を持つ100個のクローンを選択しCNiFERs。約10個のクローンは、その後、12他の神経伝達物質またはモジュレーターでプローブした同族体アゴニスト、および非特異的反応との完全な用量反応の決意をさらに分析します。 ACSF中の薬剤( 例えば 、アゴニスト、アンタゴニストなど )の96ウェル薬 ​​物プレートを3倍濃度(プレート3の最終濃度が1に希釈された)として調製されます。この例では、薬剤プレートは、その同族体アゴニスト、ドーパミン、および他の神経伝達物質およびペプチドアゴニスト( 図3)の様々な潜在的な非特異的応答とD2 CNiFERをテストするために設定されています。 GPCRを欠くバックボーンCNiFERは、新しく作成されたCNiFERのための重要なコントロールとして機能します。

    図3
    図3:96ウェルプレートのレイアウトの例トップ、layouのテーブル様々な神経伝達物質およびペプチドの3倍の濃度を用いて、蛍光プレートリーダーのための3倍薬物プレートをロードするためのトン。ボトム、CNiFERsを播種し、プレートリーダーで測定するための透明なプラスチック製96ウェル薬 ​​物プレートと黒の96ウェルプレートの例。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    GPCRの刺激は、TN-XXLによって細胞内の[Ca 2+]及び検出の上昇の結果として、FRET応答を増加すると予想されます。 eCFPの励起が小さいのeCFP放出と大きくシトリン放射を生成するように、これらの条件の下で、FRETは、接近のeCFPとシトリンによって生成されます。この例では、励起は436 nmおよび発光フィルターがシトリンのための485±7.5 nmでのeCFPおよび527±7.5 nmの( 図4)に設定されているに設 ​​定されています。 BAの三十秒seline蛍光を測定し、次いで、ACSFプレートの「三倍」アゴニストから50μlを各ウェルに100μlのACSFを含有するに送達される(1:3希釈)。 eCFPおよびシトリン放出蛍光を180秒ごとに3.8秒に測定されます。バックグラウンド測定は、細胞なしのウェルから採取し、必要に応じて、減算されます。蛍光強度は、正規化する刺激前ベースラインである(F(T)/ F(ベースライン))、およびピーク応答は、527のFRET比(ΔR/ R)F(t)を用い/ F(ベースライン)を計算するために測定されますnmおよび485 nmのチャンネル(式1)。用量応答曲線は、異なるアゴニスト濃度の関数としてのFRET比をプロットし、EC 50及びヒル係数( 図5)(式2)を決定するために、ヒルの式に適合することによって構成されています。最適なCNiFERは、大規模なFRET比および同族体アゴニストのための適切なEC 50を示し、他のneurotransmitにほとんど、あるいは全くバックグラウンド応答を示し、ターアゴニスト。これとは対照的に、制御CNiFERは同族体アゴニストにはほとんど反応を示さなければなりません。

    図4
    図4:溶液供給システムでプレートリーダーで測定アゴニスト誘発FRET応答 D2R CNiFER FRET応答の例 。 D2 CNiFERsに(A)、ドーパミン(赤いバー)の適用の間のFRET応答のプロット、 すなわち 、のeCFPとシトリン排出量のeCFP励起、。アゴニスト(ドーパミン)でしばらくシトリンの排出量の増加分のeCFPの放出が減少することに注意してください。 (B) ミュラーから変更された(A)図中の応答のためのFRET比(式1)のプロットは、2014年7。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。


    図5:D2 CNiFER のための用量反応曲線の例として 、ドーパミンにD2 CNiFERsの応答のための(A)用量反応曲線(黒DA)およびノルエピネフリン(NE、緑)のためにまた、D2Rを欠く「コントロール」CNiFERsの応答が示されています。 (B)棒グラフは、50 nmおよび1μMで他の神経伝達物質および変調器のためのFRET比の応答を示しています。値は平均±SEMです。ミュラー 、2014年7から変更された図。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    CNiFERクローンは、プレゼンテーションを識別、さらに可能な受容体依存性脱感作のために、それらの時間分解能について評価することができます二つの異なるアゴニストパルスの(詳細については、ミュラー 、2014年7を参照てください)。 CNiFERクローンを構築したが、次のステップは、 生体内でその機能をテストすることです。 インビボでの蛍光をモニターするためには、二光子顕微鏡を使用する必要があります。間引き頭蓋骨ウィンドウを調製した後、CNiFERsはガラスピペットにロードされ、皮質の層2/3に注入します。マウスは、その後、薄くなった頭蓋骨にガラスカバースリップに付着し、画像化( 図6)の間にヘッドを固定するためのヘッドバーを注入することによりin vivoイメージングのために準備されます。

    移植CNiFERsが生体内で生存可能であることを判断するには、アゴニストの既知濃度は、移植部位の近くに注射することができ、FRET比は7を決定しました 。さらに移植CNiFERsの活性を検証するには、入力ニューロンを刺激することを検討すべきです。例えば、D2 CNiFER、の効果を持ちます皮質に突出中脳ドーパミンニューロンの電気的刺激を調べました。 500μmの先端分離して電極を刺激0.1MΩタングステンバイポーラは、黒質(-3.2ミリメートルA / P、-1.3ミリメートルM / L、-4.4ミリメートルのD / V)に移植した。 図6電気の一例を示しています異なる強度で、黒質を刺激し、D2 CNiFERs 7のためのFRET比の増加を観察します。 D2受容体アンタゴニスト、エチクロプリド(1ミリグラム/キログラム)、ブロックD2 CNiFER応答の全身腹腔内(IP)注射に注意してください。ドーパミンのブロックの再取り込みは、電気的に誘発D2 CNiFER応答7を強化する一方、コカインの注射(15 mgの/ kg)を、上。

    図6
    図6:D2 CNiFERレスポンスI の例 黒質の電気刺激に続いてオング> nでビボ。(A)漫画は、in vivo二光子イメージングと電気刺激のために準備ヘッド固定マウスを示しています。励起用の二光子光(赤、820 nm)をのeCFP(青)とシトリン(緑)用の530 nmの発光のための475 nmの発光。 (B)ラインプロットは、D2 CNiFERのためのFRET比が500ミリ秒を50 Hzで50〜300μAのすなわち 、200マイクロ秒のパルス、黒質の電気刺激以下の皮質に注入し、D2Rの存在下で電気刺激を次の示し拮抗薬(エチクロプリド)またはコカイン。ミュラー 、2014年7から変更された図。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    ftp_upload / 53290 / 53290table1.jpg "/>
    表1:HEK293増殖培地とACSFを製造するための化学物質および試薬のリスト

    表2
    表2:異なるサイズの培養プレートまたはフラスコから細胞を収集するためのボリューム

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    Discussion

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    CNiFERsの作成 ​​は、光学的にin vivoでの脳内の神経伝達物質の放出を測定するための革新的でユニークな戦略を提供します。 CNiFERsは、理想的には、神経伝達物質、すなわちシナプスリリース、体積伝導を測定するのに適しています。重要なことには、各CNiFERは、脳内の神経伝達物質のレベルの変化の生理学的な光学的測定を提供する、天然のGPCRの特性を有します。現在までに、CNiFERsはアセチルコリンを検出するために作成されている(M1-CNiFER)6、ドーパミン(D2-CNiFER)7およびノルエピネフリン(α1A-CNiFER)7。

    原則として、CNiFERは、GPCRを介して信号の任意の神経伝達物質のために作成することができます。 G qをGタンパク質を介して、GPCR信号は、さらなる変更がHEK293細胞に必要とされない場合には。 I / O、但し、Gのqi5キメラGタンパク質の共発現を必要とするGを介してシグナルのGPCRカップルGPCRへのG のq / PLC経路7,10へ。同様に、G sを介してシグナル伝達GPCRは、キメラG QS5 Gタンパク質10の共発現が必要になります。完了したら、各CNiFERクローンをスクリーニングし、天然の受容体に匹敵する親和性を有するのみCNiFERクローンは、ほとんどまたは全く脱感作を示し、in vivoでの二光子顕微鏡で測定するために適切である信号対雑音比を提供します、 インビボ研究のために選択されます。

    in vivoでの研究のために、非常に任意の潜在的な免疫応答を最小限に抑えるために、シクロスポリンでマウスを治療することをお勧めします。拒絶反応の可能性やげっ歯類の脳に人間CNiFER細胞を移植すると免疫応答があります。これはCNiFER移植後、GFAPおよびMAC1 7の発現を調べることによって、以前に検討しました。 CNiFERsは、グリア瘢痕を生成したり、任意のsigniを生成するために、表示されませんでしたficant MAC1染色7。

    CNiFERsを構築する際に考慮すべき二つの主要な問題は、感度と脱感作されています。 EC 50は、天然の受容体に対して、 すなわち 、低親和性、高すぎる場合には、CNiFERは、 インビボでの神経伝達物質の放出を検出するのに十分な感度を有していなくてもよいです。一つの解決策は、クローンを再スクリーニングし、高い親和性を有する異なるCNiFERクローンを選択することです。代替戦略は、GPCRの活性化に対するEC 50をシフトすることができ、より高い Ca 2+感受性を有することができる遺伝的にコードされた蛍光体 Ca 2+ -detectors、他のタイプをテストすることです。 CNiFER設計はモジュール式であるため、容易にそのようなGCaMP 16などの遺伝的にコード化され Ca 2+ -detectors、他のタイプに適合されます。同じ受容体が異なるEC 50秒でCNiFERクローンを分離することにより、内因性のneuの検出リリースのダイナミックレンジを拡張するために有利で ​​す生体内での伝達物質。

    CNiFERの脱感作はまた、 インビボでの使用が制限されます。ピーク応答が徐々にアゴニストの各パルスに伴って減少した場合、受容体は、脱感作することができます。この場合、他のクローンを調べ、それらが同じように応答するかどうかを決定します。受容体のアミノ酸配列に対する修飾、または受容体の他のサブタイプの使用は、アゴニスト依存性の脱感作に対処する必要があるかもしれません。リン酸化またはアミノ酸の既知のサイトがある場合は、Gタンパク質受容体キナーゼ(のGRK)とその仲間を識別し、1つ以上の部位を変異させることによってGPCRの非脱感作変異体を構築することが賢明であろう。脱感作のメカニズムは、ケースバイケースで各受容体のために決定されなければなりません。

    これまでのところ、CNiFERsは2つだけの光子マイルでのイメージング蛍光体で制限を分光することにより、皮質6,7の浅層に注入されました17,18 croscopy。将来的には、CNiFERsは皮質下の脳領域に移植することができるように、蛍光19のファイバベースの測定値とCNiFER技術を適応させることが可能です。

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    Disclosures

    著者らは、開示することは何もありません。

    Acknowledgments

    私たちは、校正のためのイアンGlaaserとロバート・リフキン、クローンのスクリーニングの支援のために、電子機器の支援のためのG qi5とG QS5のcDNA、A.シュヴァイツァーを提供するためのN.テイラーB.コンクリン(カリフォルニア大学サンフランシスコ校)を感謝します、およびTN-XXLのためのオリビエ​​Griesbeck。 (; DA037170 DA029706)、医学および生物工学研究所(NIBIB)(EB003832)、ホフマン・ラ・ロシュ(88610A)と「神経科学この作品は、薬物乱用に関する米国国立研究所(NIDA)を通じて研究助成金によってサポートされていましたNIDA(DA007315)を通じて虐待」訓練助成金の薬に関連します。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro  System Biosciences CD510B-1 Cloning: for generating lentivirus
    12 x 75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube BD Biosciences 352063 FACS
    BD 40 um Falcon cell strainers BD Biosciences 352340 FACS
    0.05% Trypsin EDTA  Invitrogen 25200056 FACS
    96 Well Plate, flat bottom, clear  Corning  3596 FACS
    96 well cell culture plates  Corning  CLS3997 Flexstation
    Optilux black clear bottom  Corning  3603 Flexstation
    Flexstation pipet tips Molecular Devices 9000-0911 Flexstation
    Acetylcholine Chloride   Sigma-Aldrich A2661 Flexstation
    Norepinephrine   Sigma-Aldrich A7256 Flexstation
    Dopamine Hydrochloride   Sigma-Aldrich PHR1090 Flexstation
    GABA   Sigma-Aldrich A2129 Flexstation
    Histamine   Sigma-Aldrich H7125 Flexstation
    Glutamate   Sigma-Aldrich 49621 Flexstation
    Epinephrine   Sigma-Aldrich E4642 Flexstation
    Somatostatin    Sigma-Aldrich S1763 Flexstation
    5HT    Sigma-Aldrich H9523 Flexstation
    VIP  Alpha Diagnostics Inc.    SP-69627 Flexstation
    Orexin A Alpha Diagnostics Inc.    12-p-01 Flexstation
    Substance P   Sigma-Aldrich S6883 Flexstation
    Adenosine Sigma-Aldrich A4036 Flexstation
    Melatonin  Sigma-Aldrich M5250C Flexstation
    Fluorescence Plate Reader & software Molecular Devices Flexstation 3 Flexstation
     DMEM (high glucose) with Glutamax   Life Technologies 10569-010 Tissue culture
     Fetal bovine serum Life Technologies 10082-139 Tissue culture
     Pen/Strep  antibiotics Life Technologies 15140-122 Tissue culture
     Puromycin   InvivoGen ant-pr-1 Tissue culture
     Fibronectin  Sigma-Aldrich F0895 Tissue culture
    CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box Bioexpress D-3508) Tissue culture
    cyanoacrylate glue  Loctite Loctite no. 495 surgery and stereotaxic injection
    plastic paraffin film  VWR Parafilm® surgery and stereotaxic injection
    Nanoinjector Drummond 3-000-204 surgery and stereotaxic injection
    Glass electrodes Drummond 3-000-203G surgery and stereotaxic injection
    hand held drill OSADA Exl-M40 surgery and stereotaxic injection
    Burrs for drill Fine Scientific 19007-05; 19007-07) surgery and stereotaxic injection
    Sterilizing bath FST 18000-45, Hot Bead Sterilizer surgery and stereotaxic injection
    isoflurane chamber/mask Highland Medical Equipment 564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm surgery and stereotaxic injection
    3D scope with arm Zeiss surgery and stereotaxic injection
    fiber optic light surgery and stereotaxic injection
    Betadine  surgery and stereotaxic injection
    70 % (v/v) isopropyl alcohol surgery and stereotaxic injection
    Povidone-Iodine Prep Pads dynarex 1108 surgery and stereotaxic injection
    NaCl 0.9% (injection, USP, 918610) surgery and stereotaxic injection
    CYCLOSPORINE (INJECTION, USP) surgery and stereotaxic injection
    Buprenex (injection) buprenorphine (0.03 μg per g rodent) Sigma-Aldrich surgery and stereotaxic injection
    Ophthalmic ointment  Akorn NDC 17478-235-35 surgery and stereotaxic injection
    Surgifoam Ethicon surgery and stereotaxic injection
    Grip dental cement Dentsply #675571, 675572 surgery and stereotaxic injection
    Instant SuperGlue  NDindustries surgery and stereotaxic injection
    LOCTITE 4041 surgery and stereotaxic injection
    METABOND C&B surgery and stereotaxic injection
    no. 0 cover glass Fisher surgery and stereotaxic injection
    stereotaxic frame  Kopf surgery and stereotaxic injection
    Rectal probe and heating pad FHC 40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe surgery and stereotaxic injection
    optical breadboard for imaging Thorlabs surgery and stereotaxic injection
    Mineral oil Fisher S55667 surgery and stereotaxic injection
    Kwik-Cast (Silicone elastomer) World Precision Instruments surgery and stereotaxic injection
    Suture   Ethicon 18’’, 1667, 4-0 surgery and stereotaxic injection
    Scissors Fine Scientific Tools 91500-09, 15018-10 surgery and stereotaxic injection
    Forcepts Fine Scientific Tools 11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10 surgery and stereotaxic injection
    Student Halsted-Mosquito Hemostats Fine Scientific Tools 91308-12 surgery and stereotaxic injection
    Small Vessel Cauterizer Kit Fine Scientific Tools 18000-00 surgery and stereotaxic injection
    Hot Bead Sterilizers Fine Scientific Tools 18000-45 surgery and stereotaxic injection
    Instrument Case with Silicone Mat Fine Scientific Tools 20311-21 surgery and stereotaxic injection
    Plastic Sterilization Containers with Silicone Mat Fine Scientific Tools 20810-01 surgery and stereotaxic injection
    2P fixed-stage fluorescence scope for in vivo imaging Olympus FV1200 MPE in vivo imaging
    Multiphoton laser SpectraPhysics Mai Tai DeepSee in vivo imaging
    Green Laser Olympus 473 nm Laser in vivo imaging
    xy translational base Scientifica MMBP in vivo imaging
    FRET filter cube for YFP and CFP Olympus in vivo imaging
    10x and 40x water immersion objectives Olympus in vivo imaging
    air table Newport in vivo imaging
    custom built light-tight cage Thorlab in vivo imaging

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    References

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    神経伝達物質を光学的に検出するための細胞ベースの神経伝達物質の蛍光エンジニア記者の建設(CNiFERs)<em&gt;インビボ</em
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    Lacin, E., Muller, A., Fernando, M., Kleinfeld, D., Slesinger, P. A. Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo. J. Vis. Exp. (111), e53290, doi:10.3791/53290 (2016).More

    Lacin, E., Muller, A., Fernando, M., Kleinfeld, D., Slesinger, P. A. Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo. J. Vis. Exp. (111), e53290, doi:10.3791/53290 (2016).

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