Summary
Biz hacimsel nörotransmitter salınımı optik tespiti için hücre tabanlı nörotransmiter floresan mühendislik gazetecilere (CNiFERs) oluşturmak için bir protokol mevcut.
Abstract
Hücre bazlı nörotransmiter floresan mühendislik gazetecilere (CNiFERs) Nörobilimadamları optik in vivo beyinde nörotransmitterlerin salınımını tespit etmek için yeni bir araç sağlar. Belirli CNiFER sabit şekilde belirli bir G protein-eşli reseptörü, G q Çift / 11 G proteinleri ve bir oyma göre Ca2 + -detector, TN-XXL eksprese eden bir insan embriyonik böbrek hücre oluşturulur. reseptörünün aktivasyonu FRET sinyali bir artışa yol açar. Bir CNiFER klonu dopamin için D2R, örneğin, belirli bir nörotransmitter için yerel reseptörünü kullanır, çünkü CNiFERs nM duyarlılık ve saniye zamansal tepki var. CNiFERs doğrudan beyne implante in vivo hacim iletimi ölçmek için idealdir, daha az yüz mikron mekansal çözünürlükte nörotransmitter salınımını anlamda sağlayarak vardır. CNiFERs da vi olası çapraz reaktivite için diğer ilaçları taramak için kullanılabilirvo. Biz son zamanlarda GPCRs G i / o G proteinleri bu çift eklemek için CNiFERs ailesi genişledi. CNiFERs asetilkolin (ACh), dopamin (DA) ve norepinefrin (NE) tespit edilmesi için kullanılabilir. Herhangi bir GPCR CNiFER bir roman oluşturmak için kullanılabilir göz önüne alındığında yaklaşık insan genomunda 800 GPCR'ler olduğunu tasarlar, gerçekleştirmek ve CNiFER her türlü test etmek için buraya genel prosedürü açıklar.
Introduction
Tam nöronlar beyinde nasıl iletişim anlamak için, in vivo nörotransmitterlerin salınımını ölçmek için bir yöntem olması gereklidir. In vivo olarak nörotransmitter ölçmek için çeşitli iyi bilinen teknikler vardır. Genel olarak kullanılan bir teknik, bir kanül, beyin içine yerleştirilir ve beyin omurilik sıvısı, küçük bir hacme ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi ve elektrokimyasal algılama 1 kullanılarak analiz edildiği mikrodiyaliz vardır. Mikrodiyaliz sondası birkaç çapları düzeyinde bir uzaysal çözünürlüğü, örneğin ~ 200 mikron çapında mikroprob 0.5 mm. Bu tekniğin zamansal çözünürlüğü, Bununla birlikte, tipik olarak ~ 5 dakika 1 ya da daha uzun süre örnekleme aralıkları yavaştır. Ayrıca, analizler gerçek zamanlı olarak yapılmaz. Başka bir teknik beyin içine yerleştirilen bir karbon-fiber prob kullanır hızlı tarama döngüsel voltametri (FSCV) 'dir. FSCV mükemmel temp vardırOral çözünürlük (subsecond), yüksek hassasiyet (nanomolar), ve 30 mikron 5 prob çapları uzamsal çözünürlük. Bununla birlikte, FSCV bir karbon potansiyometrik prob 2 gerilimi ile tipik bir oksidasyon ve redüksiyon profili üretmek vericiler ile sınırlıdır.
Nörotransmitterlerin ölçmek için üçüncü bir teknik genetik olarak kodlanmış nörotransmitter (NT) biyosensörler 3 ile doğrudan. Bu yöntemde, bir füzyon proteini, bir flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) fluorophores 4 merkezli bir çift ya da sırası değiştirilerek GFP 5 bağlanmış bir verici için bir ligand bağlayıcı etki alanı içeren oluşturulur. Önceki iki yöntemlerden farklı olarak, bu biyosensörler genetik olarak kodlanmış ve transgenik hayvanların üretimi yoluyla veya akut hücreleri enfekte viral ajanların kullanımı ile, örneğin, bir nöron olarak, bir konak hücrenin yüzeyi üzerinde ifade edilmiştir. Bugüne kadar, genetik olarak kodlanmış biyosensörler yalnızca algılama gibi geliştirilmiştirg glutamat GABA 3-5. Bu teknikler ile sınırlamalar nM aralığında düşük hassasiyet, ve G-protein bağlı reseptör (GPCR) aracılığıyla sinyal örneğin vericiler, klasik nörotransmitterler, nöropeptitler ve nöromodülatör, çok sayıda algılama genişletmek yetersizlik olmuştur. Aslında, insan genomunda yaklaşık 800 GPCR'ler vardır.
Bu eksiklikleri gidermek için, biz bir GPCR aracılığıyla sinyal herhangi nörotransmiter optik ölçüsü serbest bırakmak için yenilikçi bir araç geliştirdik. CNiFERs (hücre bazlı nörotransmiter flüoresan tasarlanmış muhabir), uyarıldığında, [Ca2 +] bir genetik olarak kodlanmış FRET göre Ca2 + sensörü tarafından tespit edilir hücre içi bir artış tetikleyen belirli bir GPCR ifade etmek üzere geliştirilen klonal HEK 293 hücreleri TN-XXL. Bu nedenle, CNiFERs nörotransmiter reseptörü floresansında bir değişiklik olarak bağlanan bir doğrudan ve gerçek zamanlı bir optik r temin dönüşümüYerel nörotransmitter faaliyet ead-out. Belirli bir nörotransmitter doğal reseptörü kullanılarak, CNiFERs kimyasal özgüllük, afinite ve endogen şekilde eksprese reseptörlerin zamansal dinamikleri saklayın. Bugüne kadar, CNiFERs üç tip dopamin tespit etmek için M1 reseptörü, tek kullanılarak asetilkolin saptanması için bir oluşturduk D2 reseptörü kullanılarak ve α1a reseptör 6,7 ile norepinefrin saptanması için bir. CNiFER teknolojisi GPCR her tür o mükellef hale kolayca genişletilebilir ve ölçeklenebilir. Bu vallahi yazıda tarif ve herhangi bir uygulama için in vivo CNiFERs olarak, tasarım gerçekleştirmek için metodoloji ve testi göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada yapılan tüm hayvan prosedürleri Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) kurallarına uygun olarak, ve Sina Dağı'nda Tıp Icahn Okulu ve University of California, San Diego IACUCs tarafından onaylanmıştır.
1. HEK293 Hücreleri Dönüşüm için lentivirüs GPCR ifade eden oluşturun
- Ticari bir kaynağı, örneğin, cdna.org belirli bir GPCR için cDNA elde edin. Seçenek olarak ise, PCR kullanılarak bir cDNA kütüphanesinden GPCR genini çoğaltmak. Böyle pCDH CMV-MCS-EF1-Puro (pCDH) gibi bir lentivirüs ifade eden vektör, edinin. DNA yayılması gibi lentivirüs oluşturmak için bu vektör kullanın.
- PCR ile lentivirüs ifade vektörüne GPCR cDNA klonu. PCR alt klonlama ile ilgili ayrıntılar için, Lorenz 8 bakınız.
- Expand ve üreticinin talimatlarına göre bir endotoksin ücretsiz 'maksi' hazırlık kiti kullanılarak GPCR-pCDH DNA arındırmak. pCDH mutation- olduğunu içine GPCR cDNA alt klonlanmış olduğunu teyitDNA dizilemesi ile serbest.
Not: Ön virüs üretimi için DNA göndermeden, insert DNA saflığı boyutunu doğrulamak için uygun sınırlama enzimi ile bir kısım sindirimi. - Bir virüs çekirdek tesisi, vb Salk Enstitüsü, Penn. Üniversitesi, ya da Kuzey Carolina Üniversitesi'nde gibi birini kullanarak lentivirüs üretmek, ya da in-house 9 üretir. T75 şişesi içinde HEK hücrelerinin transfeksiyonu için, endotoksin olmayan DNA'nın yaklaşık 25 ug (> 1 mg / ml) kullanarak. 1.8 ~ bir absorbans oranı (A 260 / A 280) sahip olan DNA yüksek saflıkta olduğundan emin olun.
Not: 10 ml / 11 -10 12 GC HEK293 hücrelerinin transdüksiyonu için en uygun olan ~ virüs titreleri.
2. In vitro kültür için HEK293 / TN-XXL Omurga Celi tipi seçimi
G I / O, G q / 11 veya GPCR G G proteinleri, bu dic, örneğin, G protein bağlama spesifitesi belirleyin: NotG proteini kimera CNiFER için gerekli olup olmadığını tates. Örneğin G q -coupled reseptörler, M1 muskarinik reseptör için, HEK293 / TN-XXL omurga HEK293 hücre tipi olarak (# 3G8) seçin. G / Ç -coupled reseptörleri için kimerik G protein G qi5 10 gereklidir. G s -coupled reseptör, G qs5 chimera 10 ihtiyaç vardır. Bu protokol, bir D2R CNiFER yapımında bir örnek olarak kullanılır. I / o G proteinleri ve G aracılığıyla D2R sinyalleri stabil kimerik G proteini, G qi5, örneğin, HEK293 / TN-XXL / G qi5 _ # qi5.6 ifade HEK293 hücreleri gerektirir.
- Bir araştırma laboratuarından HEK293 / TN-XXL / G qi5 _ # qi5.6 klonal hücreler elde edin. Not: klonal hücrelerin ardından HEK293 / TN-XXL G q -coupled reseptörler için (# 3G8), HEK293 / TN-XXL / G qi5 (# qi5.6) G i / o -coupled reseptörleri ve HEK293 / TN -XXL / G qs5 (# qs5.47) .G -coupled receptors, istek 6,7 üzerine serbestçe kullanılabilir.
- Büyüme ve HEK293 büyüme ortamı (Tablo 1), 5 ml bir T25 şişesi içinde ~ qi5.6 uzakta _ 90.% konfluent HEK293 / TN-XXL / G qi5 genişler. % 5 (h / h) CO2 ile 37 ° C 'de nemlendirilmiş bir inkübatör hücreleri büyütün.
Not: HEK293 hücreleri kültür olan tüm çalışma, standart steril doku kültür teknikleri kullanılarak yapılmalıdır. - İlk T25 şişesi ortamı aspire HEK293 hücreler hasat. nazikçe PBS 5 ml ekleyerek ve balon sallanan hücreleri yıkayın.
- PBS çıkarın ve% 0.05 (ağ / hac) tripsin / EDTA (Tablo 2) 1 ml. % 5 (h / h) CO2 ile 37 ° C 'de 1 dakika ila 2 inkübe edin.
- hücreleri toplamak ve 15 ml konik tüp steril transfer. bir hücre kültür santrifüjde 1,000 xg'de 5 dakika boyunca santrifüj. süpernatant aspire.
- HEK293 büyüme ortamı, 5 ml hücre pelletini. kullanarak bir hemasitometre hücreleri saymaktripan mavisi. hücre yoğunluğu hesaplayın ve 3. adıma geçin.
3. HEK293 ve lentiviral İletimi / TN-XXL / Gqi5 Hücreleri
- 0.7 x 10 6 HEK293 / TN-XXL / G qi5 hücreleri ile bir T25 şişesi Tohum. Yaklaşık 1 gün sonra,% 50 konfluent ~ kadar% 5 (h / h) CO2 ile 37 ° C 'de nemlendirilmiş bir inkübatör hücreleri büyütün. kalan hücreleri Freeze (8.2-8.3 adımlar). Bu hücreler, GPCR yoksun yani CNiFER kontrolü, bir CNiFER olarak hizmet edecektir.
- Enfeksiyonun gün, HEK293 büyüme ortamı (Tablo 1) 2 ml toplam hacim içinde 10 9 GC / ml olan bir son konsantrasyona kadar GPCR ifade lentivirüs (adım 1.4) seyreltin. Örneğin, bir T25 şişesi içinde 2 mi ortama 10 11 GC / ml virüs 20 ul ekle.
Not: virüs titresi bilgi virüs çekirdek tesisi tarafından sağlanmalıdır. Bir santrifüj tüpüne lentivirüs ve medyayı birleştirin ve yavaşça çiğnemek. lentiv yüksek titerleriirus biyogüvenlik düzeyi 2 (BSL-2) 'dir. - T25 şişesi medya aspire. Adım 3.2 virüs / medya karışımı 2 ml ekleyin. % 5 (h / h) CO2 ile 37 ° C 'de T25 şişesi O / N inkübe edin.
- Enfeksiyonun bir gün sonra virüs / medya karışım aspirat ve HEK293 büyüme ortamı içeren puromisin ile değiştirin (2 ug / ml, Tablo 1). Puromisin kalıt aktarımlı hücreler için seçim yapmaktadır. ~ 1-2 gün sonunda, yaklaşık% 90, birbirine karışana kadar% 5 (h / h) CO2 ile 37 ° C 'de balon inkübe edin.
- Adım 4.1'de 10 puanlık bir agonisti / aktivasyon eğrisi oluşturmak için, fibronektin ile kaplı 96 oyuklu bir plaka (şeffaf tabanlı siyah) hazırlayın. steril bir başlık olarak, 96 gözlü plaka sıraları A ve B oyuk başına 50 ul fibronektin (5 ug / ml) ekleyin. 1 saat süre ile, oda sıcaklığında inkübe plakası. PBS ile durulama başına 5 dakika boyunca iki kez yıkayın. HEK293 büyüme ortamı 50 ul ekle ve% 5 (h / h) CO2 ile 37 ° C 'de O / N inkübe edin.
Not: Fibronectin ile muamele edilmiş plakalar ticari olarak temin edilebilmektedir. - Adımda 2.3-2.6 (Tablo 2) tarif edildiği gibi T25 şişesi içinde hücreler hasat edilir.
- HEK293 büyüme ortamı, 5 ml hücre pelletini. FACS analizi için hücreler 1.5 ml olan bir T25 şişesi tohumu. Ayrıca, dondurma ve depolama için hücrelerin 1 ml T75 balon tohum (bakınız aşamalar 8.2-8.3)
- 10 sayılık agonisti eğrisi için, oyuk başına hücre süspansiyonu 100 ul (adım 3.5) 'dan fibronektin kaplı 96 oyuklu plakanın ilk iki sıra (A ve B) tohum.
- ~ 1-2 gün sonra,% 5 (h / h) CO2 ile 37 ° C'de yaklaşık ~% 90 konfluent kadar HEK293 bir T25 şişesi, T75 şişesi içinde büyüyen hücreler ve 96 oyuklu plaka inkübe edin.
4. FACS ve tek CNiFER Klonların İzolasyonu
- 10 maddelik bir agonist aktivasyonu eğrisini oluşturmak için 96-plaka kullanın.
Not: (FACS) analizi Kontrol THP başlamadan önce, onaylamak önemlidirbir agonist yanıtı (10 maddelik agonisti eğrisi) için transduced hücrelerin test ederek GPCR ifadesi. Bu test, bir florometrik plaka okuyucu kullanılarak gerçekleştirilir.- 10-noktalı agonisti aktivasyon eğrisi için bir ilaç tabak hazırlayın. Literatürden belirlenebilir EC50 tahmin ülkenin 10 değişik agonist konsantrasyonu, seçin.
Not: CNiFER plaka 3 seyreltme: İlaç levhası 1 ayarlamak için (iki kez) her bir konsantrasyonu için 3 kat içerir. Örneğin, bir D2 CNiFER test etmek için bir ilaç plakası 3 kat konsantrasyonlarda dopamin 10 farklı konsantrasyonda içerir, 0.2, 0.5, 1, 3, 5, 10, 20, 30, 50 ve 1000 nM. CNiFER plakası, bu nedenle, dopamin nihai konsantrasyonları 0.067, 0.167, 0.333, 1.00, 1.67, 3.33, 6.67, 10.0, 16.7 ve 333 nM. - Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) (Tablo 1) kullanılarak agonist solüsyonları hazırlayın. 'ACSF', örneğin, A1 ve A2 için iki kuyu kullanınve 'hayır hücreler' gibi, B1 ve B2 için iki kuyu.
Not: Bir seri seyreltme yöntemi kullanılarak, farklı ilaç konsantrasyonunun hazırlanması. CNiFER klonları ve ilaç konsantrasyonları (Şekil 3) izlemek için bir şablon oluşturun. - FRET ölçüm ve çözüm transferleri gerçekleştirmek için 96-iyi florometrik plaka okuyucu programlamak için yazılımı kullanın.
- 37 ° C plaka okuyucu sıcaklığını ayarlamak.
- TN-XXL ile FRET ölçmek için, 436 ± 4.5 nm (merkez ± HWHM) için dalgaboyu ayarlayın. eCFP ve Citrine için 527 ± 7.5 nm 485 ± 7.5 nm emisyon filtreleri ayarlayın. sırasıyla, eCFP ve Citrine için kesim 475 ile filtre ve 515 nm ayarlayın.
- 485 nm ve 527 nm 180 sn olmak üzere toplam her 4 sn emisyon ölçmek için plaka okuyucu Program. 30 saniye topladıktan sonra, CNiFER plakada 100 ul 3-kat madde plaka 50 ul sunmak için seçeneğitaban floresans.
- Sıra A ve B'den medya aspire ve bir 96-kuyu CNiFER plaka ~% 90 konfluent (adım 3.9) için ACSF 100 ul ekleyin.
- 96-iyi CNiFER plaka ve plaka okuyucu '3 kat' uyuşturucu plaka yükleyin. 37 ° C'de plakalar dengelenmeye ~ 30 dakika bekleyin. Ardından, programı başlatın.
- , Plaka okuyucu verileri analiz bir elektronik tabloya floresan değerleri aktarmak için. CNiFERs ile kuyulardan (hücreler olmadan kuyulardan her sinyal için alınan) arka plan ölçümleri çıkarmak için bir formül oluşturun. Floresan yoğunlukları taban-uyarıcı öncesi normalize, F Citrine (t) / F Citrine (başlangıç) ve FRET oranı (Ír / R.; Denklem 1) hesaplamak tepe yanıtları 527 nm ve 485 nm emisyon de kullanarak (adım 11 bakın ).
Not: agonist ile Ír / R önemli bir değişiklik varsa, o zaman bu GPCR ifadesini gösterir ve bir FACS analizi (adım 4.2) devam edebilirsiniz. inci eğerere Ca 2 + yanıtını test etmek ve bu FRET tabanlı sensör çalıştığını doğrulamak için, örneğin, A21387 Ca 2 + iyonofor kullanarak giderilir, agonist ile hiçbir FRET yanıttır. iyonofor çalışırsa, o zaman alıcı muhtemelen ifade değildi.
- 10-noktalı agonisti aktivasyon eğrisi için bir ilaç tabak hazırlayın. Literatürden belirlenebilir EC50 tahmin ülkenin 10 değişik agonist konsantrasyonu, seçin.
- FACS bir gün önce, fibronektin ile kaplı dört adet 96 oyuklu plakalar hazırlamak kriteri hücrelerin toplanması için (adım 3.5). HEK293 büyüme ortamı 50 ul ekle ve% 5 (h / h) CO2 ile 37 ° C 'de O / N inkübe edin.
- % 5 hazırlanması (a / h) BSA, PBS içinde (5 g / 100 mi) ve steril bir şişeye filtre (0.2 um).
- T25 şişesi içinde yetiştirilen hücreler (bakınız adım 2.3-2.5, Tablo 2) hasat edilir. % 5 PBS (w / v) BSA 4 ml hücre pelletini. 5 dakika boyunca 1.000 xg'de hücreleri Santrifüj.
- (W / v) PBS içinde BSA ~ 5 x 10 6 hücre / ml'lik bir son konsantrasyon elde etmek üzere ortam aspire ve% 5 ~ 5 ml hücre pelletini.
Not: FA ile kontrolhücre yoğunluğu ve sıralama koşullarına özel gereksinimleri için CS çekirdek tesis. - kümeleri kaldırmak için bir 40 mikron hücre süzgecinden ile yeniden süspanse hücreleri Filtre. alt tüp yuvarlak bir 5 ml'lik polipropilen hücreleri aktarın. FACS tesisine taşınması için buz üzerinde tüp yerleştirin.
- FACS tesisinde transduced HEK293 hücreleri sıralayın. Bir FACS parametreler sitometresi aşağıdaki gibi akış programı: örnek tutucu, meme ve 20 psi için 100 mikron 4 ° C olarak ayarlayın. Ön sıralama analizine dayalı, hücreleri seçin, yani büyük bir eCFP floresan (eCFP uyarma, eCFP emisyon) ve büyük FRET (eCFP uyarma, Sitrin emisyon) floresan sahip bir 'kapı', (aşağıda Sonuçlar, Şekil 2 bakınız seçin ).
- Deposit tek tek iyi puromisin ile HEK293 büyüme ortamında 50 ul ihtiva eden her bir klon, aşama 4.2'de hazırlanan 96 oyuklu bir plakaya kriteri hücreleri. (Puromycin ile Ta HEK293 büyüme ortamı 50 ul ekleyinks 1) oyuk başına 100 ul toplam. % 5 (h / h) CO2 ile 37 ° C 'de hücreler O / N koruyun.
Not: HEK293 büyüme ortamı transduse edilmiş hücrelerin seçilmesi için puromisin içerir.
5. Kültüre ve sıralanmıştır Genişleme, Klon CNiFERs
- Her bir eski ortamın 50 ul çıkarılması ve taze HEK293 büyüme ortamında 50 ul ihtiva eden puromisin (Tablo 1) ile değiştirerek, 96 oyuklu plakalar içinde CNiFERs koruyun. 2-3 hafta sonra,% 90 konfluent ~ kadar bu her 5 ila 7 gün tekrarlayın.
- ortamı yavaşça aspire edilmesiyle ve bir kez PBS ile hafifçe durulanarak Hasat CNiFER hücreleri. PBS çıkarın ve tripsin / EDTA (w / v)% 0.05 20 ul ekle. % 5 (h / h) CO2 ile 37 ° C 'de 1 dakika ila 2 inkübe edin.
- tripsin ile muamele edilmiş hücrelere HEK293 büyüme ortamı 100 ul ilave edin ve tekrar süspansiyon hücreleri. 400 ul taze HEK293 büyüme ortamı zekâ içeren bir 24 plaka transfer içeriğih puromisin. 24 oyuklu bir plaka içerisinde her 5-7 gün kuyu% 90 konfluent ~ kadar HEK293 büyüme ortamı 250 ul değiştirerek hücreleri korumak.
6. Florimetrik Plaka Okuyucu Kullanılarak FRET Tepki dayanarak Aday CNiFERs tanımlayın
Not: Orijinal klon, birçok büyüme edemediklerinden bu dört adet 96-yuvalı plakalar FACS Aşağıdaki ile,> hayatta ve 24 oyuklu bir plaka aşamasına genişletme 100 test edilebilir klonlar olmalıdır. Potansiyel aday CNiFERs belirlemek için, aynı kökten gelen agonist, örneğin, D2R için dopamin ile FRET tepki için 3 noktalı analizini kullanın.
- hücreler, 24 oyuklu bir plaka içerisinde% 90 konfluent olduğunda, yavaşça ortam aspire. % 0.05 ~ 100 ul ekle (a / h) tripsin / EDTA ve% 5 (h / h) CO2 ile 37 ° C 'de 1-2 dakika inkübe edilir. tripsin ile muamele edilmiş hücrelere HEK293 büyüme ortamı 400 ul ilave edin ve dikkatlice toz haline getirilerek hücre karıştırın.
- clo ilk tarama için 3 noktalı agonisti eğrisi kurmaknes. Yani her CNiFER klonu için üç kuyu, örneğin, A1, A2, A3, ve her bir hücre süspansiyonu 100 ul (~ 4 x 10 3 hücre / oyuk) 24 oyuklu plaka, aliquot kuyuların bir fibronektin kaplı 96 oyuklu plaka (şeffaf tabanlı siyah) (adım 3.5).
- HEK293 büyüme ortamı 1000 ul (1.2 mL nihai hacim) ihtiva eden bir 12-çukurlu plaka hücre süspansiyonu ~ kalan 200 ul aktarın. % 90 konfluent ~ kadar,% 5 (h / h) CO2 ile 37 ° C 'de hem de inkübe edin. 96-çukurlu plaka flüorometrik tahlil için, 12-çukurlu plaka büyüyen ve genleşen klonlar içindir.
- 3-nokta analizi için, 0.1-, 1.0- agonist üç farklı konsantrasyonlarda ve belirli GPCR için 10-kat EC50 belirler. adımda 4.1.1-4.1.2 de tarif edildiği gibi, bir ilaç plaka agonist konsantrasyonları hazırlayın. adımda 4.1.3-4.1.5 de tarif edildiği gibi, bir florometrik plaka okuyucu deneyi gerçekleştirmek.
- FR hesaplayınAşama 4.1.6 tarif edildiği gibi ET oranı (Ír / R). geri donma uygun hassasiyet ve genişleme için büyük FRET cevap verirler CNiFERs, seçin ve daha kapsamlı analizler (adım 7).
- Aşama 6.5 seçildi ve 12 oyuklu bir plaka içerisinde büyüyen klonlar için çıkarın ve HEK293 büyüme ortamı her 5 ila 7 gün 600 ul yerine,% konfluent 90 ~ kadar.
- Yavaş yavaş 6 oyuklu plaka 12 oyuklu plaka klonları genişletme ve bir T25 kabına (2.3 adım - 2.6 ve Tablo 2). açıklandığı gibi T25 şişesi ~% 90 konfluent, hasat hücreleri olduğunda (2.3-2.5 adımlar). HEK293 büyüme ortamı, 5 ml hücre pelletini.
- HEK293 büyüme ortamı 9 ml T75 şişeye hücre süspansiyonu 1 ml ilave edilir. Sıvı N 2 (8.2-8.3 adım) olarak donmaya karşı koruma sağlamak ve depolama için hücre süspansiyonu kalan 4 ml kullanın. Sekiz 1.5 ml kriyotüplere hazırlayın ve buz üzerine yerleştirin.
- T75 şişede, medya w değiştirerek hücreleri korumaki taze HEK293 büyüme ortamı, örneğin,% 70-80 konfluent kadar 10 ml her 3-5 gün sonra ~ 1-2 hafta.
Florimetrik Plaka Okuyucu Kullanılarak CNiFER klonlarının 7. Son Seçim
- plaka okuyucu tahlil gün önce:
- A ~% 90 konfluent T75 şişesi Hasat hücreleri (Tablo 2 adım 2.3-2.6 bakınız). Iyi hücre süspansiyonu ~ 100 ul 5 x 10 4 / de, bir 96 gözlü fibronektin kaplı plaka (şeffaf tabanlı siyah) tohumu. Not: Bir klon, tek bir 96-yuvalı plaka içine dağıtılır.
- Spesifik olmayan CNiFER yanıtlardan özgü agonist yanıtları ayrım CNiFER klonların kapsamlı tarama için bir ilaç plaka hazırlanması.
- Tam doz-yanıt eğrisi oluşturmak için, tahmin edilen EC50 yaklaşık 10 Değişik agonist konsantrasyonları, tercih. 'Hayır hücreler' ve 'ACSF' için iki kuyu için iki kuyu kullanın.
- non-spesifik yanıtları belirlemek için, thr tercih12 farklı nörotransmitter veya modülatörlere (72 kuyu) (Şekil 3) ee konsantrasyonları. agonisti gibi, ilaç plaka iki kez 3 kat konsantrasyonları içerir. Örneğin, 100 50 3-kat fazla bir konsantredir, 1.000 asetilkolin, glutamat, oreksin, VIP, adenozin, serotonin, norepinefrin, GABA, madde P, melatonin, somatostatin ve histamin, her biri üç farklı konsantrasyonda ul, 3.000 nM 96 gözlü madde plaka yüklenir.
- adımda 4.1.3-4.1.5 tarif edildiği gibi çözelti transfer FRET ölçmek ve gerçekleştirmek için fluorometrik plaka okuyucusu üzerinde parametreleri ayarlayın.
- Tam doz yanıt eğrisi analizi için, pik FRET oranı (Ír / R) (adım 4.1.6), günlük agonist konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak arsa hesaplamak ve Hill denklemine (adım 11.4) ile uyum. EC 50 Hill katsayısı ve maksimal FRET oranını belirler. Bir işlev o kadar 12 diğer nörotransmitterlerin / modülatörler, arsa tepe Ír / R içinF ilaç konsantrasyonu.
- Diğer nörotransmiter agonistlerinin (non-spesifik yanıt) büyük bir FRET oranı, aynı kökten gelen agonist için uygun bir EC50 ve çok az veya hiç arka plan yanıtları var ~ 10 CNiFER klonlar seçin.
8. Freeze-geri Seçilmiş CNiFER Klonlar
- bağımsız bir CNiFER klonu olarak ~% 90 konfluent T75 şişesi kullanın. Açıklandığı gibi Hasat hücreleri (2.3-2.5 adımları, Tablo 2). hücreler dondurma için, HEK293 büyüme ortamı, 5 ml hücre pelletini. On 1.5 ml kriyotüplere Etiket ve buz üzerinde ayarlayın.
- Örneğin,% 20, 5 ml (h / h) DMSO / ortam karışımı, yavaşça hücre süspansiyonu, 5 ml (son ile karıştırılır% 20 HEK293 büyüme ortamı içinde (v / v) DMSO, 1: donmaya karşı koruma sağlamak için, hücreler 1 karışım DMSO konsantrasyonu), 10% 'dir.
- cryotubes her birine Kısım 1 ml. (Malzeme) bir köpük yalıtımlı kutuda, -80 ° C dondurucu O / N hücreleri ile tüpler dondurun. Aktarım LIQU için cryotubesUzun süreli depolama için kimliği azot.
Fare Cortex içine 9. CNiFER İmplantasyonu
- Ameliyat öncesi bir otoklav içinde tüm cerrahi aletler sterilize edin. % 70 etanol ile silerek ve temiz bir laboratuar bebek bezi ortaya koyarak ameliyat için yarı steril alan hazırlayın.
- dikey elektrot çektirmesi üzerine bir cam kılcal (0.53 mm id) çekerek CNiFER enjeksiyon pipet hazırlayın. Hiçbir bir çift kullanın. 5 ince uçlu forseps 40 mikron ~ bir çapa elektrot ucu kırmak için.
Not: Bu en iyi bir mercek ağı ile stereo zoom mikroskop altında gerçekleştirilir. - izofluran ile bir yetişkin (doğum sonrası gün 60-90), C57BL / 6 fare anestezi:% 4 (hacim / hacim) indüksiyon ve 1.5 ile 2.0% (hac / hac) bakım için. Fare tamamen uyuşturulduktan emin olmak için kuyruk veya ayak tutam kullanın.
Yeniden tutam periyodik ve anestezi derinliğini yeniden değerlendirmeye ameliyat boyunca bıyık seğirmesi değerlendirmek Not:. - p oftalmik merhem gözleri KapakRevent kurutma. kulak çubukları ile bir stereotaksik çerçeve fareyi bağlayın. rektal sonda ile düzenlenen bir ısı takımını kullanarak, 37 ° C'de fare vücut ısısını muhafaza edin.
- bir alan bir hayvan elektrikli tıraş makinesi ile 12 mm yaklaşık 5 mm Tıraş. Betadine% 70 (h / h), izopropanol ve ardından uygulayın. kesme ve kafatası yüzeyi üzerinde cilt kaldırmak için bir neşter bıçak kullanın. Kafatası yüzeyinden periost kaldırmak için bir neşter bıçak kullanın. Açığa ve stereotaksik cerrahi 11 için tarif edildiği gibi, kafa yüzeyini temizlemek.
- bregma ve antero-posterior (A / P) ve medio-yanal (M / L) kaydetmek için boş bir cam pipet indirin koordine eder. fare beyin atlasına değinen enjeksiyon konumunu hesaplar. hedef siteye pipetlemeyin Shift ve sonraki pencere oluşumu için kafatası işaretleyin. Çetin ve ark bakın. Kemirgenler 11 stereotaksik enjeksiyonları ile ilgili ayrıntılar için.
Not: Enjeksiyon ve pencerenin yer reg bağlıdıriyonu okudu ve kortekste nörotransmiter veya peptit salan projeksiyonlar dağıtımı için. Örneğin, yeni bir yayın 7, stereotaksik +1,0 +2.0 mm A / P ve +1,0 +2.0 mm M / L klasik koşullama sırasında dopamin salımının in vivo görüntüleme için frontal korteks içine CNiFER hücreleri enjekte etmek için kullanıldı koordinatları . - Daha önce 12,13 açıklandığı gibi 2 mm x 3 mm inceltilmiş-kafatası penceresi oluşturur.
Not: Pencerenin kemik 15-20 mikron kalınlığında olmalıdır. Kemik yeterince 12,13 inceltilerek ise kafatası yüzeyi ıslandığında kemikte küçük beyaz lekeler görünür olmamalıdır. - enjekte hücreleri hazırlarken nemli tutmak için pencere süngeri batırılmış bir ACSF yerleştirin.
- T75 balona ~% 80 confluency yetiştirilen edildi CNiFER klon hasat. medya aspire ve steril PBS ile hücreleri yıkayın.
Not: Tripsin bu adımlar için atlandı. - o PBS kaldırmak ve 10 ml kullanınF ACSF şişenin tabanından hücreleri çıkarmak için. Çiğnemek hücreler, hücre kümeleri ayırmak için. Santrifüj ACSF 100 ul pelletini ve. ACSF kaplı bir pelet bırakarak, 1400 xg'de 30 saniye boyunca santrifüj ve süpernatant kaldırmak. Bu adım, süspansiyon içinde hücrelerin bir yığın bırakır.
- Mineral yağ ile adım 9.2 hazırlanan enjeksiyon pipetlemeyin Dolgu bir nanoinjector üzerine pipeti yük ve yağ küçük bir boncuk çıkarmak için pistonu ilerlemek. Fare hazırlanması yakınındaki plastik parafın filmin bir şerit üzerine CNiFER hücre süspansiyonu 5 ul koyun. ya CNiFERs hazırlayın veya çekti pipet içine CNiFER hücreleri kontrol.
- Hedef X pipet hareket ettirin ve Y koordinatları, yani A / P ve M / L adım 9.5 belirtti. inceltilmiş kafatası delici, pipet indirin ve ~ kafatası yüzeyinin altında 200-400 mikron, katmanların korteksin 2/3 CNiFER hücrelerini yatırmak için devam ediyor.
- nanoinjec olan en derin yerinde ~ CNiFER hücrelerinin 4.6 NL enjektetor, not yağı ve hücre arayüzü hareket ve ardından hücreler dağıtmak için 5 dakika bekleyin. ~ 100 um pipet çekiniz ve CNiFER hücrelerinin başka ~ 4.6 nl enjekte 5 dakika bekleyin. Daha sonra CNiFERs geri akmasını önlemek için yavaş ve nazikçe pipet çekin. bir veya daha fazla komşu bölgelerde enjeksiyon tekrarlayın.
- Tekrarlama enjeksiyon kontrol HEK293 hücreleri (yani, HEK293 / TN-XXL / G qi5 eksik klon GPCR) ile 9,8-9,12 adımları. CNiFER ayırın ve ~ 200 mikron hücre enjeksiyonu sitelerini kontrol.
- Hücre implantasyonu tamamladıktan sonra, ACSF ile inceltilerek kafatası penceresi durulayın ve kafatası kurumasını bekleyin. Pencere üzerinde siyanoakrilat yapıştırıcı bir damla (Malzeme bakınız) uygulayın ve hızlı bir şekilde tutkal üstüne önceden kesilmiş steril cam kapak yerleştirin. Yavaşça birkaç saniye kafatası karşı cam kapak itin. 2 dakika 12,13 için tutkal kurumasını bekleyin.
- diş çimento ve form aw ile kapak cam kenarları mühürpencerenin etrafında ell daldırma hedefi için su tutmaya.
- Görüntüleme sırasında farenin kafasını hareketsiz tutmak için, (boyut ve malzeme hakkında ayrıntılı bilgi için 14 bakınız) pencerenin arkasında siyanoakrilat yapıştırıcı küçük bir damla ile bir özel yapım kafa-bar ekleyin. tutkal iyice kurumasını ve daha sonra özel olarak oluşturulmuş bir kafa bar güçlendirmek için ek diş çimento ekleyelim.
- diş çimento tabakası ile pencere dışında kafa yüzeyinin geri kalanı, kapsamaktadır. derinin kenarları çimento ile kaplıdır emin olun ve 20 dakika boyunca kurumaya bırakın.
- Ameliyatı takiben, izofluran yönetimini durdurmak ve tamamen anestezi kurtarır kadar bir kafes içinde bir ısıtma pedi üzerinde fareyi bırakın. ameliyat sonrası analjezi için 5 rehidrasyon için% tuz (SC) (ağ / hac) glikoz ve 0,05 ile 0,1 mg / kg buprenorfin (ip, anında salım) enjekte edilir.
Insan CNiFERs potansiyel immünolojik reaksiyonu en aza indirmek için 20 ul / 100 g siklo günlük fare enjekte Not:sporine (ip) CNiFERs enjeksiyonundan önce günden başlayarak. - Gıda ve su için evde kafes fare dönün.
CNiFER Klonların İn vivo 10.
Not: Canlı görüntüleme iki foton mikroskop ve bir baş-sabit bir aparat kullanılarak fareler ile yapılmaktadır. Anestezi görüntüleme oturumları sırasında ihtiyaç vardır. uyanık halde hayvanlar görüntüleme yaparken, stres seviyesini azaltmak için bir seferde sadece birkaç saat baş desteğini sınırlamak. Gıda ve su için kendisine görüntüleme oturumları arasında ev kafes hayvan dönün. Potansiyel stres bir muhafaza içinde fare parçası oda ışıkları karartma ve çevredeki minimize edilir.
- Ameliyat sonrası gününde, baş-sabitleme çerçevesi kafatası üzerinde implante metal kafa-bar vidalanarak bir görüntüleme platformu üzerinde fareyi monte edin.
Not: uyanık fareler görüntüleme yaparken, görüntü oturumu nedeniyle kafa tutma cihazı tarafından uyarılan potansiyel strese birkaç saat geçmemelidir. - Bir 10X (0.30 NA) ve 40X (0.80 NA) suya daldırma hedefleri ile donatılmış bir iki foton görüntüleme mikroskop kafa ölçülü fare ile görüntüleme platformu yerleştirin.
- 460 nm Citrine ölçmek için nm 560 nm ölçüm eCFP için ila 500 nm ve 520 yayılan 505 nm ve bant geçiren filtreler bir dikroik ayna vardır FRET görüntüleme (eCFP ve Citrine) için filtre küp yerleştirin.
- iyi içeren inceltilmiş-kafatası penceresine ACSF ekleyin ve ACSF içine suya daldırma hedefi indirin. pencerenin altındaki korteks ve damarsal yüzeyini bulmak için cıva lambası ve GFP filtre küp ile birlikte mercek kullanın.
Not: damarsal deseni görüntüleme tekrarlanan gün içinde görüntüyü aynı bölgeyi bulmak ve yardımcı olur. elle GFP filtre küp ve cıva buharlı ampul kullanılarak hücreleri üzerinde korteksin yüzeyi üzerine odaklanarak CNiFERs bulmak için 40X suya daldırma hedefi geçin. - iki foton görüntüleme için ayarlayın. ap seçiniki foton görüntüleme için propriate ışık yolu. tipik bir ticari sistem için iki foton görüntüleme moduna olmayan descanned dedektörleri de photomultiplier tüpleri (Proje Yönetim Ekipleri) ışığı yönlendirmek için yazılımı kullanın. , Yakın kızılötesi femtosaniye darbeli lazer açma 820 nm dalga boyu ve% 5-15 güç ayarı seçin. Not:% 5 güç tipik numune olarak ~ 25 mW sağlar.
- maksimum değere yakın PMT1 & PMT2 gerilim, PMT bağlı tipik 700-1,000 V ayarlayın. Her kanal için 1 kazanç ayarlama ve hedefi için z konumunu sıfır.
- ~ Kortikal yüzeyinden 100 ila 200 mikron hedefi indirin ve xy taramayı başlatın. CNiFER floresan bir sinyal-gürültü oranını optimize etmek için, lazer gücü, kazanç ve her bir kanal için PMT gerilimi, örneğin, eCFP ve sitrin ayarlayın.
- Bir backgroun yanı sıra CNiFER hücreleri içeren bir bölgeye görüntü kısıtlamak için yazılımdaki yakınlaştırma özelliğini kullanınd bölgesi. piksel başına 4 us bir kare her 2 sn (0,5 Hz) daha yavaş bir tarama hızı kullanın. Uygun sinyal-gürültü oranı, örneğin, Kalman 2 satır ortalama için ortalama çizgi ayarlayın.
- Düzlem başına yaklaşık 3 ila 4 hücreleri çevreleyen bir bölge-faiz CNiFER hücrelerin etrafındaki dönüşünü (ROI) çizin. ROI ortalama yoğunlukları kurmak gerçek zamanlı analiz. zamanla CNiFER floresan izlemek için satın başlatın.
- Önce ve deneysel manipülasyonlar, örneğin, kullanıcı tarafından belirlenen elektrik stimülasyonu, ChR2 uyarılması davranışı sırasında CNiFERs floresans toplayın.
- görüntüleme deney tamamlandığında, evde kafes fare dönün. istediğiniz gibi, gün boyunca görüntüleme tekrarlayın. Ne zaman hücreler aynı görüntüleme alanının (adım 10.4) geri yönlendirmek için daha önceden edinilmiş düşük büyütme damar resme bakın tekrar görüntüleme.
Not: İmplante CNiFERs en az 7 gün boyunca görüntülenebilir.
11. Veri Analizi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Belirli bir G-proteinine bağlanmış reseptör (GPCR) ile genetik olarak kodlanmış [Ca2 +] sensör, TN-XXL A CNiFER kararlı bir şekilde en az iki protein eksprese etmek üzere bir insan embriyonik böbrek (HEK293), hücre elde edilir. TN-XXL Ca2 + iyonlarının 6,15 yanıt olarak kırmızı ve sarı floresan proteinleri sırasıyla eCFP ve sitrin, arasındaki flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) maruz kalır. Endojen G S, G proteinlerine bu birkaç GPCR aktivasyonu [Ca2 +], PLC / IP 3 yolu ile, TNXXL Ca 2 + detektörden FRET bir artışa yol açar (Şekil 1) sitosolik bir artış tetikler.
Şekil 1:. Gelişmekte CNiFERs için Şema Üst, GPCR-Ca 2 + bir oluşturmak için gerekli sinyal yoluCNiFER hücresi. Alt, HEK293 hücreleri kullanarak CNiFERs oluşturmak için temel adımlar. 1. transduce genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı Ca 2 + -detector (TN-XXL) ile adım. Aşama 2. yani transdüksiyonu Gα G-proteini kimera, G qs5 G qi5 gerekirse. CNiFER oluşturmak için 3. transduce benzersiz GPCR Adım. İki foton uyarma ışığı (kırmızı) bir eCFP emisyonunu (mavi) ve Sitrin emisyon (sarı), hem üreten, FRET uğrar eCFP, heyecanlandırıyor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
FRET artış nörotransmiter düzeylerinde hızlı bir değişim optik okuma-out sağlar. nörotransmitter belirli bir türü için CNiFER geliştirmek için öncelikle G proteininin türünü belirlemek olduğunu GPCR için çiftler. G S GPCR'ler -coupled için GPCR, endojen olarak ifade G Q proteinleri kullananHEK293 hücreleri. G i / o -coupled GPCRs, klonal HEK293 hattı ilk G q PLC / IP 3 yoluna GPCR yönlendirir bir kimerik G proteini ifade eden oluşturulur. Bu öncelikle Gα Q sekansı ve g'nin karboksil terminaline beş amino asidini içeren bir kimerik protein G, G qi5 ile gerçekleştirilir. G qi5 G i / o -coupled GPCRs ile iletişim, ancak G q yolu boyunca sinyal için bu beş amino asitler yeterlidir. G s -coupled GPCRs için, G qs5 chimera 10 kullanılır. Bir CNiFER üretmek için genel bir strateji için: 1), 2) sabit bir şekilde, bir G-protein Chimera ifade eden HEK hücrelerinin lentivirüs transdüksiyonunu kullanarak stabil optik Ca 2 + detektör eksprese olan bir klonal HEK 293 hücre, örneğin, TN-XXL oluşturmak gerekirse, HEK293 hücre klonu TN-XXL ifade ve 3) HEK293 hücre içinde stabil şekilde eksprese eden GPCR klonu yaratmak bölgesindekiTN-XXL ve kimerik G proteini ifade eden klon. TN-XXL ve kimerik G proteini GPCR yoksun ama vardır klonal HEK293 hattı 'kontrol CNiFER' olarak hizmet vermektedir. Kontrol CNiFER CNiFER yanıtı özellikle örneğin, D2R, olup, endojen HEK293 hücrelerinde ifade için diğer reseptörlerinin aktivasyonu için tasarlanmış reseptörlerin aktivasyonuna bağlı olduğu teyit etmek için gereklidir.
Lentivirüs oluşturmak için bir Lentivector sentezleme sistemi kullanılır, örneğin, bir hedefin ambalaj, transdüksiyon, virüs ifade kararlı entegrasyonu genomik DNA oluşturmak ve ekspresyon için sorumlu genetik öğeleri içeren pCDH CMV-MCS-EF1-Puro, gen dizisi. Viral parçacıklar, ifade ve paketleme vektörler yüksek titresi üretmek için geçici Üretici memeli hücrelerine transfekte CO ve virüs toplanır. yüksek ti oluşturabilir ABD'de çeşitli viral çekirdek tesisleri bulunmaktadır ter lentivirüs. HEK293 hücrelerinin enfeksiyonu takiben, Puro geni kalıt HEK293 hücrelerinin belirlenmesi için, antibiyotik direnç sağlar.
Belirli bir klonal çizgileri belirlemek için, HEK293 hücreleri bir floresan aktive hücre sınıflandırma (FACS) sistemi kullanılarak sıralanır kalıt. Amacı, FRET göre Ca2 + detektörün yüksek ekspresyon seviyesi ve FRET geçiren yeteneği içeren bir klon izole etmektir. FACS analizi Bu örnekte, eCFP emisyon flüoresan sinyal FRET (eCFP uyarılma ve sitrin emisyon) karşısına yerleştirilmiştir. Kutular daha sonra 96 oyuklu plakalara (Şekil 2) sıralama için ( "kapı") seçilecektir bölgeleri (P2 ve P3) işaret eder. Genel olarak, yaklaşık dört adet 96 oyuklu plakalar CNiFERs başarıyla oluşturulması taranması için yeterlidir. Bu 4 plakalarından yaklaşık 100 klon florometrik plaka okuyucu analizi için uygundur.
1 ">:" keep-together.within sayfa = fo "e_content
Şekil 2: FACS analiziyle Örnek FACS analizi aşağıdaki çıktı örneği.. Sitrin emisyon bir fonksiyonu olarak grafiği, eCFP emisyonu ( "475/20-A") ( "FRET V 530/30-A"), her bir hücre için eCFP uyarma kullanılarak. Bölgeler P2 ve P3 gösteri alanları tek tek hücrelerin içine sıralama için, kapı, yani seçilmiş. Renkler keyfi vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
kriteri hücreler yeterli yoğunluğa büyüdü sonra agonist aktivasyonu takiben FRET yanıtı çözeltisi kullanımı ile donatılmış bir 96 gözlü florometrik plaka okuyucu sistemi kullanılarak belirlenir. incelemek için klonların sayısını daraltmak için, bir "3 noktalı" agonist eğrisi taramak için kullanılır ~En iyi yanıtları 100 klon seçin CNiFERs. 12, diğer nörotransmiterler ya da modülatörleri ile problandı spesifik olmayan tepkiler, yaklaşık 10 klonu daha sonra aynı kökenli agonist tam doz-cevap belirlenmesi ile daha fazla analiz ve. Ilaçlar (örneğin, agonistler, antagonistler, vb) ACSF: 96 oyuklu bir ilaç plakası (levhası 3 nihai konsantrasyon 1 seyreltilmiştir) üç kat konsantrasyon olarak hazırlanır. Bu örnekte, ilaç levhası diğer nörotransmitter ve peptit agonistlerinin çeşitli kognat agonist dopamin ve potansiyel spesifik olmayan tepkiler (Şekil 3) sahip bir D2 CNiFER test etmek için ayarlanır. GPCR yoksun omurga CNiFER, yeni oluşturulan CNiFER için önemli bir kontrol olarak hizmet vermektedir.
Şekil 3:. 96-iyi Tabaklar için Düzen örnekleri Üst, Layou tablosu, Florometrik plaka okuyucu için 3x ilaç plaka yükleme çeşitli nörotransmitterlerin ve peptidler üç kat konsantrasyonları kullanılarak t. Alt, şeffaf plastik 96-kuyu ilaç plaka ve CNiFERs tohumlama ve plaka okuyucuda ölçmek için siyah 96-plaka örnekleri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
GPCR uyarılması TN-XXL hücre içi [Ca2 +] ve saptama bir yüksekliği bir sonucu olarak, FRET yanıt artması beklenmektedir. Bu koşullar altında, FRET eCFP bu uyarım, bir küçük eCFP emisyonu ve daha büyük sitrin emisyon üretir, böylece eCFP ve sitrin, yakın hareket ile üretilir. Bu örnekte, uyarma 436 nm ve emisyon filtreleri ayarlanır eCFP için 485 ± 7.5 nm ve Citrine için 527 ± 7.5 nm (Şekil 4) olarak ayarlanır. ba Otuz saniyeSeline floresan ölçülür ve ACSF plakasında "üç kat" agonistten daha sonra 50 | il her bir ihtiva eden 100 ul ACSF teslim edilir (1: 3 seyrelti). eCFP ve Citrine emisyon floresan 180 saniye boyunca her 3.8 saniyede bir ölçülür. Arka plan ölçümleri hücreleri olmadan çukurlardan alınmış ve gerektiğinde, çıkartılır. Floresan yoğunluğu normalize önceden uyaran taban (f (t) / F (taban çizgisi)), ve pik tepkileri 527 FRET oranı (Ír / R) f (t) ile / F (taban çizgisi) hesaplamak için ölçülür nm ve 485 nm kanalları (Denklem 1). Bir doz-yanıt eğrisi Değişik agonist konsantrasyonları, bir fonksiyonu olarak, FRET oranı çizimini ve EC50 ve Hill katsayısı (Şekil 5) (Denklem 2) belirlemek için Hill denklemine ile uyum oluşturulur. Optimum bir CNiFER büyük FRET oranı ve aynı kökenli agonisti için uygun bir EC50 sergileyen ve diğer neurotransmit az olan veya hiç olmayan bir yanıt gösterenter agonistleridir. Bunun tersine, kontrol CNiFER aynı kökenli agonist az tepki göstermelidir.
Şekil 4:. Bir çözeltisi dağıtım sistemine sahip bir levha okuyucu üzerinde ölçüldü agonist kaynaklı FRET Tepki D2R CNiFER FRET cevap örneği. D2 CNiFERs (A), dopamin (kırmızı bar) uygulanması sırasında FRET yanıtının bir taslağıdır, yani eCFP ve sitrin emisyonu eCFP uyarım. Bu eCFP emisyon azalır Not agonist (dopamin) ile Citrine emisyon artarken. (B) Muller ve ark. Değiştirilmiş (A) Şekil yanıt FRET oranı (Denklem 1) bir arsa 2014 7. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5:. D2 CNiFER için doz tepki eğrileri, örnek olarak (A) (yeşil NE) dopamine D2 CNiFERs cevabı (DA, siyah) ve norepinefrin için tepki eğrileri doz. Buna ek olarak, D2R eksik "kontrol" CNiFERs tepki gösterilir. (B) bar grafiği 50 nM ve 1 uM diğer nörotransmitterlerin ve düzenleyicilerin için FRET oranı tepkisini gösterir. Değerler ± SEM. Muller ve ark., 2014 7 değiştirilmiş bir rakam. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
CNiFER klonlar sunum ayrımcılık, başka olası reseptör bağımlı duyarsızlaştırma ve onların temporal çözünürlük için değerlendirilebilirİki farklı agonist darbelerinin (ayrıntılar için, bakınız Muller ve ark. 2014 7). Bir CNiFER klonu inşa sonra, bir sonraki adım in vivo fonksiyonunu test etmektir. In vivo olarak floresans izleme için, bir iki-fotonlu mikroskop kullanmak gereklidir. Bir inceltilmiş-kafatası penceresi hazırladıktan sonra, CNiFERs bir cam pipet yüklenir ve katmanlar korteksin 2/3 enjekte. Fare daha sonra (Şekil 6), inceltilmiş kafatası bir cam kapak kayma eklenir ve görüntüleme sırasında kafa sabitleme için bir baş çubuğu implante in vivo görüntüleme için hazırlanır.
Implante CNiFERs in vivo uygulanabilir olduğunu belirlemek için, agonist bilinen konsantrasyonlarda implantasyon yerine yakın enjekte edilebilir ve FRET oranı 7 tespit edilmiştir. ayrıca implante CNiFERs aktivitesini doğrulamak için, giriş nöronlar uyarıcı muayene edilmelidir. D2 CNiFER, etkisiyle Örneğin,kortekse proje orta beyin dopamin nöronlarının elektrik stimülasyonu incelenmiştir. 500 um bir uç ayırma ile elektrot uyarıcı 0,1 MQ tungsten çift kutuplu (-3.2 mm A / P, 1.3 mm / D, -4.4 mm D / h). Şekil 6, substantia nigra implante elektriksel bir örneğini göstermektedir edildi farklı yoğunluklarda substantia nigra uyarıcı ve D2 CNiFERs 7 FRET oranında bir artış gözlenmesi. Bir D2 reseptör antagonisti, eticlopride (1 mg / kg), bloklar D2 CNiFER tepkisinin sistemik içi, periton içinden (ip) enjeksiyonu edin. Dopamin yeniden alım blok, elektriksel olarak uyarılmış D2 CNiFER yanıtı 7 arttıran diğer yandan, kokain enjeksiyonu (15 mg / kg), üzerinde.
Şekil 6: D2 CNiFER Tepki I Örneği
ftp_upload / 53290 / 53290table1.jpg "/>
Tablo 1: HEK293 büyüme ortamı ve ACSF yapmak için kimyasallar ve reaktifler listesi.
Tablo 2: Farklı Boyut Kültür Tabaklar veya şişeler Gönderen Hasat Hücreler için Birimleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CNiFERs yaratılması optik in vivo beyinde nörotransmitterlerin salınımını ölçmek için yenilikçi ve benzersiz bir strateji sağlar. CNiFERs ideal nörotransmitterlerin için yani extrasynaptic açıklaması, hacim iletimi, ölçmek için uygundur. Önemli olarak, her bir CNiFER beyinde nörotransmitter seviyelerindeki değişikliklerin fizyolojik optik ölçüm sağlayan doğal GPCR özelliklerine sahiptir. Bugüne kadar, CNiFERs asetilkolin tespit etmek için oluşturulmuştur (M + -1-CNiFER) 6, dopamin (D2 CNiFER) 7 ve norepinefrin (α1a-CNiFER) 7.
Prensip olarak, bir CNiFER bir GPCR aracılığıyla sinyal bir nörotransmitter oluşturulabilir. G Q G proteinleri yoluyla GPCR sinyalleri, başka bir modifikasyon HEK293 hücre için gerekli olan durum için. G üzerinden sinyal GPCR'ler I / O, ancak, bir G qi5 kimerik G proteininin yakımının birlikte gerektirirçift G q / PLC yolu 7,10 için GPCR. Benzer şekilde, G s aracılığıyla sinyal GPCRs bir kimerik G qs5 G proteini 10 yakımının birlikte gerektirecektir. Tamamlandıktan sonra, her CNiFER klon tarandı ve nativ reseptörüne benzer bir afiniteye sahip yalnızca CNiFER klonlar, çok az veya hiç desensitizasyonu gösteren ve in vivo olarak iki foton mikroskobu ile ölçülmesi için yeterli olan bir sinyal-noyz oranının temin edilmesi, in vivo çalışmalar için seçilir.
In vivo araştırmalar için, son derece potansiyel immünolojik tepkiyi minimize etmek için siklosporin farelere tedavisi için önerilir. rejeksiyon ihtimali ya da kemirgen beyin içine, insan CNiFER hücreleri implante bir immünolojik yanıtı vardır. Bu CNiFER implantasyondan sonra, GFAP ve mac1 7 ekspresyonunu incelenerek daha önce araştırılmıştır. CNiFERs glial izleri üretmek için görünür ya da herhangi bir signi üretmek vermedilerinin ise MAC1 7 boyama.
CNiFERs inşasında dikkate alınması gereken iki önemli sorunları duyarlılık ve duyarsızlaştırma vardır. EC50 nativ reseptörüne göre, yani, düşük afiniteli, çok yüksek ise, o zaman CNiFER in vivo olarak, nörotransmiterin salınışı tespit etmek için yeterli duyarlılığa sahip olabilir. Bir çözüm klonlar yeniden taranması ve daha yüksek afiniteye sahip başka bir CNiFER klonu seçmek. Alternatif bir diğer strateji GPCR aktivasyonu için EC50 kayabilir daha yüksek Ca + 2 hassas olabilir genetik olarak kodlanmış floresan Ca2 + detektörler, diğer türde test etmek olacaktır. CNiFER tasarım modüler olduğu için, kolayca GCaMP 16 gibi genetik olarak kodlanmış Ca2 + detektörler, diğer tip uyarlanmıştır. Aynı reseptör ancak farklı EC 50 s CNiFER klonlar Yalıtımlı endojen neu tespit sürümü dinamik aralığını genişletmek için avantajlı olabilirin vivo rotransmitters.
CNiFER duyarsızlaştırma de in vivo kullanımını sınırlar. pik cevabı giderek agonist her darbe ile azalırsa, o zaman reseptör desensitizing olabilir. Bu durumda, diğer klonlar incelemek ve aynı şekilde yanıt olmadığını belirlemek. reseptör amino asit dizisi ya da bir başka reseptör alt-tipinin kullanımına değişiklikler agonistinin bağımlı duyarsızlaştırma gidermek için gerekli olabilir. G-protein reseptör kinazları (GRKs) o yardımcı fosforilasyon ya da amino asitlerin sitesi vardır tanımlanmış bilinen durumunda, bir ya da daha fazla site mutasyona GPCR olmayan bir hassasiyet giderici varyantı oluşturmak için tavsiye edilmektedir. duyarsızlaştırma mekanizması bir vaka ile ayrı ayrı her bir reseptör için tespit edilmelidir.
Şimdiye kadar, CNiFERs sadece iki foton mi ile görüntüleme fluorophores sınırlamaları Spektroskopik, korteks 6,7 yüzeysel katmanlarına nedeniyle implante edilmiş17,18 croscopy. Gelecekte, CNiFERs altkortikal beyin bölgelerinde implante edilebilir, böylece floresan 19 elyaf bazlı ölçümlerle CNiFER teknolojiye uyum mümkün olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz elektronik ile ilgili yardım için G qi5 ve G qs5 cDNA'ları, A. Schweitzer sağlamak için B. Conklin (University of California, San Francisco) teşekkür ederim, N. Taylor geçirmez okuma klonlar, Ian Glaaser ve Robert Rifkin tarama ile yardım için ve TN-XXL Olivier Griesbeck. (; DA037170 DA029706), Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik Ulusal Enstitüsü (NIBIB) (EB003832), Hoffman-La Roche (88610A) ve "Neuroscience Bu çalışma Uyuşturucu ABD Ulusal Enstitüsü (NIDA) aracılığıyla araştırma hibeleri tarafından desteklenen NIDA (DA007315) üzerinden Kötüye "eğitim hibe Uyuşturucu ile İlgili.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro | System Biosciences | CD510B-1 | Cloning: for generating lentivirus |
| 12 x 75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube | BD Biosciences | 352063 | FACS |
| BD 40 um Falcon cell strainers | BD Biosciences | 352340 | FACS |
| 0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200056 | FACS |
| 96 Well Plate, flat bottom, clear | Corning | 3596 | FACS |
| 96 well cell culture plates | Corning | CLS3997 | Flexstation |
| Optilux black clear bottom | Corning | 3603 | Flexstation |
| Flexstation pipet tips | Molecular Devices | 9000-0911 | Flexstation |
| Acetylcholine Chloride | Sigma-Aldrich | A2661 | Flexstation |
| Norepinephrine | Sigma-Aldrich | A7256 | Flexstation |
| Dopamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | PHR1090 | Flexstation |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | Flexstation |
| Histamine | Sigma-Aldrich | H7125 | Flexstation |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | Flexstation |
| Epinephrine | Sigma-Aldrich | E4642 | Flexstation |
| Somatostatin | Sigma-Aldrich | S1763 | Flexstation |
| 5HT | Sigma-Aldrich | H9523 | Flexstation |
| VIP | Alpha Diagnostics Inc. | SP-69627 | Flexstation |
| Orexin A | Alpha Diagnostics Inc. | 12-p-01 | Flexstation |
| Substance P | Sigma-Aldrich | S6883 | Flexstation |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Flexstation |
| Melatonin | Sigma-Aldrich | M5250C | Flexstation |
| Fluorescence Plate Reader & software | Molecular Devices | Flexstation 3 | Flexstation |
| DMEM (high glucose) with Glutamax | Life Technologies | 10569-010 | Tissue culture |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-139 | Tissue culture |
| Pen/Strep antibiotics | Life Technologies | 15140-122 | Tissue culture |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr-1 | Tissue culture |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Tissue culture |
| CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box | Bioexpress | D-3508) | Tissue culture |
| cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite no. 495 | surgery and stereotaxic injection |
| plastic paraffin film | VWR | Parafilm® | surgery and stereotaxic injection |
| Nanoinjector | Drummond | 3-000-204 | surgery and stereotaxic injection |
| Glass electrodes | Drummond | 3-000-203G | surgery and stereotaxic injection |
| hand held drill | OSADA | Exl-M40 | surgery and stereotaxic injection |
| Burrs for drill | Fine Scientific | 19007-05; 19007-07) | surgery and stereotaxic injection |
| Sterilizing bath | FST | 18000-45, Hot Bead Sterilizer | surgery and stereotaxic injection |
| isoflurane chamber/mask | Highland Medical Equipment | 564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm | surgery and stereotaxic injection |
| 3D scope with arm | Zeiss | surgery and stereotaxic injection | |
| fiber optic light | surgery and stereotaxic injection | ||
| Betadine | surgery and stereotaxic injection | ||
| 70 % (v/v) isopropyl alcohol | surgery and stereotaxic injection | ||
| Povidone-Iodine Prep Pads | dynarex | 1108 | surgery and stereotaxic injection |
| NaCl 0.9% (injection, USP, 918610) | surgery and stereotaxic injection | ||
| CYCLOSPORINE (INJECTION, USP) | surgery and stereotaxic injection | ||
| Buprenex (injection) buprenorphine (0.03 μg per g rodent) | Sigma-Aldrich | surgery and stereotaxic injection | |
| Ophthalmic ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | surgery and stereotaxic injection |
| Surgifoam | Ethicon | surgery and stereotaxic injection | |
| Grip dental cement | Dentsply | #675571, 675572 | surgery and stereotaxic injection |
| Instant SuperGlue | NDindustries | surgery and stereotaxic injection | |
| LOCTITE 4041 | surgery and stereotaxic injection | ||
| METABOND | C&B | surgery and stereotaxic injection | |
| no. 0 cover glass | Fisher | surgery and stereotaxic injection | |
| stereotaxic frame | Kopf | surgery and stereotaxic injection | |
| Rectal probe and heating pad | FHC | 40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe | surgery and stereotaxic injection |
| optical breadboard for imaging | Thorlabs | surgery and stereotaxic injection | |
| Mineral oil | Fisher | S55667 | surgery and stereotaxic injection |
| Kwik-Cast (Silicone elastomer) | World Precision Instruments | surgery and stereotaxic injection | |
| Suture | Ethicon | 18’’, 1667, 4-0 | surgery and stereotaxic injection |
| Scissors | Fine Scientific Tools | 91500-09, 15018-10 | surgery and stereotaxic injection |
| Forcepts | Fine Scientific Tools | 11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10 | surgery and stereotaxic injection |
| Student Halsted-Mosquito Hemostats | Fine Scientific Tools | 91308-12 | surgery and stereotaxic injection |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Scientific Tools | 18000-00 | surgery and stereotaxic injection |
| Hot Bead Sterilizers | Fine Scientific Tools | 18000-45 | surgery and stereotaxic injection |
| Instrument Case with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20311-21 | surgery and stereotaxic injection |
| Plastic Sterilization Containers with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20810-01 | surgery and stereotaxic injection |
| 2P fixed-stage fluorescence scope for in vivo imaging | Olympus | FV1200 MPE | in vivo imaging |
| Multiphoton laser | SpectraPhysics | Mai Tai DeepSee | in vivo imaging |
| Green Laser | Olympus | 473 nm Laser | in vivo imaging |
| xy translational base | Scientifica | MMBP | in vivo imaging |
| FRET filter cube for YFP and CFP | Olympus | in vivo imaging | |
| 10x and 40x water immersion objectives | Olympus | in vivo imaging | |
| air table | Newport | in vivo imaging | |
| custom built light-tight cage | Thorlab | in vivo imaging |
References
- Day, J. C., Kornecook, T. J., Quirion, R. Application of in vivo. microdialysis to the study of cholinergic systems. Methods. 23, 21-39 (2001).
- Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo. Clin Chem. 49, 1763-1773 (2003).
- Liang, R., Broussard, G. J., Tian, L. Imaging Chemical Neurotransmission with Genetically Encoded Fluorescent Sensors. ACS Chem Neurosci. , (2015).
- Okubo, Y., et al. Imaging extrasynaptic glutamate dynamics in the brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 6526-6531 (2010).
- Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10, 162-170 (2013).
- Nguyen, Q. T., et al. An in vivo biosensor for neurotransmitter release and in situ receptor activity. Nat Neurosci. 13, 127-132 (2010).
- Muller, A., Joseph, V., Slesinger, P. A., Kleinfeld, D. Cell-based reporters reveal in vivo dynamics of dopamine and norepinephrine release in murine cortex. Nat Methods. 11, 1245-1252 (2014).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. , e3998 (2012).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. , (2009).
- Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Gjα. Nature. 363, 274-276 (1993).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1, 3166-3173 (2006).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. , (2012).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nat Methods. 7, 981-984 (2010).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1277-1309 (2012).
- Yamauchi, J. G., et al. Characterizing ligand-gated ion channel receptors with genetically encoded Ca2+ sensors. PLoS One. 6, e16519 (2011).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Cui, G., et al. Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation. Nature. 494, 238-242 (2013).
