Introduction
A conduta de acesso vascular funcional é de vital importância para os pacientes com insuficiência renal que dependem de hemodiálise crônica para se manter vivo. A construção de uma fístula arteriovenosa (FAV) é atualmente a escolha preferida para acesso vascular. No entanto, as complicações relacionadas AVF constituem uma das principais causas de morbidade para pacientes em hemodiálise crónica. Apesar das extensas esforços científicos, nenhuma das novas abordagens para reduzir as complicações relacionadas ao acesso FAV resultou em melhoria substancial da AVF durabilidade. Parte deste progresso decepcionante diz respeito a compreensão incompleta da fisiopatologia subjacente da falha de acesso de hemodiálise.
Para desvendar a fisiopatologia da insuficiência de acesso AV, modelos animais que imitam de perto patologia humana são de extrema importância. A este respeito, não só as espécies animais, mas também o local da anastomose, a terapia anti-coagulante necessária e a duração do acompanhamento após surtoRY deve ser tomado em consideração um. Enquanto animais de grande porte são os mais adequados para estudos de intervenção destinadas a desenvolver novas estratégias terapêuticas, modelos murinos têm o maior potencial para ter mais conhecimento dos mecanismos moleculares subjacentes falha de acesso AV, devido à disponibilidade de ratinhos transgénicos. Além disso, um grande número de ratinhos podem ser utilizados para este fim a custos mais baixos em comparação com o uso de animais maiores.
O primeiro modelo murino de falha FAV foi descrita em 2004 por kwei e et ai. 2 Neste modelo, FAVs foram construídos utilizando a artéria carótida e a veia jugular de uma maneira extremo-a-extremidade utilizando um cateter intravascular. Este modelo pode ser útil para estudar a adaptação venosa no início FAVs embora a configuração de ponta a ponta e a presença de um cateter intravascular limitar a validade deste modelo para FAVs humanos. Um modelo FAV melhorada foi introduzido por Castier e 3 et ai. Na qual a extremidade dea artéria carótida é ligada para o lado da veia jugular. No entanto, em pacientes em hemodiálise FAVs são geralmente construídos por anatomizing o fim de uma veia para o lado de uma artéria. A configuração exacta da FAV é uma característica essencial de um modelo de acesso AV, uma vez que determina o perfil hemodinâmico no interior da conduta 4. Este último é um importante contribuinte para a disfunção endotelial e subsequente desenvolvimento de hiperplasia da íntima (IH) 5.
Um modelo murino romance foi recentemente desenvolvido com uma configuração anatómica idêntica como é utilizado em seres humanos 6. Neste modelo, são FAV criado em ratinhos C57BL / 6 por anastomose da extremidade de um ramo da veia jugular externa para o lado da artéria carótida comum com suturas interrompidas. No presente artigo, vamos nos concentrar sobre o procedimento microcirúrgico deste modelo, a fim de facilitar a utilização generalizada deste modelo murino, com o objetivo de desvendar a fisiopatologia complexada falha de acesso de hemodiálise.
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Protocol
Todos os experimentos foram aprovados pelo comitê de bem-estar animal, do Centro Médico da Universidade de Leiden.
1. Preparação Animal e Anestesia
- Anestesiar o rato (1-3 meses de idade) numa câmara de indução da anestesia contínua cheio com 3-4% de isoflurano.
- Raspar o lado ventral do pescoço e a parte interna da perna esquerda superior usando uma máquina de barbear eléctrica e usar um pedaço de fita adesiva para remover o cabelo.
- Aplicar pomada ocular em ambos os olhos.
- Posicionar o animal sobre a manta de aquecimento em que a máscara de ventilação nariz é fixo. Fixar a cabeça para a máscara do nariz usando fita adesiva.
- Deliver isoflurano a uma concentração de 1,5-2,0%, utilizando o oxigénio do ar enriquecido conjunto no seguinte fluxo: ar de 0,3 L / min, 100% de oxigénio de 0,2 L / min. Comprima a pele entre os dedos dos pés para avaliar a profundidade da anestesia e ajustar a concentração de isoflurano, se necessário.
- Fixar o animal aocobertor de aquecimento com fita adesiva em todos os membros que está ajustada para aproximadamente 37 ° C numa posição de supinação.
- Injectar buprenorfina dissolvido em cloreto de sódio (NaCl) a 0,9% a uma dosagem de 0,1 mg / kg em conjunto com 0,5 ml de solução estéril de NaCl a 0,9% por via subcutânea no flanco do animal.
- Aplicar clorexidina tintura de 0,5% para a área preparada.
Incisão 2. Pele
- Posicionar o animal sob o microscópio com a sua cabeça para o cirurgião.
- Adicione uma incisão longitudinal de aproximadamente 1,5 cm na linha média da região ventral do pescoço utilizando uma micro-tesoura.
- Agarre as glândulas salivares com uma pinça e deslocar a glândula salivar direita cranial até que esteja parcialmente fora da ferida.
3. Dissecando e preparar o Vein
- Identificar e sem rodeios dissecar o ramo dorsomedial da veia jugular externa direita completamente do seu tecido perivascular, espalhando apenas umLongside e na direcção do vaso sanguíneo.
- Coloque um loop (10,0 sutura) em torno da veia dissecada e aplicar um nó sem bloqueá-lo.
4. Retirar o músculo Sternocleidomastoid
- Utilizando uma pinça, sem rodeios dissecar o músculo esternocleidomastóideo direito do seu entorno, espalhando ao longo de sua fronteira. Coloque um par de pinças abertas sob o músculo isolado e ligar-lo proximal e distalmente com um fio de sutura 6.0. Subsequentemente, excisar o músculo utilizando um cauterizador.
5. Dissecando e preparar a artéria carótida comum
- Identificar e dissecção da artéria carótida comum direita usando uma pinça. Coloque um fio de sutura 6.0 em torno da artéria para auxiliar na manipulação da artéria.
- Aplicar pinças vasculares como distal e proximal possível.
- Adicione uma incisão longitudinal no meio da artéria de aproximadamente 1 mm usando o micro tesoura especializado.
- Lavar oartéria com uma solução de heparina [100 IU / ml], até que o recipiente esteja livre de sangue.
- Medir e ajustar o comprimento da incisão, se necessário, para coincidir com a largura da pinça vascular [1,1 milímetros].
6. ligadura da veia
- Aplique uma pinça vascular proximal da veia já preparada e coloque um fio de sutura em torno da veia.
- Aplicar tracção caudal suave para a veia utilizando um hemostático que é colocado sobre o fio de sutura e ligar a veia como distalmente quanto possível, utilizando a sutura 10.0 que foi colocado anteriormente.
- Cortar a veia usando uma tesoura apenas proximal ao ligadura.
- Utilizando uma pinça vascular, abra suavemente o lúmen da veia e lave-o com uma solução de heparina [100 IU / ml].
7. Criação de anastomose Parte 1
- Ligar a veia para a artéria com uma sutura interrompida (10,0) utilizando 2 nós quadrados na posição de doze horas, seguida por um fio de sutura, das seis O 'relógio posição. Certifique-se de conectar a veia para a artéria, sem permitir que ela gire em torno de seu próprio eixo. Rodar o animal, a fim de melhorar a exposição cirúrgica.
- Posicionar um fio de sutura em torno da veia e aplicar tração lateral suave usando um hemostático.
- Usando os mesmos pontos separados, completar a anastomose, colocando aproximadamente 3-4 suturas adicionais no lado ventral visível da anastomose.
8. Administração de Heparina
- Gire aquecimento cobertor 180 ° e concentrar o microscópio sobre a parte superior da perna esquerda.
- Identificar o feixe veia / artéria / nervo femoral pela procura de uma estrutura vascular que corre longitudinalmente no lado medial da parte superior da perna e pode ser visto através da pele. Realizar uma incisão com o micro tesoura de aproximadamente 1 cm acima directamente na veia femoral de um modo longitudinal.
- Dissecar cuidadosamente o tecido perivascular da veia femoral e injetar heparina na dose oF 0,2 UI / g de peso corporal na veia femoral.
9. Criação de anastomose Parte 2
- Voltar para a área do pescoço e remover o fio de sutura que foi colocada em torno da veia.
- Coloque um fio de sutura (6.0), que subsequentemente passa por baixo da artéria carótida, através da veia e de novo abaixo da artéria carótida. (Figura 1D)
- Remover o grampo vascular venoso.
- Em seguida, a metade torcer concluída fístula artério-venosa de 180 ° ao longo do eixo da artéria carótida no sentido horário por torção simultaneamente ambos os grampos vasculares e aplicar tração medial para as extremidades do fio de sutura.
- Conclua a anastomose da mesma maneira como é descrito na etapa 7.2.
10. Vascular braçadeira Remoção
- Remova o fio de sutura e gire o vascular grampos 180 ° no sentido horário.
- Retire o grampo vascular distal seguido pelo grampo vascular proximal. <li> Avaliar a permeabilidade da anastomose por oclusão suavemente a via de saída venosa com a pinça vasculares. No caso de uma anastomose de patente, o troço venoso pré-oclus vai expandir de uma maneira pulsátil. Mudar o local da glândula salivar direito à sua posição usando uma pinça anatómica original.
11. Pele Encerramento e Cuidados Pós-Operatórios
- Fechar a pele da parte superior da perna com uma sutura contínua (6,0).
- Fechar a pele do pescoço com uma sutura contínua (6,0).
- Remover o animal da manta de aquecimento e injectar 0,5 ml de NaCl a 0,9% por via subcutânea.
- Colocar o animal em uma gaiola escurecida que é aquecido com uma lâmpada de aquecimento e deixá-lo recuperar totalmente. Quando um animal não se recuperar totalmente, se certificar de que não sofre um choque hemodinâmico devido ao sangramento na área cirúrgica. Olhe para os sinais, como um pescoço inchado e o vazamento de sangue.
- Após cerca de 6 horas após a primeira injecção de buprenorphine, injectar uma dose única de uma formulação de libertação sustentada de buprenorfina por via subcutânea numa dose que é recomendado pelo fabricante, a fim de proporcionar uma analgesia adequada para uma 72 horas adicionais.
Colheita 12. Tissue
- Anestesiar os animais com uma mistura de anestésicos-contendo midazolam (5 mg / kg), medetomidina (0,5 mg / kg) e fentanil (0,05 mg / kg) administrada intraperitonealmente.
- Fixar o animal em decúbito dorsal através da inserção de agulhas através de suas patas e bochechas em um tapete de silicone não-aquecida.
- Realizar uma incisão de aproximadamente 1,5-2,0 cm de altura sobre a cicatriz no pescoço com o micro-tesoura.
- Dissecar o AVF, e coloque fios de sutura (6.0) em todo o proximal-, artéria distal e via de saída venosa para facilitar a identificação.
- Avaliar a permeabilidade da FAV como é descrito na secção 10.3 do protocolo.
- Abrir a cavidade peritoneal através da realização de uma laparotomia mediana Lcantar a micro tesoura.
- Corte completamente a caixa torácica ventral esquerda e direita usando um par de tesouras de partida caudal na linha hemiclavicular. Usando um micro tesoura, transecto o diafragma que é anexado a parte do meio da caixa torácica ventral e posteriormente deslocar esta secção cranial usando uma pinça.
- Localizar a veia cava inferior e transecto-lo com um micro tesoura.
- Inserir uma agulha de calibre 23 de agulha no ventrículo esquerdo e perfundir com PBS a uma pressão de cerca de 100 mm Hg até o fluido intravasal praticamente límpida.
- Sem retirar a agulha, agora perfundir com formalina a 4% durante 10 min a uma pressão de cerca de 100 mmHg.
- Extirpar o AVF, ao seccionar ambas as artérias e veias com o micro tesoura e mergulhe-o em solução de formalina a 4% O / N.
13. Tissue Embedding e Seccionamento
- Processar o tecido de parafina de acordo com Protoco da fabricaçãoeu. O protocolo aplicado consistiu no seguinte:
- Mergulhar em etanol a 70% durante 1 h à TA. Repetir 2x.
- Mergulhar em etanol a 96% durante 1 h à TA. Repetir 2x.
- Mergulhar em etanol 99,5% durante 1 h à TA. Repetir uma vez.
- Mergulhar em etanol 99,5% durante 1,5 h à TA.
- Mergulhar em xileno a 100% durante 1 h à TA. Repetir uma vez.
- Mergulhar na parafina durante 1 hora a 62 ° C. Repetir 2x.
- Incorporar a FAV em parafina para que a via de saída venosa é orientado perpendicular ao cassete incorporação.
- Utilizando um micrótomo, criar 12 secções em série cada um consistindo de 30 secções com uma espessura de 5 um. Em seguida, de cada secção em série, uma secção de colocar em um único copo de montagem a partir de uma posição de um máximo de doze de forma ordenada começando com a área mais próxima da anastomose.
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Representative Results
Após a criação da anastomose (Figura 1), a permeabilidade deve ser avaliada por pouco oclusão da via de saída venosa com uma pinça vascular. Quando a anastomose é patente, o tracto proximal vascular para a oclusão deve expandir claramente de uma maneira pulsátil. Além disso, a permeabilidade é confirmada através da utilização de fluoroscopia perto de infravermelhos (NIRF) que funciona efectivamente como uma angiografia (Figura 2). Uma falha no procedimento cirúrgico pode levar a uma oclusão da anastomose como está representado na (Figura 2). Esta falha pode ser provocada por uma zona muito estreita da anastomose, a torção dos vasos, a dose de heparina inadequada ou uma colocação acidental sutura que liga a parte anterior da anastomose para o lado de trás.
A um nível histológico, o processo de remodelação vascular em FAV pode ser elegantemente investigado usando este modelo. a remodelação vascular em FAV ocorre como um resultado daaumento do fluxo sanguíneo e a pressão. Em ratinhos, esta resposta é caracterizada por um aumento na circunferência (por exemplo, remodelação exterior) que conduz a um aumento da área luminal nas primeiras 2 semanas após a cirurgia. Após estas 2 semanas, a área de luminal diminui progressivamente devido a uma paragem na remodelação de ida e espessamento contínua da camada íntima. A formação destas lesões estenóticas progressivas resulta na oclusão de 50% de FAV às 4 semanas após a cirurgia. Portanto, o ponto de tempo óptimo para a colheita as FAVs seria às 2 semanas após a cirurgia, uma vez que nesta fase, a análise apropriada da resposta vascular na patente FAV ainda está viável. A imunocoloração da via de saída venoso em 2 semanas após a cirurgia mostra que o compartimento celular da íntima consiste principalmente de alfa-actina do músculo liso (α-SMA) positivos células (Figura 3), como observado em humanos FAVs falharam assim 7.
Em virtude da complexidade do procedimento microcirúrgico, é realista contar com falha técnica do procedimento em uma parte dos ratos. Nas nossas mãos, a taxa de sucesso do procedimento foi de 67% no início. No entanto, com formação complementar esta taxa foi aumentada até 97%. A principal causa da falha foi hemorragia (60%), seguido por trombose aguda (27%) e anesthesia- morte relacionada (13%). Após formação suficiente, o procedimento cirúrgico pode ser realizada em aproximadamente 1 hora.
Figura 1. Esquema detalhada do procedimento cirúrgico (A - T). Os passos fundamentais para a criação bem-sucedida de uma FAV. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 2. imagens macroscópicas de patentes e FAV obstruídos. (A) A FAV patentes com uma pinça vascular na artéria carótida comum distal. (B) Um ocluído FAV. (Seta branca) indica a direcção do fluxo sanguíneo. (C) A AVF patente demonstrada usando Near Infrared fluoroscopia. (Seta vermelha) indica artéria. (seta azul) indica via de saída venosa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. colorações histológicas do trato fluxo venoso da FAV no dia 14 contra navios de controle não operados (A - B). Visão geral morfológica usando hematoxilina, phloxin e saffron mostrando um claro aumento na circunferência da embarcação e hiperplasia da íntima desenvolvimento de 14 dias após a criação da FAV. (C - D) Coloração imuno-histoquímica demonstrando que a maioria das células apresentam a hiperplasia da íntima são alfa actina de músculo liso. (L) Lumen; hiperplasia (IH) íntima; barra de escala:. 200 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A FAV é considerado o calcanhar de Aquiles em tratamento de hemodiálise. Infelizmente, a FAV sofre ainda de um número elevado de falha 8-10. Apesar de extensa pesquisa sobre os mecanismos subjacentes, a fisiopatologia exata permanece desconhecida. Numerosos modelos murinos para o fracasso FAV já foram descritos na literatura 2,3,11,12. No entanto, nenhum desses modelos incorporam uma extremidade venosa a configuração anastomose arterial que é mais utilizado em cada situação clínica. Isto é muito relevante, pois o perfil hemodinâmico resultante desempenha um importante papel na remodelação vascular. Além disso, alguns dos modelos utilizados um manguito sintético para a conexão entre a artéria e veia 2,11, que não é utilizado na prática clínica.
Para melhorar a relevância clínica, portanto, desenvolveu um modelo murino em que uma extremidade venosa unilateral-anastomose arterial foi criado entre um ramo da juguveia lar e da artéria carótida comum com suturas interrompidas 6. Neste modelo mudanças histomorfológicas cruciais foram observados inclusive fora remodelação e hiperplasia da íntima progressiva, levando à falha da FAV.
Um aspecto crucial do procedimento cirúrgico é o protocolo de anestesia. Recomenda-se usar anestesia inalatória de isoflurano, como este é um método seguro e fácil para a obtenção de períodos prolongados de anestesia. Este último é especialmente importante para a fase de treinamento em que todo o processo pode levar até 3 horas.
A fim de criar o necessário espaço de atravessamento de escoamento da veia da fístula artério-venosa, o esternocleidomastoideu ipsilateral precisa de ser excisada.
No que diz respeito ao manuseamento navio durante a cirurgia, dissecção de vasos deve ser realizada de uma forma cega usando uma pinça. O uso de fórceps retas vasculares especializadas são recommended para a manipulação direta e manipulação dos vasos que proporcionam mais precisão e produzem menos danos mecânicos devido à ponta arredondada. O uso de fios de sutura como laçadas dos vasos combinados com uma pinça hemostática pode auxiliar na manipulação de tecidos em segurança e, além disso, ao apresentar o tecido de uma maneira óptima, quando utilizado como um terceiro lado que é crucial para este procedimento pode ser realizado sem qualquer intervenção directa.
Sem dúvida, a etapa mais difícil do processo são as colocações de sutura entre a artéria e veia. Cuidados devem ser tomados para não suturar a-side "back" da anastomose com a -side "frente", pois isso irá levar a estreitamento da anastomose que pode levar a uma falha prematura da FAV. Para impedir que isto aconteça, posicionar a ponta do fórceps vasculares entre as duas paredes do recipiente, de modo a separá-los. A dificuldade técnica pode ser considerada como uma limitação deste modelo. No entanto, nós não pensamos thneste procedimento é mais desafiador do que o modelo que é, actualmente, mais utilizado 3,6.
É difícil fazer uma observação geral sobre o tamanho da amostra para estudos futuros, como o tamanho da amostra calculado não depende apenas da variabilidade entre os animais, mas também sobre a 'força' da intervenção. Nós estimamos que um tamanho de grupo de aproximadamente 10 ratos (excluindo ratos que abandonam o estudo devido a falha técnica da FAV) deve ser suficiente para os estudos que incidem sobre o papel de um gene específico em fracasso FAV. Recentemente, fomos capazes de obter resultados significativos com um tamanho médio grupo de 10 animais em um estudo sobre o papel da elastina na FAV murino remodelação 13.
Um aspecto do nosso modelo murino requer uma discussão mais aprofundada. Sabe-se que o meio urémica em pacientes com doença renal em fase terminal contribui para uma grande variedade de doenças vasculares, incluindo hyperplasi íntima venosaum mesmo antes do acesso de hemodiálise cirurgia 14-16. Este modelo atual não incorpora o meio-urêmica. Por conseguinte, a incorporação de um modelo de insuficiência renal crónica 17 seria um passo importante aditivo para melhorar ainda mais a validade deste modelo murino.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microsocpe | Leica | M80 | |
| Forceps | Medicon | 07.61.25 | |
| Vascular forceps | S&T | JFL-3D.2 | |
| Vascular forceps | S&T | D-5a.2 | |
| Forceps | Roboz | SS/45 | |
| Micro scissor 5 mm blade | Fine science tools | 15000-08 | |
| Micro scissor 2 mm blade | Fine science tools | 15000-03 | |
| Scissor | Medicon | 05.12.21 | |
| Clip applier 1 | S&T | CAF-4 | |
| Vascular clamp 1 | S&T | B-1V | |
| Clip applier 2 | BBraun | FE572K | |
| Vascular clamp 2 | BBraun | FE740K | |
| Hemostatic forceps | BBraun | BH110 | |
| 10.0 sutures | BBraun | G1117041 | |
| 6.0 sutures | BBraun | 768464 | |
| Cauterizer | Fine science tools | 18010-00 | |
| Needle holder | Medicon | 11.82.18 | |
| Ocular ointment | Pharmachemie | 41821101 | |
| Chlorhexidine tincture 0,5% | Leiden University Medical Center | NA | |
| Heparin | Leo Pharma | 012866-08 | |
| Buprenorphin | RB Pharmaceuticals | 283732 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45,112,110 | |
| Anesthesia mask | Maastricht university | custom made | |
| Midazolam | Actavis | AAAC6877 | |
| Dexmedetomidine | Orion | 141-267 | |
| Fentanyl | Bipharma | 15923002 | |
| Continuous anaesthetic induction chamber | Vet-tech solutions | AN010R |
References
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