Introduction
Функциональная сосудистой трубопровод доступ имеет жизненно важное значение для пациентов с почечной недостаточностью, которые зависят от хронического гемодиализа, чтобы остаться в живых. Строительство артериовенозной фистулы (АВФ) в настоящее время предпочтительным выбором для сосудистого доступа. Тем не менее, связанные АВФ осложнения представляют собой основную причину заболеваемости для пациентов, находящихся на хроническом гемодиализе. Несмотря на обширные научные усилия, ни один из романа не подходит для уменьшения AVF доступа осложнений, связанных с так привести к значительному улучшению прочности АВФ. Часть этой неутешительной прогресса относится к неполным пониманием патофизиологии отсутствии доступа гемодиализа.
Чтобы распутать патофизиологии отсутствии доступа к AV, животных моделях, что точно имитировать человеческую патологию имеют первостепенное значение. В этом отношении, не только виды животных, но и анастомоза, требуемое анти-coagulatory терапия и продолжительность наблюдения после всплескары должны быть приняты во внимание 1. В то время как крупные животные являются наиболее подходящими для интервенционных исследований, направленных на разработку новых терапевтических стратегий, мышиные модели имеют наибольший потенциал, чтобы получить более глубокое в молекулярных механизмах, лежащих в основе недостаточности доступа А.В. в связи с наличием трансгенных мышей. Кроме того, большое количество мышей могут быть использованы для этой цели с меньшими затратами по сравнению с большими использования животных.
Первой мышиной модели недостаточности АВФ была описана в 2004 году Kwei и соавт. 2 В этой модели, АВФ были построены с использованием сонной артерии и яремной вены в порядке от конца до конца, используя внутрисосудистый катетер. Эта модель может быть полезна для изучения раннего венозный адаптации в АВФ хотя конфигурация конца в конец и наличие внутрисосудистого катетера ограничить действие этой модели для человека АВФ. Улучшенная модель AVF был введен Castier и соавт. 3, в котором конецсонная артерия соединяется с боковой яремную вену. Тем не менее, АВФ у больных, находящихся на гемодиализе, как правило, построены anatomizing конец вены в сторону артерии. Точная конфигурация АВФ является решающим характеристика модели доступа AV поскольку она определяет профиль гемодинамический внутри трубопровода 4. Последнее является важным фактором эндотелиальной дисфункции и последующее развитие гиперплазии интимы (IH) 5.
Роман мышиной модели Недавно был разработан с идентичным анатомической конфигурации, как используется в организме человека 6. В этой модели, AVF создаются в мышах C57BL / 6 путем анастомоз конец ветви наружной яремной вены в сторону общей сонной артерии с узловыми швами. В настоящей работе, мы обратили внимание на микрохирургической процедуры этой модели для того, чтобы облегчить широкое использование этой мышиной модели, направленной распутывать сложные патофизиологииотказа доступа гемодиализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты были одобрены комитетом по защите животных от Leiden University Medical Center.
1. Подготовка животных и анестезии
- Обезболить мышь (1-3 месяцев) на непрерывной индукции анестезии камере, наполненной 3-4% изофлуран.
- Бритье вентральной стороне шеи и внутренней части левой верхней части ноги с помощью электрического бритву и использовать кусок ленты, чтобы удалить волосы.
- Применить глазной мази на обоих глазах.
- Поместите животное на нагревательный одеяло на котором закреплена вентиляция нос маской. Сосредоточение голову к маске носа с помощью клейкой ленты.
- Deliver изофлуран в концентрации 1,5-2,0% с использованием обогащенный кислородом воздух набор по следующему потоку: воздух 0,3 л / мин, 100% кислорода 0,2 л / мин. Зажмите кожу между пальцами, чтобы оценить глубину анестезии и регулировать концентрацию ИФ при необходимости.
- Сосредоточение животное водеяло отопления с помощью клейкой ленты на всех конечностях, который установлен на уровне около 37 ° C в лежачем положении.
- Вводят бупренорфин, растворенного в хлорида натрия (NaCl) 0,9% при дозе 0,1 мг / кг вместе с 0,5 мл стерильного 0,9% NaCl подкожно в бок животного.
- Применить хлоргексидина настойки на 0,5% до подготовленную поверхность.
Разрез 2. Кожа
- Поместите животное под микроскопом с его головой к хирургу.
- Сделать продольный разрез приблизительно 1,5 см в средней линии вентральной шеи с использованием микро ножницы.
- Захватите слюнных желез с пинцетом и смещают правильный слюнные железы краниально, пока это не частично вне раны.
3. Анатомический и подготовка Vein
- Выявление и прямо рассекают дорсомедиальной ветвь правой наружной яремной вены полностью от его периваскулярного ткани, распространяя простоудлиненна и в направлении кровеносного сосуда.
- Поместите петлю (10,0 шовный) вокруг расчлененный вены и применить один узел без блокировки его.
4. Удаление мышцы кивательной
- Использование щипцов, прямо рассекать правой кивательной мышцы от его окрестностях, распространяя по всему краю. Поместите пару открытых щипцов под изолированной мышцы и перевязывать ее проксимальном и дистальном с 6.0 швом. Впоследствии, вырезать мышцы с помощью cauterizer.
5. Анатомический и подготовка артерии сонной
- Определить и анализировать правой общей сонной артерии с помощью щипцов. Поместите 6.0 шовная нить вокруг артерии, чтобы помочь в манипуляции артерии.
- Нанести сосудистые зажимы, как дистально и проксимально, насколько это возможно.
- Делают продольный разрез в середине артерии приблизительно 1 мм с использованием специализированного микро ножницы.
- промойтеартерии раствором гепарина [100 МЕ / мл], пока судно не выйдет из крови.
- Измерьте и отрегулируйте длину разреза при необходимости в соответствии с шириной сосудистого зажима [1,1 мм].
6. Лигирование вены
- Нанесите сосудистый зажим проксимальнее уже подготовленной вену и место шовного нить вокруг вены.
- Слегка хвостовой тяги к вене с использованием haemostat который помещен на шовного нити и перевязывать вену, как дистально, насколько это возможно, используя 10,0 шва, который был размещен ранее.
- Режут вены, используя ножницы просто проксимальнее перевязки.
- Используя сосудистые щипцы, аккуратно откройте просвет вены и промыть его раствором гепарина [100 МЕ / мл].
7. Создание анастомоза Часть 1
- Подключите вену артерии с прерванного шва (10,0) с использованием 2 квадратных узлов в положении двенадцать часов с последующим швом на шесть о 'Часы позиция. Убедитесь подключить жилу к артерии, не позволяя ему вращаться вокруг своей оси. Поворот животное в целях улучшения хирургического воздействия.
- Поместите шов нить вокруг вены и нежный боковой тяговой использованием haemostat.
- Используя те же швами, завершить анастомоза путем размещения примерно 3-4 дополнительных швов на видимой брюшной стороне анастомоза.
8. Администрация гепарин
- Поворот одеяло отопления 180 ° и сосредоточить микроскоп на левом бедре.
- Определить бедренную вену Ассортимент / артерии / нерва, ища сосудистой структуры, которая проходит в продольном направлении в медиальной части верхней части ноги и можно увидеть через кожу. Сделать надрез с микро ножницами примерно 1 см непосредственно над бедренной вены в продольном образом.
- Осторожно рассекают периваскулярное ткани бедренной вены и вводят гепарин в дозе Oе 0,2 МЕ / г массы тела в бедренную вену.
9. Создание анастомоза часть 2
- Возвращение в области шеи и снимите хирургическая нить, который был размещен вокруг вены.
- Поместите шовная нить (6.0), которые впоследствии проходит ниже сонной артерии, через вену и снова ниже сонной артерии. (Рисунок 1 л)
- Удалить венозную сосудистую зажим.
- Далее, крутить половина завершена артериовенозной фистулы 180 ° вдоль оси сонной артерии по часовой стрелке, одновременно поворачивая обе сосудистые зажимы и применять медиальной тягу к концам шовного нити.
- Заполните анастомоз таким же образом, как описано в шаге 7.2.
10. сосудистый зажим для удаления
- Удалите хирургическая нить и вращать сосудистая зажимы 180 ° против часовой стрелки.
- Удалить дистального сосудистого зажима с последующим проксимального сосудистый зажим. <LI> Оценка проходимости анастомоза, осторожно окклюзии венозного оттока тракта с сосудистыми щипцов. В случае патентного анастомоза, венозная раздел предварительно поглощающий будет расширяться в пульсирующее. Переместить правую слюнные железы к исходным анатомическом положении с помощью щипцов.
11. Кожа Закрытие и Послеоперационный
- Закройте кожу верхней части ноги с непрерывным швом (6.0).
- Закройте кожу шеи с непрерывным швом (6.0).
- Удалить животное от нагревательного одеяла и впрыснуть 0,5 мл NaCl 0,9% подкожно.
- Место животное в затемненной клетке, который нагревается нагревательным лампы и пусть он полностью восстановиться. Когда животное не полностью выздоравливают, убедитесь, что он не страдает от гемодинамический шок из-за кровотечения в хирургической области. Посмотрите на наличие признаков, таких как опухшие шеи и утечки крови.
- После приблизительно 6 ч после первой инъекции buprenorphine, впрыснуть разовую дозу препарата с замедленным высвобождением бупренорфина подкожно в дозе, рекомендованной производителем, с тем чтобы обеспечить адекватную анальгезию за дополнительную 72 ч.
12. Ткань для уборки
- Обезболить животное с анестезирующего-смеси, содержащей мидазолам (5 мг / кг), медетомидин (0,5 мг / кг) и фентанила (0,05 мг / кг) вводили внутрибрюшинно.
- Сосредоточение животное в лежачем положении, вставив иглы через лапах и щеках в мат неотапливаемых кремния.
- Сделайте надрез около 1,5-2,0 см над рубцом на шее с микро ножницами.
- Рассеките AVF, и поместите шовные темы (6.0) вокруг proximal-, дистальной артерии и венозного оттока тракта для облегчения идентификации.
- Оценка проходимости АВФ, как описано в разделе 10.3 протокола.
- Открыть в брюшную полость, выполняя медиальной лапаротомии Uпеть микро ножницы.
- Разрезать левой и правой вентральной грудной клетки с использованием ножниц, начиная каудально в среднеключичной линии. Использование микро ножницы, секут диафрагму, которая крепится к средней части брюшной грудной клетки и впоследствии вытеснить секцию краниальном помощью щипцов.
- Расположить нижней полой вены и секут его с микро ножницами.
- Вставьте иглу 23 иглы в левом желудочке и заливать с PBS при давлении примерно 100 мм рт.ст., пока intravasal жидкости не станет почти ясно.
- Без удаления иглы, теперь заливать 4% формалином в течение 10 мин при давлении примерно 100 мм рт.
- Вырежьте AVF по пересекающих обе артерии и вены с микро ножницами и погрузить его в 4% раствор формалина O / N.
13. Ткань Встраивание и секционирования
- Обработайте ткань парафином в соответствии с Protoco производстве вл. Протокол прикладного состоял из следующих действий:
- Погрузитесь в этаноле 70% в течение 1 ч при комнатной температуре. Повторите 2 раза.
- Погрузить в 96% этанол в течение 1 часа при комнатной температуре. Повторите 2 раза.
- Погрузитесь в этаноле 99,5% в течение 1 ч при комнатной температуре. Повторить один раз.
- Погрузитесь в этаноле 99,5% в течение 1,5 ч при комнатной температуре.
- Погрузитесь в ксилоле 100% в течение 1 ч при комнатной температуре. Повторить один раз.
- Погрузить в парафин в течение 1 ч при 62 ° С. Повторите 2 раза.
- Встраивание AVF в парафин, так что венозный отток тракта ориентирована перпендикулярно к вложению кассеты.
- Используя микротом, создать 12 серийных срезов каждый из которых состоит из 30 секций толщиной 5 мкм. Тогда из каждого последовательного разделе, поместите одну секцию на одной монтажной стекла, начиная с позиции одного до двенадцати упорядоченно, начиная с области, ближайшей к анастомоза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После создания анастомоза (рис 1), проходимость должна быть оценена в ближайшее окклюзии венозного оттока тракта с сосудистым щипцов. Когда анастомоза патент, ближний сосудистого тракта окклюзии должны четко разложить в пульсирующей манере. Кроме того, проходимость подтверждена с помощью ближней инфракрасной рентгеноскопии (NIRF), который эффективно функционирует в качестве ангиографии (рисунок 2). Неудача в хирургической процедуры может привести к закупорке анастомоза как изображено на (рис 2). Эта неудача может быть вызвана слишком узкой анастомоза области, кручение сосудов, неадекватной дозе гепарина или случайного размещения шовного которая соединяет переднюю сторону анастомоза к задней стороне.
На гистологическом уровне процесс ремоделирования сосудов в АВФ могут быть исследованы элегантно с использованием этой модели. Сосудистого ремоделирования в АВФ происходит в результатеувеличение кровотока и давления. У мышей, эта реакция характеризуется увеличением окружности (например, наружу ремоделирования), ведущей к увеличению площади просвета в первые 2 недели после операции. После этих 2-х недель, площадь просвета постепенно уменьшается в связи с остановкой в наружу ремоделирования и продолжающегося утолщение внутренней оболочки. Формирование этих прогрессивных стенотическими поражений приводит окклюзии 50% AVF через 4 недели после операции. Поэтому оптимальный момент времени для сбора АВФ будет через 2 недели после операции, так как в этой фазе, надлежащий анализ сосудистой реакции в патентной АВФ-прежнему возможно. Иммунологическое венозного оттока тракта у 2-х недель после операции показывает, что клеточный компартмент интимы в основном состоит из альфа-актин гладких мышц (α-SMA) позитивных клеток (рисунок 3), как это наблюдалось в неудачных человека АВФ, а 7.
Ввиду сложности микрохирургическая процедура, это реально считаться с техническим сбоем процедуры в пропорции мышей. В наших руках, вероятность успеха процедуры было в начале 67%. Однако при дальнейшем обучении этот показатель был увеличен до 97%. Основной причиной неудачи было кровотечение (60%), после чего острого тромбоза (27%) и anesthesia- связанной смерти (13%). После достаточного обучения, хирургическая процедура может быть выполнена приблизительно в 1 ч.
Рисунок 1. Подробная схема хирургической процедуры (А - Г). Основные шаги для успешного создания АВФ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Re 2 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 53294 / 53294fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Макроскопические фотографии патента и закупоренных АВФ. (А) Патент AVF с сосудистый зажим на дистальном общей сонной артерии. (Б) окклюзии АВФ. (Белая стрелка) указывает направление кровотока. (C) Патентный АВФ продемонстрирована с использованием ближней инфракрасной рентгеноскопии. (Красная стрелка) указывает артерию. (синяя стрелка) указывает венозного оттока тракта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 3. Гистологические окрашивание венозного оттока тракта АВФ на 14-й день по сравнению с неоперированных сосудов управления (A - B). Обзор Морфологические использованием гематоксилин phloxin и SAFFРон, показывая явное увеличение окружности сосуда и гиперплазии интимы развития 14 дней после создания АВФ. (C - D) Иммуногистохимическое окрашивание демонстрируя, что большинство клеток представляют гиперплазию интимы являются альфа актин гладких мышц положительным. (L) люмен; (IH) Гиперплазия интимы; Шкалы:. 200 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
АВФ считается ахиллесовой в процедуре гемодиализа. К сожалению, AVF еще страдает от большого количества недостаточности 8-10. Несмотря на обширные исследования на механизмах, лежащих, точная патофизиология остается неизвестным. Многочисленные мышиные модели для отказа AVF уже были описаны в литературе 2,3,11,12. Тем не менее, ни одна из этих моделей не включают венозный конец артериальной конфигурации анастомоза боковой что наиболее используемой в клинической ситуации. Это очень уместным, поскольку результирующее гемодинамический профиль играет важную роль в ремоделирования сосудов. Кроме того, некоторые модели используется синтетический манжету для соединения между артерией и веной 2,11, которая не используется в клинической практике.
Для улучшения клинической значимости, поэтому мы разработали мышиную модель, в которой одностороннее венозной конец артериальной стороне анастомоза была создана между ветви juguLAR вена и общая сонная артерия с узловыми швами 6. В этой модели решающие гистоморфологические изменения наблюдались в том числе наружу ремоделирования и прогрессивного гиперплазия интимы, в конечном итоге приводит к отказу АВФ.
Одним из важнейших аспектов хирургической процедуры является протокол анестезии. Рекомендуется использовать ИФ ингаляционной анестезии, так как это является безопасным и простой способ для получения длительных периодов анестезии. Последнее особенно важно для этапа обучения, в котором вся процедура может занять до 3 часов.
Для того чтобы создать необходимую комнату для оттока перемещения вену артериовенозного свища, ипсилатеральная кивательной мышцы необходимо удалить.
Что касается обработки судна во время операции, рассечение сосудов должны выполняться в тупым способом с помощью щипцов. Использование специализированных сосудистых прямыми щипцами являются гecommended для прямого обращения и манипуляции сосудов, поскольку они обеспечивают большую точность и производят меньше механических повреждений из-за закругленным кончиком. Использование шовных нитей, как петли сосудов в сочетании с кровоостанавливающего может помочь в обработке безопасной ткани и, кроме того, в представлении ткани оптимальным образом при использовании в качестве третьей руки которая имеет решающее значение, так эта процедура может быть выполнена без каких-либо непосредственной помощи.
Несомненно, самым трудным этапом процедуры являются шовные размещения между артерией и веной. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не шов "назад" -side анастомоза с "передней" -side, так как это приведет к сужению анастомоза, что может привести к преждевременному выходу из строя АВФ. Чтобы предотвратить это, поместите кончик сосудистых щипцов между двумя стенками сосуда, чтобы отделить их. Техническая сложность может рассматриваться как ограничение этой модели. Тем не менее, мы не думаем, йна этой процедуре является более сложным, чем модель, которая в настоящее время наиболее широко используется 3,6.
Это трудно сделать общее замечание о размере выборки для будущих исследований, так как расчетный размер выборки не только зависит от изменчивости между животными, но и на «прочность» вмешательства. По нашим оценкам, размер группы около 10 мышей (за исключением мышей, которые выпадают из исследования из-за технического сбоя АВФ) должно быть достаточным для проведения исследований, которые сосредоточены на роли специфического гена в неспособности АВФ. В последнее время мы смогли достичь значительных результатов со средним размером группы из 10 животных в исследовании о роли эластина в мышиной АВФ ремоделирования 13.
Одним из аспектов нашей мышиной модели требует дальнейшего обсуждения. Известно, что уремический среда у пациентов с конечной стадии почечной недостаточности способствует множества заболеваний сосудистых, включая венозный интимы hyperplasiеще до гемодиализа хирургии 14-16 доступа. Это настоящая модель не учитывает уремический среду. Таким образом, включение в модель хронической почечной недостаточностью 17 будет важным шагом добавка для дальнейшего улучшения справедливость этого мышиной модели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microsocpe | Leica | M80 | |
| Forceps | Medicon | 07.61.25 | |
| Vascular forceps | S&T | JFL-3D.2 | |
| Vascular forceps | S&T | D-5a.2 | |
| Forceps | Roboz | SS/45 | |
| Micro scissor 5 mm blade | Fine science tools | 15000-08 | |
| Micro scissor 2 mm blade | Fine science tools | 15000-03 | |
| Scissor | Medicon | 05.12.21 | |
| Clip applier 1 | S&T | CAF-4 | |
| Vascular clamp 1 | S&T | B-1V | |
| Clip applier 2 | BBraun | FE572K | |
| Vascular clamp 2 | BBraun | FE740K | |
| Hemostatic forceps | BBraun | BH110 | |
| 10.0 sutures | BBraun | G1117041 | |
| 6.0 sutures | BBraun | 768464 | |
| Cauterizer | Fine science tools | 18010-00 | |
| Needle holder | Medicon | 11.82.18 | |
| Ocular ointment | Pharmachemie | 41821101 | |
| Chlorhexidine tincture 0,5% | Leiden University Medical Center | NA | |
| Heparin | Leo Pharma | 012866-08 | |
| Buprenorphin | RB Pharmaceuticals | 283732 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45,112,110 | |
| Anesthesia mask | Maastricht university | custom made | |
| Midazolam | Actavis | AAAC6877 | |
| Dexmedetomidine | Orion | 141-267 | |
| Fentanyl | Bipharma | 15923002 | |
| Continuous anaesthetic induction chamber | Vet-tech solutions | AN010R |
References
- Rotmans, J. I. Animal Models for Studying Pathophysiology of Hemodialysis Access. The Open Urology & Nephrology Journal. 7, 14-21 (2014).
- Kwei, S., et al. Early adaptive responses of the vascular wall during venous arterialization in mice. Am.J.Pathol. 164 (1), 81-89 (2004).
- Castier, Y., et al. Characterization of neointima lesions associated with arteriovenous fistulas in a mouse model. Kidney Int. 70 (2), 315-320 (2006).
- Krishnamoorthy, M. K., et al. Hemodynamic wall shear stress profiles influence the magnitude and pattern of stenosis in a pig AV fistula. Kidney Int. 74 (11), 1410-1419 (2008).
- Ene-Iordache, B., Cattaneo, L., Dubini, G., Remuzzi, A. Effect of anastomosis angle on the localization of disturbed flow in 'side-to-end' fistulae for haemodialysis access. Nephrol. Dial. Transplant. 28 (4), 997-1005 (2013).
- Wong, C. Y., et al. Vascular remodeling and intimal hyperplasia in a novel murine model of arteriovenous fistula failure. J.Vasc.Surg. 59 (1), 192-201 (2014).
- Rekhter, M., Nicholls, S., Ferguson, M., Gordon, D. Cell proliferation in human arteriovenous fistulas used for hemodialysis. Arterioscler. Thromb. 13 (4), 609-617 (1993).
- Falk, A. Maintenance and salvage of arteriovenous fistulas. J. Vasc. Interv. Radiol. 17 (5), 807-813 (2006).
- Tordoir, J. H., et al. Prospective evaluation of failure modes in autogenous radiocephalic wrist access for haemodialysis. Nephrol. Dial. Transplant. 18 (2), 378-383 (2003).
- Dixon, B. S., Novak, L., Fangman, J. Hemodialysis vascular access survival: upper-arm native arteriovenous fistula. Am. J. Kidney Dis. 39 (1), 92-101 (2002).
- Yang, B., Shergill, U., Fu, A. A., Knudsen, B., Misra, S. The mouse arteriovenous fistula model. J. Vasc. Interv. Radiol. 20 (7), 946-950 (2009).
- Kang, L., et al. Regional and systemic hemodynamic responses following the creation of a murine arteriovenous fistula. Am. J. Physiol Renal Physiol. 301 (4), F845-F851 (2011).
- Wong, C. Y., et al. Elastin is a key regulator of outward remodeling in arteriovenous fistulas. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 49 (4), 480-486 (2015).
- Kennedy, R., et al. Does renal failure cause an atherosclerotic milieu in patients with end-stage renal disease. Am. J. Med. 110 (3), 198-204 (2001).
- Cheung, A. K., et al. Atherosclerotic cardiovascular disease risks in chronic hemodialysis patients. Kidney Int. 58 (1), 353-362 (2000).
- Lee, T., et al. Severe venous neointimal hyperplasia prior to dialysis access surgery. Nephrol. Dial. Transplant. 26 (7), 2264-2270 (2011).
- Kokubo, T., et al. CKD accelerates development of neointimal hyperplasia in arteriovenous fistulas. J. Am. Soc. Nephrol. 20 (6), 1236-1245 (2009).
