Abstract
Manipulation og kultur af tidlige museembryoer er en kraftfuld høj grad underudnyttet teknologi øge værdien af denne model system. Omvendt er cellekultur været meget anvendt i udviklingsmæssige biologiske undersøgelser. Men det er vigtigt at fastslå, om in vitro dyrkede celler virkelig repræsentere in vivo celletyper. Podning celler i embryoner, efterfulgt af en vurdering af deres bidrag under udviklingen er en nyttig metode til at bestemme potentialet af in vitro dyrkede celler. I denne undersøgelse, beskriver vi en fremgangsmåde til podning af celler i et defineret sted af tidlig implantation musefostre, efterfulgt af ex vivo kultur. Vi introducerer også en optimeret elektroporation metode, der bruger glaskapillarer med kendt diameter, gør det muligt præcist lokalisering og justering af antallet af celler, der modtager eksogent DNA med både høj transfektionseffektivitet og lav celledød. Disse teknikker, som ikke kræver nogen specialized udstyr, gøre eksperimentelle manipulationer af gastrulation og tidlig organogenese-fase museembryo muligt, således at en analyse af tilsagn i dyrkede celle subpopulationer og virkningen af genetiske manipulationer in situ på celledifferentiering.
Introduction
Cellekultur har været meget anvendt i udviklingsmæssige biologiske undersøgelser. Mus embryonale stamceller (EKSF) og epiblasten stamceller (EpiSCs) kan differentiere sig til alle tre kim lag in vitro og er en nyttig model til celledifferentiering i begyndelsen pattedyr embryogenese. Udledningen af disse cellelinjer har åbnet en mulighed for in vitro-manipulation og detaljeret undersøgelse af de lokaliserede signalering arrangementer og transkriptionelle netværk, der opererer i den tidlige embryonale mønster. Men det er stadig vigtigt at bestemme in vivo relevansen af eventuelle manipulationer udføres i kultur. In vivo potentiale præimplantations embryo-afledt mus økonomiske og sociale råd er blevet vurderet ved at introducere dem tilbage til præimplantations embryoner (morulae eller blastocyster) 1. Dog kan EpiSCs der repræsenterer epiblasten celler i implantation embryoer ikke integrere effektivt i præimplantations embryoner 2,3. Vores previoos fund har vist, at EpiSCs effektivt kan generere kimærer og bidrage til alle kim lag, når de er podet ind implantation embryoner 4. Således er den bedste måde at evaluere in vitro dyrkede celler er at introducere dem til deres tilsvarende miljø in vivo.
Elektroporation er en udbredt metode til at levere exogene molekyler i målcellerne i både in vivo og in vitro forsøg. Elektrisk energi kan generere et stort antal porer i cellemembranen, som tillader exogen deoxyribonukleinsyre (DNA) eller ribonukleinsyre (RNA) til ind i cellerne. En af de største udfordringer for denne teknik er at kombinere optimal levedygtighed celle med høj electrotransfection virkningsgrad 5,6. For elektroporation af nukleinsyrer i embryoniske væv, forgyldt elektroder har mest almindeligt blevet anvendt, tillader målretning af celler i en bred vifte rumlig 7-9. For at opnå en mere localized genoverførsel har en nål elektrode blevet anvendt til at opnå et samlingspunkt elektrisk felt 10,11. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, viste, at efter elektroporering, havde omkring 30-60 celler optages DNA-konstruktionen 11 forfatterne. Det forekommer dog, at præcist at justere antallet af elektroporerede celler stadig vanskeligt med en fast bredde elektrode. Kapillarrøret elektroporering teknik har været anvendt til at levere plasmider til enkeltceller 12-14. Imidlertid har denne teknik ikke er anvendt til elektroporering plasmider for embryoner ex vivo. For nylig er en microdevice blevet rapporteret at lokalt elektroporere få distale viscerale endoderm celler (mindre end 4 celler) i begyndelsen af implantation musefostre 15. Det er dog stadig uvist, om denne enhed effektivt kan målrette ektoderm og mesoderm ex vivo.
I denne undersøgelse beskriver vi to nye metoder til vurdering cellulære og gen-funktion i begyndelsen af indlæg-implantation embryoner. Vi først vise, hvordan man kan pode in vitro dyrkede celler i bestemte steder i tidlige museembryoer at vurdere deres in vivo potentiale. Integrationen af de podede celler og deres efterkommere, alle mærket med en genetisk tag (f.eks et grønt fluorescerende protein (GFP), yderligere kan undersøges ved immunfarvning af vævsspecifikke proteiner 4. For det andet beskriver vi en forbedret metode til præcist at levere DNA til lokaliserede steder i embryoet via elektroporation. Snarere end at bruge en nål elektrode, vi har indsat en tynd tråd inde i en spids glaskapillar, og viser, at denne ændring kan levere DNA til et lille antal celler med høj effektivitet og begrænset celledød. Desuden viser vi, at ved at bruge glas kapillærer med forskellige åbning størrelser, kan vi kontrollere antallet af elektroporerede celler. Derfor mener vi, denne metode kan være til stor nytte at studere tidlige embryonale mønster involverer små tal of celler.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med UK Home Office Regulations som angivet i de Dyr (Scientific Procedurer) Act (1986) under Projekt Licence nummer 60/4435. At indsamle embryoner på bestemte udviklingsstadier blev timede parringer oprettet O / N. Middag på dagen for at finde en vaginal prop blev udpeget embryonale dag (E) 0.5.
1. dissekere E7.5 eller E8.5 implantation Embryoner til Ex Vivo Kultur
- Sacrifice gravide hunmus ved cervikal dislokation.
- Isoler livmoderen ved hjælp af en saks, holder den med pincet, og anbring i en 30 mm skål fyldt med M2 medium.
- Riv forsigtigt fra hinanden myometriet bruger to par fine tænger.
- Skræl væk decidua, sørg for ikke at punktere de extraembryonic hulrum.
- Fjern Reichert membran ved at klemme den med en pincet og langsomt adskiller den fra embryo.
- Kontroller embryoner under et dissekerestereomikroskop at sikre, at blommesækken, amnion og ectoplacental kegle er intakte.
- Overfør embryoner til en ren skål af M2 ved hjælp af en pipette og sted på en 30 mm plastik petriskål låg på is (den "ice-platform") til delvist chill embryoner.
- Hvis det er nødvendigt, gemme embryoner i M2 på en is platform for op til 1,5 timer, f.eks., Under forberedelse eller manipulation af små partier af medier ~ 3-4 embryoner ved stuetemperatur.
Bemærk: Inddrivelse og dissektion af gnaver embryoner er blevet beskrevet i detaljer tidligere 7,8,16.
2. Forbered Embryo Culture Medium
- Frisk tø enten kommercielt tilgængelig rotteserum (se Glanville-Jones et al. 13 for specifikationer) eller rotteserum fremstillet in-house ifølge Copp og Cockroft 16, der blev varmeinaktiveret i 30 minutter ved 56 C og nedfrosset i 1 ml alikvoter ved -80 ˚C
Bemærk: Kommercielt tilgængelige rotteserum er acceptabel for kultur perioder af 24-36 timer, selv om serum udarbejdet internt er efter vores erfaring, overlegen til kultur perioder på op til 48 timer. - Forberede frisk et overskud (f.eks., 10 ml) af definerede kosttilskud bestående af Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM), 1% ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 2 mM L-glutamin og 1 mM natriumpyruvat.
- Beregn mængden af dyrkningsmediet, der er nødvendig i forhold til antallet af embryoner af hvert trin, der skal dyrkes (se afsnit 3). Bland rotteserum med de definerede supplementer til at 50% dyrkningsmedium (1: 1 (v / v) rotteserum: definerede kosttilskud) og / eller 75% dyrkningsmedium (3: 1 (v / v) rotteserum: defineret kosttilskud).
- Passere embryo dyrkningsmedium gennem et 0,45 um filter og tilføj 10.000 IU / ml penicillin og 10 ug / ml streptomycin.
Bemærk: Frisk optøet L-glutamin og natriumpyruvat løsning er afgørende for udviklingen embryo under ex vivo-dyrkning.
- For E7.5 embryoer: statisk kultur under anvendelse af 4-brønds plader i en inkubator leveres med 5% CO2 i luft ved 37 ° C i 24 timer. Kultur op til to embryoner pr brønd i 1 ml 50% dyrkningsmedium.
- For E8.5 embryoer: Brug en rulle kultur apparat 8 roterer med 35 omdrejninger / min inkorporerer kontinuerlig gasning med 5% CO2 i luft ved 37 ° C i 24 timer (1 ml 50% dyrkningsmedium pr embryo).
- For E9.5 embryoer: Brug en apparat valse kultur roterer ved 35 omdrejninger / min inkorporerer gasser leveres med 5% CO2, 40% O 2 55% N2 ved 37 ° C i 24 timer (1 ml 75% dyrkningsmedium pr Foster).
Bemærk: Kultur embryoner indenfor 3 timer efter euthanizing musene som længere perioder i M2 påvirke udviklingen. Se Copp og Cockroft 16 til fremgangsmåden ifølge ex vivo embryokultur.
4. Grafting Dyrkede celler i E7.5 eller E8.5 musefostre
- Fysisk skrabe EpiSCs, som allestedsnærværende udtrykker GFP, fra en 6-brønds kultur plade ved hjælp af en 20-200 pi pipettespids og placere dem i en 30 mm skål, der indeholder embryoner
Bemærk: Hvis du vil indsætte celleklumper i embryoner, bør celler være fysisk skrottet i stedet trypsinbehandlet. - Vedhæft en hånd-trukket podning kapillar til sugerøret til at gøre en mund pipette.
- Suge forsigtigt pipette munden til at trække en eller flere celleklumper størrelse> 20 celler i podning kapillarrøret.
- Forsigtigt blæse ud af cellerne, for delvis at sprede store klumper.
- Vælg en celle klump indeholder ~ 10-20 celler og suge ind i podning kapillar igen, holde det tæt på åbningen af kapillær. Pas på ikke at flytte cellen klump i og ud af kapillarrøret gentagne gange, for at undgå break-up i mindre stykker.
- Hold embryo løst på plads med en pincet og indsæt podningkapillar ind i området af interesse at skabe en åbning.
- Forsigtigt udvise den klump ud af podning kapillar, efterlader den korte streng af 10-20 celler indgivet i embryoet.
- Gentag podning procedure for det ønskede antal embryoner. Brug batch størrelser på 3-4 embryoner for bekvemmelighed.
- Forlader embryoner i samme skål af M2-medium, billede de podede embryoner under anvendelse af en fluorescens forbindelse dissektionsmikroskop med kameraet, holde billeddannelse til et minimum for at undgå udsættelse af embryonerne for kraftig lys og varme.
Bemærk: Bestem billedoptagning empirisk, da disse vil afhænge af specifikationerne for kameraet og mikroskop, samt arten og fluorescensintensiteten af fluoroforen. - Overfør embryon på et pastette med et minimalt volumen af M2 medium til præ-ækvilibreret dyrkningsmedium (se afsnit 3) umiddelbart efter billeddannelse.
Bemærk: at undersøge forsigtigt morfologi af embryonerne efter podning. Kun kultur intact embryoner.
5. Håndlavet Elektroporation Materialer og Apparatur opsætning (forberede følgende forud for Elektroporeringsteknikker Eksperimenter):
- For DNA-injektion pipetter: Træk DNA-injektion pipetter anvendelse af en horisontal mikropipette aftrækker. Injektion pipetter bør have en fin spids med en åbning på mindre end 10 um for at undgå vævsbeskadigelse ved injektion af DNA i de embryonale hulrum.
- For glaskapillar elektroporation: Brug en microforge at skære åbningen af DNA-injektion pipetter til en indre diameter på enten 20 eller 30 um. For at undgå skader, når cellulære kapillarrøret er i kontakt med fosteret for elektroporation, skal spidsen af kapillarrøret skæres rent og ikke indeholde skarpe, brudte kanter.
- For håndlavede kapillær elektrode (anode) (figur 1): Indsæt en 0,2 mm i diameter platin ledning i en elektroporation glaskapillær med en fast åbning på 20 eller 30 um diameter til at fokusere de udvalgteric nuværende og levere plasmid-DNA'et til et lille område af interesse i embryoet.
- For håndlavede L-formet elektrode (katoden) (figur 1): bøje en 0,2 mm i diameter platintråd skabe en "L" form, med den vandrette del af "L" omkring 1 mm i længden.
- Vedhæft hver platin elektrode til en tynd isolerede ledninger og sæt det i en mikroinjektion nåleholder dækket af isolering tape.
- Monter nålen holdere på standard mikromanipulering instrument indehavere.
- Tilslut kredsløb som vist i figur 1: Tilslut kapillær elektroden til anoden af strømforsyningen; tilslutte L-formet elektrode til anoden af multimeter; forbinde katoden i mulimeter til katoden af strømforsyningen.
6. Elektroporation E7.5 eller E8.5 musefostre
- Fyld elektroporation glaskapillar med PBS til inden for 1-2 mm af den øverste og indsæt straiGHT platinelektroden (anode) i kapillarrøret, indtil den når bunden af kapillarrøret.
- Forankre L-formet elektrode (katode) på overfladen af en 30 mm petriskål fyldt med PBS.
- Overfør embryo fra M2 medium ind i PBS-fyldte elektroporation fad.
- Sæt kanylen fra lateral epiblasten ind livmoderhulrummet af embryoet. Ved hjælp af en pneumatisk pumpe pico, injicere DNA-opløsning (pCAG-Cre: GFP eller pCAG-GFP 1-1,5 pg / ml med 0,01% grøn frugtfarve farvestof) ind i hulrummet, indtil den er helt fyldt. For E7.5-E8.5 embryoner, der kræves DNA-opløsning under 5 pi for en foster. Brug den grønne farvestof som en indikator, skal du passe på ikke at sprænge embryoet.
- Anbring forsigtigt embryonet mellem elektroderne og flytte den kapillære elektroden til den præcise sted, hvor DNA'et skal leveres.
Bemærk: Orienteringen af embryonet afhænger det område, hvor DNA'et skal elektroporeres. - ElectropoBedøm embryo anvendelse af 200 volt (V) i 6 impulser, hver af 50 ms varighed med en 1 sek interval mellem hver puls.
- Overfør foster for at præ-ækvilibreret dyrkningsmedium umiddelbart efter elektroporering. Hvis det ønskes, gentage processen for den næste foster.
Bemærk: Tilføj dyrkningsmediet i en steril beholder og sætte det i kulturen inkubator til at pre-ligevægt mediet. - For at detektere elektroporerede celler 2 timer efter kultur, overføre embryoner til et rent 30 mm petriskål af M2 medium ved hjælp af en pastette. Billede embryoner som i trin 5.9 ved hjælp af en fluorescens sammensatte dissekere mikroskop.
- Overfør embryoner tilbage til kulturen under anvendelse af en pastette umiddelbart efter billeddannelse.
- For at detektere døde celler forårsaget af elektroporation, plette embryonerne med en langt-rød cellemembran-impermeabelt nuklear farvestof (1: 200 i embryo dyrkningsmedium) ved 37 ° C i 10 minutter 2 timer efter elektroporering (valgfrit)
- At tælle de elektroporerede celler, løse Embryos i 4% paraformaldehyd (PFA) i 2-4 timer ved 4 C, plette kernen med en ultraviolet eller langt-rød fluorescerende nukleare kontrastfarve og billede embryoner ved hjælp af en konfokal mikroskop (ekstraudstyr).
Bemærk: Embryonale vækst påvirkes negativt, hvis venstre for længe i PBS. Derfor sikre, at den tid, det tager at elektroporere hver embryo er minimeret (<5 min pr embryo).
Representative Results
Podning
EpiSCs at ubikvitært udtrykker EGFP (R04-GFP, afledt af E6.5 epiblasten og C2, afledt in vitro fra mESCs) 4 blev manuelt skrabet fra kulturen skålen og transplanteret ind forskellige steder i E7.5 embryoer (figur 2A). Embryonerne blev dyrket ex vivo og analyseret efter 24 timer. Fordelingen af donorceller blev vurderet ved fluorescensmikroskopi. Hvis donorceller indarbejdet de prolifererede og deres derivater dispergeret i værten embryoner (figur 2B). Det er blevet observeret, at transplantater, der indeholder 10-16 celler indarbejdet effektivt i værten embryoner (figur 2A, 2B) og dog podning flere celler ikke resulterer i bedre chimaerism. I stedet transplanterede celler producerede personlige klumper (figur 2C og 2D).
Elektroporering
Til enssess effektiviteten af vores elektroporation-system, vi leverede GFP-udtrykkende plasmider (pCAG-GFP og pCAG-Cre: GFP) til specifikke steder i fosteret. I overensstemmelse med en tidligere undersøgelse 11 blev GFP + celler påvist i embryoner 1-2 timer efter elektroporation (Figur 2E og 2G). Når distale epiblasten celler på sene primitivstriberne stadie embryo blev elektroporeret, bidrog mærkede celler til den neurale ectoderm efter 24 timer i kultur (figur 2E og 2F). Dette resultat svarer godt til kendte skæbne kort over epiblasten celler i gastrulation embryoer 17. Tilsvarende, når GFP-ekspressionsplasmid blev elektroporeret i primitivstriberne på E8.5 (2-5 somitter), GFP + -celler bidraget til den akseparallelle mesoderm (figur 2G og 2H), i overensstemmelse med kendte skæbne kort i slutningen primitivstriberne 18 . Desuden observerede vi bidrag til alle tre kim lag fra elektroporerede celler (Figur 2I-K),tyder på, at elektroporation procedure ikke bringer celleopførsel in vivo. Men vi har også bemærket, at mens epiblasten (E7.5) eller primitive streak celler (E8.5) var målrettet, nogle endoderm celler også elektroporeret (figur 3C og tabel 1).
En af de store fordele ved at bruge en kapillær elektrode er, at antallet af elektroporerede celler kan styres, blot ved at ændre diameteren af åbningen. For at bestemme antallet af elektroporerede celler blev embryoner fikseret 2 timer efter elektroporering og afbildes i wholemount på et konfokalt mikroskop. Antallet af GFP + -celler blev manuelt talt i det konfokale z-stakke. Tabel 1 viser, at for et givet trin, øge åbningsstørrelse på kapillarrøret fra 20 til 30 um resultater i DNA-optagelse af flere celler. Når en enkelt åbning størrelse blev sammenlignet mellem trin (E7.5 versus E8.5) blev flere celler sig at være elektroporeres på sidstnævnte tidspunkt. Denne virkning kan skyldes en højere koncentration af DNA til stede i livmoderhulrummet på E8.5. Fordi DNA-opløsningen blev blandet med grønne fødevarer farvestof, kan vi bruge den grønne farve til at vurdere DNA-koncentrationen i livmoderhulrummet. I mikroskopet, er det klart, at det sammenlignet med E8.5 embryoer, den grønne farve efter DNA-injektion er meget lettere i hulrummet af E7.5 embryoer. Selvom den samme koncentration af DNA-opløsning blev injiceret i E7.5 og E8.5 embryoer, var mere DNA-opløsning i livmoderhulrummet af E8.5 embryoer med henblik på at udfylde det fuldstændigt, fordi de er større i størrelse. Efter fjernelse af injektionsnålen, er der altid en vis grad af lækage af DNA-opløsning fra livmoderhulrummet, og da punkteringshullet er større i forhold til størrelsen af livmoderhulrummet i tidligere embryoner er det sandsynligt, at der var forholdsmæssigt mere lækage fra E7.5 end E8.5 embryoer, hvilket fører til en lavere DNA-koncentration. Det forskellige antal transficeredeceller kan også skyldes de forskellige diametre eller inducerede transmembrane spænding (ITV) tærskler for celler på forskellige stadier.
En ulempe ved elektroporation er forbundet celledød. I lighed med den traditionelle forgyldt eller nåleformede elektroder, elektroporering under anvendelse af en kapillær elektrode bevirker også, at celledød. Efter elektroporation målregionen syntes mørkere i farven i forhold til tilgrænsende regioner (figur 3A og 3B), hvilket indikerer, at en vis grad af celledød skal have fundet sted i dette område. For yderligere at bestemme antallet af døde celler forårsaget af elektroporation procedure, blev embryoer farvet med et fluorescerende cellemembran-impermeabelt nukleare farvestof. Kernerne af døde celler blev mærket med en membran-impermeabel langtrækkende rød fluorescens farvestof. Farvningen bekræftet, at dette kapillær elektroporationsteknik kun resulterer i et lille antal døde celler i nærheden af elektroporation (figur 3D og Taligt 1).
Vi har bemærket, at selv døde celler vises ved elektroporation site, GFP + -celler og døde celler er også mest eksklusive fra hinanden (figur 3E og 3F). Desuden, når den kaudale laterale epiblasten på E8.5 blev elektroporeret med pCAG-GFP og et glas kapillar åbning 20 um, et stort antal af GFP + -celler blev påvist efter 48 timer i kultur (figur 3G og 3H). Tilsammen tyder disse resultater på de fleste GFP + -celler detekteres 2 timer efter elektroporation er stadig levedygtige under den videre kultur.
Vi scorede antallet af GFP + -celler efter 24 timer ex vivo kultur. Seks embryoer blev elektroporeret med pCAG-GFP ved E7.5, under anvendelse af en kapillær åbning 20 um diameter. 107 ± 31 (gennemsnit ± SD) GFP + -celler / embryo blev påvist. Siden ved starten af kultur (2 timer), blev 9 celler elektroporeres i gennemsnit pr embryo (
Figur 1. kredsløbsdiagram, der viser elektroporation setup. Embryonet indeholdende DNA-opløsningen i sin amnionhulen blev placeret mellem de to elektroder. Strøm ved de valgte parametre blev leveret af en firkantet bølge puls generator (strømforsyning). En multimeter blev forbundet i serie til at opdage den elektriske strøm passerer embryoet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Fordelingen af podede eller elektroporerede celler i værten embryoner. (Ah) GFP-fluorescens overlejringer (grøn) på lysfelt billeder af wholemount embryoner (gråskala) (A) 10-16 GFP + EpiSCs blev podet ind i det distale område af et sent -streak stadie foster. (C) En større klump af GFP + EpiSCs blev podet ind i det distale område af en mid-streak stadie foster. (B og D) Fordelingen af EpiSCs afledte celler (grøn) i værten embryoner (vist i A og C) efter 24 timer i kultur. (B) GFP + -celler dispergeret i værtsembryo, hvilket tyder på korrekt integration af donorcellerne. (D) Podning større celleklumper resulterede i personlige klump dannelse i værtsembryo. (EK) pCAG-Cre: GFP plasmid ele ctroporated i specifikke områder af vildtype embryoner. Elektroporering distale område en tidlig knopstadiet embryo (E) eller primitivstriberne af en 2-5 somite embryo (G) resulterede i GFP + -celler i disse regioner 2 timer efter proceduren. (F og H) Fordelingen af GFP + -celler i værten embryoner efter 24 timer i kultur, viser, at elektroporerede celler bidrager til neuroectoderm (sort pil) (F) og akseparallelle mesoderm (hvid pil) (H). (IK) DAB immunfarvning for GFP + -celler viser, at de elektroporerede celler kan give anledning til neuroectoderm (I), mesoderm (J) og endoderm (J og K) efter 24 timer i kultur. Scale bar (AH) = 250 um; Målestokken (IK) = 100 um. Bemærk: Figur 1A og 1B er genoptrykt fra vores tidligere publikation 4.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53295/53295fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Fordeling af GFP + celler og døde celler i embryoner efter elektroporation (AC) pCAG-Cre:. GFP plasmid elektroporeret i de caudale laterale epiblasten celler i et E8.5 (2-5 somit etape) embryo (kapillær åbning størrelse :. 20 pm) (A) 2 timer efter indgrebet, målregionen viste en mørk farve (hvid pil) sammenlignet med andre dele af embryoet. Indsat viser en forstørrelse af den elektroporerede region. (B) Lysfelt billede (gråtoner) overlejret med det grønt fluorescerende kanal viser den elektroporerede celler (grøn). (C) En konfokal z-slice viser, atto endoderm celler (grøn) tog også op plasmidet når caudale laterale epiblasten celler målrettet. Cellekernerne er vist i rødt (DF) pCAG-Cre:. GFP plasmid blev elektroporeret i den kaudale aspekt af knudepunktet af E8.5 embryoer (kapillær åbning størrelse: 30 um). Embryonet blev dyrket i 2 timer. Elektroporerede celler vises med grønne og døde celler i rødt. (D) Den elektroporerede område indeholder både GFP + celler såvel som døde celler. Området i hvide boks blev yderligere analyseret i et konfokalt mikroskop. Manuel tælling af z-stakken viste, at der var 33 GFP + -celler og 23 døde celler i dette område. Kun to celler var både positive for begge fluorophorer. (E og F) XYZ afbildning af en konfokal z-skive fra den hvide indrammede region D, som udviser GFP + -celler er adskilt fra de døde celler. Kernerne er vist med blåt (G og H) pCAG-Cre:. GFP plasmid blev elektroporeret ind i et par cells i den kaudale laterale epiblasten af E8.5 embryoer (kapillær åbning størrelse: 20 um) og afbildes efter to (G) og 48 (H) timer ex vivo-dyrkning Bemærk: (H) Den embryo blev brudt i to efter dyrkning. Hoved og hjerte regioner blev fjernet. Scale bar (A, B, D, G og H) = 250 um; skala (C, E og F) = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Diameter åbning af kapillarrøret | Fosterstadiet | Elektroporation effektivitet: nej. embryoner indeholdende GFP + celler efter 2 timer / samlet antal. af elektroporerede embryoer (nr. GFP + embryoner, der udviklede normalt efter 24 eller 48 timer kultur) | Gennemsnitligt antal GFP + -celler pr embryo ± SD (n = antal undersøgte fostre.) | AntalGFP + endodermale celler pr hvert foster ± sd (n = antal undersøgte embryoner.) |
| 20 um | E7.5 (LS-LB) | 7/9 (7) | 9 ± 3 (n = 4) | 4 ± 2 (n = 4) |
| 30 um | E7.5 (LS-LB) | 13/15 (12) | 17 ± 2 (n = 4) | 6 ± 1 (n = 4) |
| 20 um | E8.5 (2-5 somitter) | 12/13 (10) | 21 ± 4 (n = 4) | 11 ± 4 (n = 4) |
| 30 um | E8.5 (2-5 somitter) | 2/2 (2) | 33 og 26 (n = 2) | 14 og 16 (n = 2) |
Tabel 1. Elektroporation effektivitet pCAG-Cre: GFP plasmid i musefostre.
Forkortelse: LS, sent primitivstriberne fase; LB: sent knopstadiet. Embryoer iscenesat ifølgeNedture og Davies 12
Discussion
Podning
Det kritiske skridt for celle podning eksperimenter er indsættelsen af en sammenhængende streng af celler ideelt i en enkelt handling, for at undgå opsplitning af klump. Denne teknik kræver nogen øvelse i at kontrollere mundpipette. Hvis donorceller indarbejde godt i værten, vil deres derivater sprede i embryoet. For yderligere at fastslå, om de dispergerede donor-afledte celler differentierer hensigtsmæssigt i værten, kan immunfarvning udføres på embryo sektioner. Hvis donor celler er ikke kompatible med værten miljø, de enten ikke kan påvises (som de er fordrevet fra embryonet) eller danne personlige klumper i embryoner efter kultur. Hvis begge spredte celler og celleklumper blev observeret, kan det indikere, at alt for mange celler blev podet og overdrevne donor celler, der ikke kan interagere med omgivende værtsceller resulterede i klump formation. I dette tilfælde yderligere transplantater indeholdendeet mindre antal celler kan udføres.
Den største begrænsning af cellen podning teknik er, at det ikke er muligt at bestemme det fulde potentiale in vivo af celler, eftersom muse ex vivo kultur i perioder længere end 48 timer er ikke blevet opnået. Men hvis de kombineres med ultralydsvejledt celleinjektion, kan det være muligt at overføre dyrkede celler til embryoner i livmoderen. For at opsummere, celle podning eksperimenter er ofte blevet brugt i vores gruppe, og har givet os værdifulde fingerpeg om in vivo potentiale af forskellige celletyper 4,21,22. Det er en teknik til generel anvendelighed til at vurdere in vivo potentiale in vitro dyrkede celler i tidlig implantation embryoer.
Elektroporering
Selv om der i denne undersøgelse har vi kun vist, at det er effektivt at anvende kapillære elektroporationsteknik at målrette epiblasten, it er også muligt at målrette forsætligt andre kim lag såsom endoderm celler. Det kritiske skridt for kapillære elektroporation teknik er at minimere den tid, det tager at elektroporere hvert embryo (<5 min pr embryo), da PBS er meget suboptimal for tidlige museembryoner. Vores data ovenfor har vist, at i de fleste områder i embryoner, er elektroporation ikke påvirke væksten fosteret. Men elektroporation i knudepunktet forårsagede unormal udvikling og førte til for tidlig død af embryoet. Dette vil sandsynligvis på grund af skader eller død af de celler, der danner vigtige signalering centre 23. Derfor ville denne region skal undgås med denne teknik. En yderligere undtagelse er, at som nævnt i resultatafsnittet, mens epiblasten eller primitive streak celler blev målrettet, nogle endoderm celler blev også elektroporeret. Det kan være, fordi DNA når til endoderm gennem huller under epiblasten epitel. Endoderm består af epitelceller og i vores erfaring thESE celler har en højere tilbøjelighed til at optage DNA. Derfor, når anvendelsen af denne teknik til skæbnen kortlægning, er det vigtigt at vurdere, hvilke celler indledningsvis tage op DNA.
Det skal også bemærkes, at skønt pCAG-GFP og pCAG-Cre: kan GFP-plasmider leveres effektivt ved hjælp af elektroporation parametre, der vises i denne undersøgelse, kan effektiviteten af andre DNA-konstruktioner variere, og behov for individuel optimering. Ændringer i DNA-koncentration, elektroporering spænding eller antallet af impulser kan ske, hvis plasmider viser sig at være vanskeligt at transficere.
For at opsummere, kan vores optimerede kapillar elektroporation systemet effektivt og reproducerbart levere GFP eller Cre: GFP plasmider i en meget få celler i embryonet med begrænset celledød. Da denne metode ikke kræver dyrt eller højt specialiseret udstyr, kan det være til stor nytte for cellesporing undersøgelser eller i at teste virkningen af ektopisk ekspression eller betinget deletion of gener i tidlige embryoner, er, hvis elektroporation udført i embryoner med floxet betingede mutantalleler. Derfor er denne elektroporationsteknik giver et nyttigt funktionel redskab til at forstå på en celle til celle-basis roller celle-intrinsisk faktorer i forbindelse med lokaliseret vildtype embryonale miljøer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Dumostar | T5390 | |
| Dissecting stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Stereomicroscope system with fluorescence | Nikon | AZ100 | |
| Inverted microscope with a digital camera | Olympus | Olympus BX61 | |
| Inverted confocal microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 | |
| Low melting point agarose | Life Technologies | 16520-050 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 11397863 | |
| 30mm Petri dishes | Fisher Scientific | 121V | |
| 4-well plates | Thermo scientific | 179820 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pipettes | NICHIRYO | Nichipet | |
| tips | Greiner Bio One | 685280 | |
| Cell culture incubator | SANYO | MCO-17AIC | |
| Roller culture apparatus | BTC Engineering | ||
| Syringe filters 0.45µm, sterile | Sigma-Aldrich | 10462100 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| non-essential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | SH30549.01 | |
| Sodium pyruvate solution | Fisher Scientific | SH30239.01 | |
| Penicillin and Streptomycin 10.000UI/ml | Lonza | DE17-602E | |
| Gas Cartridge for Portable Meker Burner | COLEMAN | COLEMAN 250 | |
| Thin Wall Borosilicate Capillary Glass with Fillament, OD 1.0 mm, ID 0.78 mm | Harvard Apparatus | 640798 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Microforge | De Fonbrune | BS030301 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV830 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
| ECM 830 square wave pulse generator | BTX | 45-0002 | |
| Green food coloring dye | Sigma-Aldrich | C.I. 42053 | |
| A far-red cell membrane-impermeable nuclear dye | Biotium | 40060-T | |
| pCAG-Cre:GFP | Addgene | #13776 | |
| pCAG-GFP | Addgene | #16664 | |
| Multimeter | Excel | XL830L | |
| Micromanipulators | Leitz | ||
| 0.2mm diameter platinum wire | Agar Scientific | E404-2 | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | |
| Goat anti-Chicken IgY, HRP | Santa Cruz | sc-2428 | |
| Liquid DAB+ Substrate Chromogen System | Dako | K3467 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D21490 | |
| A far-red fluorescence nuclear counterstain | Life Technologies | T3605 |
References
- O'Hagan, A. R., Morton, R., Eid, N. Loss of asthma control in pediatric patients after discontinuation of long-acting Beta-agonists. Pulmonary med. , 894063 (2012).
- Brons, I. G., et al. Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos. Nature. 448, 191-195 (2007).
- Tesar, P. J., et al. New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells. Nature. 448, 196-199 (2007).
- Huang, Y., Osorno, R., Tsakiridis, A., Wilson, V. In Vivo differentiation potential of epiblast stem cells revealed by chimeric embryo formation. Cell rep. 2, 1571-1578 (2012).
- Sadik, M. M., et al. Scaling relationship and optimization of double-pulse electroporation. Biophys. J. 106, 801-812 (2014).
- Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorg. Med. Chem. Lett. , (2015).
- Soares, M. L., Torres-Padilla, M. E., Zernicka-Goetz, M. Bone morphogenetic protein 4 signaling regulates development of the anterior visceral endoderm in the mouse embryo. Dev. Growth Differ. 50, 615-621 (2008).
- Pierreux, C. E., Poll, A. V., Jacquemin, P., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. Gene transfer into mouse prepancreatic endoderm by whole embryo electroporation. JOP. 6, 128-135 (2005).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7, 107 (2007).
- Davidson, B. P., Tsang, T. E., Khoo, P. L., Gad, J. M., Tam, P. P. Introduction of cell markers into germ layer tissues of the mouse gastrula by whole embryo electroporation. Genesis. 35, 57-62 (2003).
- Khoo, P. L., Franklin, V. J., Tam, P. P. Fate-Mapping Technique: Targeted Whole-Embryo Electroporation of DNA Constructs into the Germ Layers of Mouse Embryos 7-7.5 Days Post-coitum. CSH protocols. 2007. , pdb.prot4893 (2007).
- Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae. Methods Mol Biol. 546, 145-151 (2009).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Nolkrantz, K., et al. Electroporation of single cells and tissues with an electrolyte-filled capillary. Anal. Chem. 73, 4469-4477 (2001).
- Mazari, E., et al. A microdevice to locally electroporate embryos with high efficiency and reduced cell damage. Development. 141, 2349-2359 (2014).
- Copp, A. J., Cockroft, D. L. Postimplantation mammalian embryos : a practical approach. , IRL Press. (1990).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mech. Dev. 68, 3-25 (1997).
- Wilson, V., Beddington, R. S. Cell fate and morphogenetic movement in the late mouse primitive streak. Mech. Dev. 55, 79-89 (1996).
- Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. Redefining the progression of lineage segregations during mammalian embryogenesis by clonal analysis. Dev Cell. 17, 365-376 (2009).
- Bellomo, D., Lander, A., Harragan, I., Brown, N. A. Cell proliferation in mammalian gastrulation: the ventral node and notochord are relatively quiescent. Dev. Dynam. 205, 471-485 (1996).
- Tsakiridis, A., et al. Distinct Wnt-driven primitive streak-like populations reflect in vivo lineage precursors. Development. 141, 1209-1221 (2014).
- Gouti, M., et al. In vitro generation of neuromesodermal progenitors reveals distinct roles for wnt signalling in the specification of spinal cord and paraxial mesoderm identity. PLoS biology. 12, e1001937 (2014).
- Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120, 613-620 (1994).
