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Developmental Biology

प्रारंभिक Postimplantation माउस भ्रूण में कोशिकाओं या डीएनए के ठीक स्थानीय स्थानांतरण के लिए तरीके

Published: December 25, 2015 doi: 10.3791/53295
Automatic Translation
1, 1, 1
1MRC Centre for Regenerative Medicine, School of Biological Sciences, University of Edinburgh

Abstract

जल्दी माउस भ्रूण के हेरफेर और संस्कृति शक्तिशाली अभी तक काफी हद तक कम उपयोग इस मॉडल प्रणाली का मूल्य बढ़ाने प्रौद्योगिकी एक है। इसके विपरीत, सेल संस्कृति को व्यापक रूप से विकासात्मक जीव विज्ञान के अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, यह इन विट्रो संवर्धित कोशिकाओं को सही मायने में विवो प्रकार की कोशिकाओं में प्रतिनिधित्व निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। विकास के दौरान उनके योगदान के एक आकलन के द्वारा पीछा भ्रूण में कोशिकाओं ग्राफ्टिंग इन विट्रो संवर्धित कोशिकाओं की क्षमता का निर्धारण करने के लिए एक उपयोगी तरीका है। इस अध्ययन में, हम पूर्व vivo संस्कृति के द्वारा पीछा जल्दी postimplantation माउस भ्रूण का एक निर्धारित साइट में कोशिकाओं ग्राफ्टिंग के लिए एक विधि का वर्णन है। हम भी उच्च अभिकर्मक दक्षता और कम कोशिका मृत्यु दोनों के साथ exogenous डीएनए प्राप्त कोशिकाओं की संख्या का सटीक स्थानीयकरण और समायोजन की इजाजत दी, ज्ञात व्यास का गिलास केशिकाओं का उपयोग करता है कि एक अनुकूलित इलेक्ट्रोपोरेशन विधि परिचय। किसी भी सपा की आवश्यकता नहीं है, जो इन तकनीकों में,ecialized उपकरण, gastrulation और जल्दी जीवोत्पत्ति चरण माउस भ्रूण संभव की प्रयोगात्मक जोड़तोड़, सुसंस्कृत सेल उप-जनसंख्या में प्रतिबद्धता और सेल भेदभाव पर बगल में आनुवंशिक जोड़तोड़ के प्रभाव की इजाजत दी विश्लेषण प्रस्तुत करना।

Introduction

सेल संस्कृति को व्यापक रूप से विकासात्मक जीव विज्ञान के अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है। माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (ESCs) और आद्यबहिर्जनस्तर स्टेम कोशिकाओं (EpiSCs) इन विट्रो में तीनों जनन परतों में अंतर है और जल्दी स्तनधारी भ्रूण में सेल भेदभाव के लिए एक उपयोगी मॉडल हो सकता है। इन सेल लाइनों की व्युत्पत्ति इन विट्रो हेरफेर और जल्दी भ्रूण patterning के दौरान परिचालन स्थानीयकृत संकेत घटनाओं और ट्रांसक्रिप्शनल नेटवर्क की विस्तृत जांच के लिए एक अवसर के लिए खोल दिया है। हालांकि, यह संस्कृति में प्रदर्शन किसी भी जोड़तोड़ के vivo प्रासंगिकता का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण बनी हुई है। preimplantation भ्रूण व्युत्पन्न माउस ESCs के इन विवो संभावित preimplantation भ्रूण (morulae या blastocysts) 1 में उन्हें वापस शुरू करने से मूल्यांकन किया गया है। हालांकि, postimplantation भ्रूण में आद्यबहिर्जनस्तर कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते कि EpiSCs preimplantation भ्रूण 2,3 में कुशलता से एकीकृत नहीं कर सकते हैं। हमारे previoहमें निष्कर्षों postimplantation भ्रूण 4 में grafted जब EpiSCs कुशलता, काइमेरा पैदा करते हैं और सभी रोगाणु परतों के लिए योगदान कर सकते हैं कि पता चला है। इस प्रकार, इन विट्रो संवर्धित कोशिकाओं का मूल्यांकन करने के लिए सबसे अच्छा तरीका विवो में उनके इसी पर्यावरण के लिए उन्हें लागू करने के लिए है।

Electroporation vivo में इन विट्रो प्रयोगों में दोनों में लक्षित कोशिकाओं में बहिर्जात अणुओं देने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है। विद्युत ऊर्जा बहिर्जात deoxyribonucleic एसिड (डीएनए) या कोशिकाओं में प्रवेश करने के लिए Ribonucleic एसिड (आरएनए) की अनुमति देता है जो कोशिका झिल्ली में छिद्रों की एक बड़ी संख्या उत्पन्न कर सकते हैं। इस तकनीक के लिए सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक उच्च electrotransfection दक्षता 5,6 के साथ इष्टतम सेल व्यवहार्यता गठबंधन है। भ्रूण के ऊतकों में न्यूक्लिक एसिड की electroporation के लिए, सोने की एक व्यापक स्थानिक रेंज 7-9 में कोशिकाओं का निशाना बना अनुमति देता है, इलेक्ट्रोड सबसे अधिक इस्तेमाल किया गया है, चढ़ाया। एक अधिक लोका प्राप्त करने के लिएlized जीन स्थानांतरण, एक सुई के आकार इलेक्ट्रोड एक केन्द्र बिजली के क्षेत्र 10,11 प्राप्त करने के लिए उपयोग किया गया है। इस विधि का प्रयोग, लेखकों electroporation के बाद, चारों ओर 30-60 11 कोशिकाओं के निर्माण के डीएनए लिया था कि पता चला है। फिर भी, यह सही electroporated कोशिकाओं की संख्या को एडजस्ट करने के लिए एक निश्चित-चौड़ाई इलेक्ट्रोड के साथ मुश्किल बना हुआ है कि लगता है। केशिका electroporation तकनीक एकल कक्षों 12-14 को प्लास्मिडों वितरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, इस तकनीक पूर्व vivo भ्रूण को प्लास्मिडों electroporating के लिए लागू नहीं किया गया। अभी हाल ही में एक microdevice जल्दी postimplantation माउस भ्रूण 15 में स्थानीय स्तर पर electroporate कुछ बाहर का आंत अन्तर्जनस्तर कोशिकाओं (कम से कम 4 कोशिकाओं) को सूचित किया गया है। हालांकि, यह इस उपकरण कुशलतापूर्वक बाहरी झिल्ली को निशाना बनाने और पूर्व vivo mesoderm कर सकते हैं कि क्या अभी भी अज्ञात है।

इस अध्ययन में हम जल्दी पोस्ट में सेलुलर और जीन समारोह का आकलन करने के लिए दो उपन्यास विधियों का वर्णन-implantation भ्रूण। हम पहली बार अपने इन विवो क्षमता का आकलन करने के लिए जल्दी माउस भ्रूण में परिभाषित साइटों में इन विट्रो संवर्धित कोशिकाओं भ्रष्टाचार के लिए कैसे प्रदर्शित करता है। grafted कोशिकाओं और उनके वंश के एकीकरण, सब एक आनुवांशिक टैग (जैसे, एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) द्वारा लेबल, आगे ऊतक विशिष्ट प्रोटीन के immunostaining द्वारा जांच की जा सकती है 4। दूसरे, हम ठीक डीएनए वितरित करने के लिए एक बेहतर विधि का वर्णन बल्कि एक सुई के आकार इलेक्ट्रोड का उपयोग करने से electroporation के माध्यम से भ्रूण में स्थानीय साइटों के लिए।, हम एक ठीक इत्तला दे दी कांच केशिका अंदर एक पतली तार डाला, और इस संशोधन उच्च दक्षता और सीमित के साथ कोशिकाओं की एक छोटी संख्या के लिए डीएनए वितरित कर सकते हैं कि प्रदर्शित कोशिका मृत्यु। इसके अलावा, हम विभिन्न उद्घाटन आकार के साथ कांच केशिकाओं का उपयोग करके, हम electroporated कोशिकाओं की संख्या को नियंत्रित कर सकते हैं कि पता चलता है। इसलिए, हम ओ इस विधि छोटी संख्या को शामिल जल्दी भ्रूण patterning के अध्ययन करने के लिए बहुत काम का हो सकता है पर विश्वासच कोशिकाओं।

Protocol

पशु (वैज्ञानिक प्रक्रिया) में निर्दिष्ट के रूप में सभी पशु प्रयोगों परियोजना लाइसेंस नंबर 60/4435 के तहत ब्रिटेन के गृह मंत्रालय नियमों के अनुसार (1986) अधिनियम किए गए। विशिष्ट विकास के चरणों में भ्रूण को इकट्ठा करने, समय पर संभोग हे / एन की स्थापना की थी। एक योनि प्लग खोजने के दिन दोपहर भ्रूण दिन (ई) 0.5 नामित किया गया था।

1. पूर्व vivo संस्कृति के लिए E7.5 या E8.5 Postimplantation भ्रूण विदारक

  1. ग्रीवा अव्यवस्था से गर्भवती मादा चूहों बलिदान।
  2. संदंश के साथ इसे धारण, कैंची का उपयोग गर्भाशय अलग, और एम 2 मध्यम से भरा एक 30 मिमी डिश में रखें।
  3. ध्यान से ठीक संदंश के दो जोड़े का उपयोग myometrium फाड़।
  4. Extraembryonic गुहाओं पंचर करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा पतनिका दूर छील।
  5. संदंश के साथ यह बन्द रखो और धीरे-धीरे भ्रूण से अलग से रीचर्ट झिल्ली को हटा दें।
  6. एक विदारक के तहत भ्रूण चेकstereomicroscope जर्दी थैली, भ्रूणावरण और ectoplacental कोन बरकरार हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए।
  7. बर्फ पर एक 30 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश के ढक्कन पर ('बर्फ मंच') के लिए आंशिक रूप से सर्द भ्रूण एक पिपेट और जगह का उपयोग M2 के लिए एक साफ डिश के लिए भ्रूण स्थानांतरण।
  8. यदि आवश्यक हो, अप करने के लिए 1.5 घंटे के लिए एक बर्फ मंच, उदा।, मीडिया तैयारी या छोटे समूहों के हेरफेर के दौरान पर M2 में दुकान भ्रूण ~ आरटी पर 3-4 भ्रूण।
    नोट: रिकवरी और कृंतक भ्रूण के विच्छेदन पहले से 7,8,16 में विस्तार से वर्णित किया गया है।

2. भ्रूण संस्कृति के माध्यम तैयार

  1. हौसले वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध चूहे सीरम या तो गल (विनिर्देशों के लिए Glanville-जोन्स एट अल। 13 देखें), या चूहा सीरम गर्मी 56 सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए निष्क्रिय और 1 मिलीलीटर में जम गया था कि Copp और Cockroft 16 के अनुसार घर में तैयार -80 सेल्सियस पर aliquots
    नोट: वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध चूहे सीरम स्वीकार्य है सीरम घर में तैयार हालांकि 24-36 घंटे की संस्कृति अवधि के लिए है, 48 घंटा अप करने के लिए संस्कृति अवधि के लिए बेहतर हमारे अनुभव में।
  2. हौसले से एक अतिरिक्त तैयार (जैसे।, 10 एमएल) के ग्लासगो न्यूनतम आवश्यक मध्यम (GMEM), 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड (NEAA), 2 मिमी एल glutamine और 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट मिलकर परिभाषित खुराक की।
  3. सुसंस्कृत होने जा रहे हैं कि प्रत्येक चरण के भ्रूण की संख्या के अनुसार की जरूरत है कि संस्कृति के माध्यम से की मात्रा की गणना (धारा 3 देखें)। 50% संस्कृति के माध्यम से बनाने के लिए परिभाषित की खुराक के साथ चूहे सीरम मिश्रण (1: 1 (वी / वी) चूहा सीरम: परिभाषित की आपूर्ति करता है) और / या 75% संस्कृति के माध्यम से (3: 1 (वी / वी) चूहा सीरम: परिभाषित पूरक)।
  4. एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से भ्रूण संस्कृति के माध्यम से गुजरती हैं और 10,000 आइयू / एमएल पेनिसिलिन और 10 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें।
    नोट: हौसले thawed एल glutamine और सोडियम पाइरूवेट समाधान पूर्व vivo संस्कृति के दौरान भ्रूण के विकास के लिए महत्वपूर्ण है।
ई "> 3। विभिन्न भ्रूण चरणों के लिए पूर्व vivo संस्कृति शर्तें

  1. 24 घंटे के लिए 37 सी पर हवा में 5% सीओ 2 के साथ आपूर्ति की एक मशीन में 4 अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग कर स्थिर संस्कृति: E7.5 भ्रूण के लिए। 1 मिलीलीटर 50 के% संस्कृति के माध्यम में अच्छी तरह से प्रति दो भ्रूण अप करने के लिए संस्कृति।
  2. E8.5 भ्रूण के लिए: 24 घंटा (भ्रूण प्रति 1 मिलीलीटर 50% की संस्कृति के माध्यम से) के लिए 37 सी पर हवा में 5% के साथ सीओ 2 निरंतर बक को शामिल 35 revs / मिनट पर घूर्णन एक रोलर संस्कृति तंत्र 8 का उपयोग करें।
  3. E9.5 भ्रूण के लिए: 24 घंटा (1 प्रति मिलीलीटर 75% मध्यम संस्कृति के लिए 35 revs में 37 सेल्सियस पर 5% सीओ 2, 40% 2 हे 55% एन 2 के साथ आपूर्ति / मिनट को ​​शामिल गैसों घूर्णन एक रोलर संस्कृति तंत्र का उपयोग भ्रूण)।
    नोट: 3 घंटा के भीतर संस्कृति भ्रूण प्रतिकूल विकास को प्रभावित M2 में लंबे समय के रूप में चूहों euthanizing के बाद। पूर्व vivo भ्रूण संस्कृति की विधि के लिए Copp और Cockroft 16 देखें।

4. GraftinE7.5 या E8.5 माउस भ्रूण में छ संवर्धित कोशिकाओं

  1. शारीरिक रूप से एक 20-200 μl विंदुक टिप का उपयोग 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली से सर्वत्र व्यक्त GFP जो EpiSCs, परिमार्जन और भ्रूण युक्त एक 30 मिमी पकवान में उन्हें जगह
    नोट: भ्रूण में सेल झुरमुटों सम्मिलित करने के लिए, कोशिकाओं शारीरिक रूप से खत्म कर दिया बजाय trypsinized किया जाना चाहिए।
  2. एक मुँह पिपेट बनाने के लिए खींचने की मशीन ट्यूब के लिए एक हाथ से खींच लिया ग्राफ्टिंग केशिका संलग्न।
  3. धीरे ग्राफ्टिंग केशिका में आकार में से एक या एक से अधिक सेल झुरमुटों> 20 कोशिकाओं आकर्षित करने के लिए मुंह पिपेट चूसना।
  4. धीरे आंशिक रूप से बड़े गुच्छों को तितर-बितर करने के लिए, कोशिकाओं बाहर उड़ा।
  5. केशिका का उद्घाटन करने के लिए इसे बंद रखने, ~ 10-20 कोशिकाओं से युक्त एक सेल पेड़ों का झुरमुट का चयन करें और फिर ग्राफ्टिंग केशिका में चूसना। में और बार बार केशिका से बाहर सेल पेड़ों का झुरमुट स्थानांतरित करने के लिए नहीं सावधान रहो, छोटे टुकड़ों में तोड़-अप से बचने के लिए।
  6. संदंश की एक जोड़ी के साथ जगह में शिथिल भ्रूण पकड़ो और ग्राफ्टिंग डालेंहित के क्षेत्र में केशिका एक खोलने बनाने के लिए।
  7. धीरे भ्रूण में दर्ज कराई 10-20 कोशिकाओं की छोटी स्ट्रिंग छोड़ने ग्राफ्टिंग केशिका के बाहर पेड़ों का झुरमुट निष्कासित।
  8. भ्रूण की वांछित संख्या के लिए कलम बांधने का काम प्रक्रिया को दोहराएँ। सुविधा के लिए 3-4 भ्रूण के बैच आकार का प्रयोग करें।
  9. अत्यधिक प्रकाश और गर्मी के लिए भ्रूण के जोखिम से बचने के लिए एक न्यूनतम करने के लिए इमेजिंग समय ध्यान में रखते हुए, एम 2 मध्यम, छवि कैमरा के साथ विदारक माइक्रोस्कोप एक प्रतिदीप्ति परिसर का उपयोग grafted भ्रूण की एक ही थाली में भ्रूण छोड़कर।
    नोट: इन कैमरा और माइक्रोस्कोप, साथ ही fluorophore की प्रकृति और प्रतिदीप्ति तीव्रता की विशिष्टताओं पर निर्भर करेगा के रूप में अनुभव से इमेजिंग समय निर्धारित।
  10. M2 के माध्यम की एक न्यूनतम मात्रा के साथ एक pastette में भ्रूण स्थानांतरण संस्कृति के माध्यम से (धारा 3 देखें) तुरंत इमेजिंग के बाद equilibrated पूर्व करने के लिए।
    नोट: ध्यान से ग्राफ्टिंग के बाद भ्रूण की आकृति विज्ञान की जांच। INTAC केवल संस्कृतिटी भ्रूण।

5. हस्त Electroporation सामग्री और उपकरण सेटअप (electroporation प्रयोगों के अग्रिम में निम्न तैयार):

  1. डीएनए इंजेक्शन pipettes के लिए: एक क्षैतिज micropipette खींचने का उपयोग डीएनए इंजेक्शन pipettes खींच। इंजेक्शन pipettes भ्रूण गुहाओं में डीएनए इंजेक्शन जब ऊतकों को नुकसान से बचने के लिए एक खोलने के कम से कम 10 माइक्रोन के साथ एक अच्छी टिप देना चाहिए था।
  2. कांच केशिका electroporation के लिए: 20 या 30 माइक्रोन या तो की एक आंतरिक व्यास करने के लिए डीएनए इंजेक्शन pipettes के उद्घाटन में कटौती करने के लिए एक microforge का उपयोग करें। केशिका electroporation के लिए भ्रूण के साथ संपर्क में है जब सेलुलर क्षति से बचने के लिए, कांच केशिका की नोक सफाई से और न तेज, टूटे किनारों को रोकने के लिए कटौती की जानी चाहिए।
  3. हस्तनिर्मित केशिका इलेक्ट्रोड (एनोड) (चित्रा 1) के लिए: चुनाव ध्यान केंद्रित करने के लिए 20 या 30 माइक्रोन व्यास की एक निश्चित खोलने के साथ एक इलेक्ट्रोपोरेशन गिलास केशिका में एक 0.2 मिमी व्यास प्लैटिनम तार डालनेवर्तमान रिक और भ्रूण के हित में एक छोटे से क्षेत्र को प्लास्मिड डीएनए देने के लिए।
  4. हस्तनिर्मित एल के आकार इलेक्ट्रोड (कैथोड) (चित्रा 1) के लिए: "एल" लंबाई में लगभग 1 मिमी क्षैतिज भाग के साथ, एक 'एल' आकार बनाने के लिए एक 0.2 मिमी व्यास प्लैटिनम तार मोड़।
  5. एक पतली अछूता तार करने के लिए प्रत्येक प्लैटिनम इलेक्ट्रोड देते हैं और इन्सुलेशन टेप द्वारा कवर एक microinjection सुई धारक में डालें।
  6. मानक micromanipulation साधन धारकों पर सुई धारकों माउंट।
  7. चित्र 1 में दिखाया के रूप में सर्किट कनेक्ट: बिजली की आपूर्ति की एनोड केशिका इलेक्ट्रोड कनेक्ट; मल्टीमीटर की एनोड के लिए एल के आकार इलेक्ट्रोड कनेक्ट; बिजली की आपूर्ति की कैथोड को mulimeter के कैथोड कनेक्ट।

6. Electroporation E7.5 या E8.5 माउस भ्रूण

  1. शीर्ष के 1-2 मिमी के भीतर पीबीएस के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन गिलास केशिका को भरें और strai डालेंकांच केशिका में ght प्लैटिनम इलेक्ट्रोड (एनोड) यह केशिका के नीचे पहुंचता है जब तक।
  2. पीबीएस के साथ भरा एक 30 मिमी पेट्री डिश की सतह पर एल के आकार इलेक्ट्रोड (कैथोड) लंगर।
  3. पीबीएस भरा इलेक्ट्रोपोरेशन डिश में M2 के माध्यम से भ्रूण स्थानांतरण।
  4. भ्रूण के एमनियोटिक गुहा में पार्श्व आद्यबहिर्जनस्तर से इंजेक्शन सुई डालें। यह पूरी तरह से भरा हुआ है, जब तक गुहा में: एक साँस पिको पंप का प्रयोग, डीएनए समाधान (GFP या pCAG GFP के 0.01% हरे रंग भोजन डाई के साथ 1-1.5 माइक्रोग्राम / एमएल pCAG-सीआरई) इंजेक्षन। E7.5-E8.5 भ्रूण के लिए, कम से कम 5 μl डीएनए समाधान एक भ्रूण के लिए आवश्यक है। एक संकेतक के रूप में हरे रंग का उपयोग करना, भ्रूण फट करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
  5. ध्यान से इलेक्ट्रोड के बीच भ्रूण की स्थिति और डीएनए से दिया जा रहा है, जहां सटीक स्थान के लिए केशिका इलेक्ट्रोड चलते हैं।
    नोट: भ्रूण के उन्मुखीकरण डीएनए electroporated किया जा रहा है, जहां इस क्षेत्र पर निर्भर करता है।
  6. Electropoप्रत्येक नाड़ी के बीच एक 1 सेकंड अंतराल के साथ, 6 दालों में 50 एमएस की अवधि के प्रत्येक 200 वोल्ट (वी) का उपयोग भ्रूण दर।
  7. करने के लिए भ्रूण स्थानांतरण electroporation के बाद तुरंत संस्कृति के माध्यम से पूर्व equilibrated। वांछित है, तो अगले भ्रूण के लिए इस प्रक्रिया को दोहराने।
    नोट: एक बाँझ कंटेनर में संस्कृति के माध्यम से जोड़ें और मध्यम पूर्व संतुलित करने के लिए संस्कृति इनक्यूबेटर में डाल दिया।
  8. संस्कृति के बाद electroporated कोशिकाओं 2 घंटा का पता लगाने के एक pastette का उपयोग कर M2 के माध्यम का एक स्वच्छ 30 मिमी पेट्री डिश के लिए भ्रूण हस्तांतरण करने के लिए। छवि विदारक माइक्रोस्कोप एक प्रतिदीप्ति परिसर का उपयोग कदम 5.9 में के रूप में भ्रूण।
  9. इमेजिंग के तुरंत बाद एक pastette का उपयोग कर संस्कृति को वापस भ्रूण स्थानांतरण।
  10. एक दूर लाल कोशिका झिल्ली अभेद्य परमाणु डाई के साथ भ्रूण दाग, इलेक्ट्रोपोरेशन की वजह से मृत कोशिकाओं का पता लगाने के लिए: electroporation के बाद 10 मिनट के 2 घंटे के लिए 37 सी (1 भ्रूण संस्कृति के माध्यम में 200) (वैकल्पिक)
  11. Embry ठीक करने, electroporated कोशिकाओं की गिनती करने के लिए4 सी में 2-4 घंटे के लिए 4% paraformaldehyde (पीएफए) में ओएस, एक पराबैंगनी या दूर लाल फ्लोरोसेंट परमाणु counterstain और छवि एक confocal खुर्दबीन (वैकल्पिक) का उपयोग भ्रूण के साथ नाभिक दाग।
    नोट: पीबीएस में भी लंबे समय के लिए छोड़ दिया है, तो भ्रूण विकास पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ा है। इसलिए, प्रत्येक भ्रूण electroporate करने में लगने वाले समय को कम से कम है कि (भ्रूण प्रति <5 मिनट) किया जाता है।

Representative Results

कलम बांधने का काम

सर्वत्र EGFP (mESCs से इन विट्रो में निकाली गई E6.5 आद्यबहिर्जनस्तर से निकाली गई R04 GFP, और सी 2, 4) कि एक्सप्रेस EpiSCs मैन्युअल संस्कृति पकवान से scraped और E7.5 भ्रूण के अलग अलग साइटों (2A चित्रा) में grafted थे। भ्रूण पूर्व vivo सुसंस्कृत और 24 घंटे के बाद विश्लेषण किया गया। दाता कोशिकाओं का वितरण प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया गया था। दाता कोशिकाओं को शामिल करते हैं, तो वे proliferated और उनके डेरिवेटिव मेजबान भ्रूण (चित्रा 2 बी) के भीतर छितरी हुई है। यह मेजबान भ्रूण (2A चित्रा, और 2 बी) में कुशलता शामिल 10-16 कोशिकाओं से युक्त ग्राफ्ट, तथापि, अधिक कोशिकाओं ग्राफ्टिंग बेहतर chimaerism में परिणाम नहीं करता है कि देखा गया है। इसके बजाय, grafted कोशिकाओं अनिगमित झुरमुटों (चित्रा -2 और 2 डी) का उत्पादन किया।

Electroporation

एक करने के लिएभ्रूण में विशिष्ट साइटों के लिए: ssess हमारे इलेक्ट्रोपोरेशन प्रणाली की क्षमता है, हम GFP व्यक्त प्लास्मिडों (GFP pCAG GFP और pCAG-सीआरई) को जन्म दिया। पिछले एक अध्ययन 11 के अनुरूप, GFP + कोशिकाओं भ्रूण में इलेक्ट्रोपोरेशन (चित्रा 2 ई और 2 जी) के बाद 1-2 घंटा पाया गया। देर आदिम लकीर चरण भ्रूण पर बाहर का आद्यबहिर्जनस्तर कोशिकाओं electroporated रहे थे, लेबल की कोशिकाओं संस्कृति में 24 घंटा (चित्रा 2 ई और 2 एफ) के बाद तंत्रिका बाहरी झिल्ली के लिए योगदान दिया। यह परिणाम gastrulation चरण भ्रूण 17 में आद्यबहिर्जनस्तर कोशिकाओं के नाम से जाना जाता भाग्य नक्शे को अच्छी तरह से मेल खाती है। GFP अभिव्यक्ति प्लाज्मिड E8.5 (2-5 somites) पर आदिम लकीर में electroporated किया गया था जब इसी तरह, GFP + कोशिकाओं देर आदिम लकीर 18 के ज्ञात भाग्य नक्शे के साथ संगत paraxial mesoderm (चित्रा 2 जी और 2H), के लिए योगदान दिया । इसके अलावा, हम electroporated कोशिकाओं से तीनों जनन परतों (चित्रा 2I-कश्मीर) के लिए योगदान मनायाelectroporation प्रक्रिया विवो में सेल व्यवहार समझौता नहीं करता है, सुझाव है कि। हालांकि, हम भी आद्यबहिर्जनस्तर (E7.5) या आदिम लकीर कोशिकाओं (E8.5) को निशाना बनाया गया है, जबकि कुछ अन्तर्जनस्तर कोशिकाओं को भी (चित्रा 3 सी और 1 टेबल) electroporated थे कि देखा।

एक केशिका इलेक्ट्रोड का उपयोग करने का प्रमुख लाभ में से एक electroporated कोशिकाओं की संख्या बस इसके उद्घाटन के व्यास को बदलने के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। Electroporated कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए, भ्रूण electroporation के बाद 2 घंटा तय की और एक confocal खुर्दबीन पर wholemount में imaged थे। GFP + कोशिकाओं की संख्या मैन्युअल confocal जेड ढेर में गिना गया। तालिका 1 से पता चलता है, कि अधिक कोशिकाओं से डीएनए तेज में 20 माइक्रोन से 30 परिणामों से गिलास केशिका के उद्घाटन के आकार में वृद्धि एक दिया चरण के लिए। एक ही छिद्र का आकार (E8.5 बनाम E7.5) चरणों के बीच तुलना में किया गया था, और अधिक कोशिकाओं बाद के चरण में electroporated जा पाए गए। इस आशय E8.5 पर एमनियोटिक गुहा में डीएनए वर्तमान के एक उच्च एकाग्रता की वजह से हो सकता है। डीएनए समाधान हरी भोजन डाई के साथ मिलाया गया था, इसलिए हम एमनियोटिक गुहा में डीएनए एकाग्रता का आकलन करने के लिए हरे रंग का उपयोग कर सकते हैं। माइक्रोस्कोप में, यह E8.5 भ्रूण के साथ तुलना की जाए तो, डीएनए इंजेक्शन के बाद हरे रंग E7.5 भ्रूण की गुहा में बहुत हल्का है, कि स्पष्ट है। डीएनए समाधान का एक ही एकाग्रता E7.5 और E8.5 भ्रूण में इंजेक्ट किया गया था हालांकि, अधिक डीएनए समाधान वे आकार में बड़े होते हैं, क्योंकि यह पूरी तरह से भरने के क्रम में E8.5 भ्रूण की एमनियोटिक गुहा में था। इंजेक्शन सुई वापस लेने के बाद, हमेशा एमनियोटिक गुहा से डीएनए समाधान के रिसाव के कुछ डिग्री नहीं है, और पंचर छेद पहले भ्रूण में एमनियोटिक गुहा के आकार की तुलना में बड़ा है, के बाद से यह अनुपात में अधिक रिसाव था कि वहाँ की संभावना है एक कम डीएनए एकाग्रता के लिए अग्रणी E8.5 भ्रूण से E7.5, से। ट्रांसफ़ेक्ट के विभिन्न संख्याकोशिकाओं को भी विभिन्न चरणों में कोशिकाओं के विभिन्न व्यास या प्रेरित ट्रांसमेम्ब्रेन वोल्टेज (आईटीवी) थ्रेसहोल्ड की वजह से हो सकता है।

इलेक्ट्रोपोरेशन का एक दोष जुड़े कोशिका मृत्यु है। पारंपरिक सोने के लिए इसी प्रकार चढ़ाया या सुई के आकार इलेक्ट्रोड, एक केशिका इलेक्ट्रोड का उपयोग कर इलेक्ट्रोपोरेशन भी कोशिका मृत्यु का कारण बनता है। Electroporation के बाद लक्षित क्षेत्र कोशिका मृत्यु के कुछ डिग्री के इस क्षेत्र में हुआ होगा यह दर्शाता है कि पड़ोसी क्षेत्रों (चित्रा 3 ए और 3 बी) की तुलना में गहरे रंग में दिखाई दिया। आगे electroporation प्रक्रिया की वजह से मृत कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए, भ्रूण एक फ्लोरोसेंट कोशिका झिल्ली-अभेद्य परमाणु डाई के साथ दाग रहे थे। मृत कोशिकाओं के नाभिक एक झिल्ली अभेद्य दूर लाल प्रतिदीप्ति डाई के साथ लेबल रहे थे। धुंधला इस केशिका electroporation तकनीक केवल इलेक्ट्रोपोरेशन स्थल के निकट मृत कोशिकाओं (चित्रा 3 डी और टा की एक छोटी संख्या में परिणाम है कि इस बात की पुष्टिble 1)।

हम मृत कोशिकाओं इलेक्ट्रोपोरेशन साइट पर दिखाई देते हैं, हालांकि GFP + कोशिकाओं और मृत कोशिकाओं को भी एक दूसरे को (3E चित्रा और 3F) से सबसे अनन्य हैं कि देखा। E8.5 पर दुम पार्श्व आद्यबहिर्जनस्तर pCAG GFP और 20μm का एक गिलास केशिका खोलने, GFP + कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के साथ electroporated किया गया था जब इसके अलावा, संस्कृति में 48 घंटा (चित्रा 3 जी और 3 एच) के बाद पता चला था। साथ में ले ली, इन परिणामों सबसे GFP + कोशिकाओं आगे संस्कृति के दौरान अभी भी सक्षम हैं electroporation के बाद 2 घंटा पता लगाया सुझाव देते हैं।

हम 24 घंटे पूर्व vivo संस्कृति बाद GFP + कोशिकाओं की संख्या रन बनाए। छह भ्रूण 20μm व्यास का एक केशिका खोलने का उपयोग, E7.5 पर pCAG GFP के साथ electroporated थे। GFP + कोशिकाओं / भ्रूण पाया गया 107 ± 31 (एसडी ± मतलब है)। संस्कृति (2 घंटा) की शुरुआत में बाद से, 9 कोशिकाओं औसत प्रति भ्रूण पर electroporated थे ( trong> तालिका 1), इस electroporated कोशिकाओं 2 घंटा के भीतर 3-4 डिवीजनों कराना पड़ा कि पता चलता है। E8.5 भ्रूण को E7.5 से समय दोहरीकरण औसत सेल के अलावा उदर नोड 19,20 में उन लोगों से सभी कक्षों में लगभग 6-7 घंटा है। इस electroporation प्रक्रिया सामान्य कोशिकाओं के विकास में बाधा नहीं है कि पता चलता है।

आकृति 1
इलेक्ट्रोपोरेशन सेटअप दिखा चित्रा 1. सर्किट आरेख। इसकी एमनियोटिक गुहा में भ्रूण युक्त डीएनए समाधान दो इलेक्ट्रोड के बीच तैनात किया गया था। चुना मापदंडों पर वर्तमान में एक वर्ग तरंग पल्स जनरेटर (बिजली की आपूर्ति) द्वारा प्रदान किया गया। एक मल्टीमीटर भ्रूण गुजर विद्युत प्रवाह का पता लगाने के लिए श्रृंखला में जुड़ा था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

हमेशा ">:" रख-together.within-पेज = के लिए "jove_content चित्र 2
चित्रा 2. मेजबान भ्रूण में grafted या electroporated कोशिकाओं का वितरण। Wholemount भ्रूण (स्केल) (ए) के brightfield छवियों पर (एएच) GFP प्रतिदीप्ति ओवरले (हरा) 10-16 + GFP EpiSCs एक देर के बाहर का क्षेत्र में grafted थे -streak चरण भ्रूण। (सी) + GFP EpiSCs का एक बड़ा पेड़ों का झुरमुट एक मध्य लकीर चरण भ्रूण के बाहर का क्षेत्र में grafted किया गया था। (बी और डी) में दिखाया मेजबान भ्रूण में EpiSCs ली गई कोशिकाओं (हरा) का वितरण ( एक और संस्कृति में 24 घंटे के बाद सी)। दाता कोशिकाओं के सही एकीकरण का सुझाव मेजबान भ्रूण में छितरी (बी) GFP + कोशिकाओं,। (डी) ग्राफ्टिंग बड़ा सेल झुरमुटों मेजबान भ्रूण में अनिगमित पेड़ों का झुरमुट गठन में हुई। (ई.के.) pCAG-CRE: GFP प्लाज्मिड हाथी wildtype भ्रूण के विशिष्ट क्षेत्रों में ctroporated। एक प्रारंभिक कली चरण भ्रूण (ई) या एक 2-5 विखंड चरण भ्रूण (जी) के आदिम लकीर के बाहर का क्षेत्र electroporating 2 घंटा प्रक्रिया के बाद इन क्षेत्रों में GFP + कोशिकाओं में हुई। (एफ और एच) संस्कृति में 24 घंटे के बाद मेजबान भ्रूण में GFP + कोशिकाओं का वितरण, electroporated कोशिकाओं neuroectoderm (काला तीर) के लिए योगदान दिखा रहा है कि (एफ) और paraxial mesoderm (सफेद तीर) (एच)। (इंद्रकुमार) electroporated कोशिकाओं neuroectoderm (आई) को जन्म दे सकते हैं दिखा रहा है कि GFP + कोशिकाओं के लिए थपका immunostaining, mesoderm (जे) और संस्कृति में 24 घंटे के बाद अन्तर्जनस्तर (जम्मू और कश्मीर)। स्केल पट्टी (एएच) = 250 माइक्रोन; पैमाने पर पट्टी (इंद्रकुमार) 100 माइक्रोन =। नोट: चित्रा 1 ए और 1 बी हमारे पिछले प्रकाशन 4 से reprinted कर रहे हैं।= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53295/53295fig2large.jpg" लक्ष्य = "_blank" href> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
GFP + कोशिकाओं और electroporation के बाद भ्रूण में मृत कोशिकाओं की चित्रा 3. वितरण (एसी) pCAG-CRE:। GFP प्लाज्मिड एक E8.5 की दुम पार्श्व आद्यबहिर्जनस्तर कोशिकाओं में electroporated (2-5 विखंड चरण) भ्रूण (केशिका उद्घाटन आकार :। 20 माइक्रोन) (ए) 2 घंटा प्रक्रिया के बाद, लक्षित क्षेत्र के भ्रूण के अन्य भागों की तुलना में एक काले रंग (सफेद तीर) से पता चला है। इनसेट electroporated क्षेत्र की वृद्धि से पता चलता है। (बी) brightfield छवि (स्केल) electroporated कोशिकाओं (हरा) दिखा हरी फ्लोरोसेंट चैनल के साथ मढ़ा। (सी) एक confocal जेड-टुकड़ा दिखा रहा है किदुम पार्श्व आद्यबहिर्जनस्तर कोशिकाओं को निशाना बनाया गया जब दो अन्तर्जनस्तर कोशिकाओं (हरा) भी प्लाज्मिड ऊपर ले लिया। । सेल नाभिक (डीएफ) pCAG-CRE लाल रंग में दिखाया गया है: GFP प्लाज्मिड एक E8.5 भ्रूण की नोड की दुम पहलू में electroporated किया गया था (केशिका खोलने का आकार: 30 माइक्रोन)। भ्रूण 2 घंटे के लिए संवर्धित किया गया था। Electroporated कोशिकाओं लाल रंग में हरे और मृत कोशिकाओं में दिखाया गया है। (डी) electroporated क्षेत्र GFP + कोशिकाओं के साथ ही मृत कोशिकाओं दोनों शामिल हैं। सफेद बॉक्स में क्षेत्र आगे एक confocal खुर्दबीन में विश्लेषण किया गया था। Z ढेर के मैनुअल गिनती 33 + GFP कोशिकाओं और इस क्षेत्र में 23 मृत कोशिकाओं रहे थे कि पता चला है। केवल दो कोशिकाओं दोनों fluorophores के लिए सकारात्मक दोनों थे। (ई और एफ) GFP + कोशिकाओं मृत कोशिकाओं से अलग कर रहे हैं दिखा डी में सफेद बॉक्सिंग क्षेत्र से एक confocal जेड-टुकड़ा के xyz देखें। नाभिक नीले रंग में दिखाया गया है (जी और एच) pCAG-CRE:। GFP प्लाज्मिड कुछ सेल में electroporated थाएक E8.5 भ्रूण की दुम पार्श्व आद्यबहिर्जनस्तर में रास (केशिका खोलने का आकार: 20 माइक्रोन) और दो ​​(जी) और 48 (एच) घंटे पूर्व vivo संस्कृति नोट के बाद imaged: (एच) भ्रूण संस्कृति के बाद दो में कटे थे। सिर और दिल के क्षेत्रों से हटा दिया गया। स्केल पट्टी (ए, बी, डी, जी और एच) = 250 माइक्रोन; पैमाने पर पट्टी (सी, ई और एफ) = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

केशिका ट्यूब के उद्घाटन का व्यास भ्रूण अवस्था Electroporation दक्षता: नहीं। 2 एच / कुल बाद GFP + कोशिकाओं से युक्त भ्रूण। के electroporated भ्रूण (सं। 24 या 48h संस्कृति के बाद सामान्य रूप से विकसित किया है कि + भ्रूण GFP) एसडी ± भ्रूण प्रति GFP की औसत संख्या + कोशिकाओं (एन = नहीं। जांच भ्रूण का) की संख्याएसडी ± प्रत्येक भ्रूण प्रति + GFP endodermal कोशिकाओं (एन = नहीं। जांच भ्रूण का)
20μm E7.5 (रास-पौंड) 7/9 (7) 9 ± 3 (एन = 4) 4 ± 2 (एन = 4)
30μm E7.5 (रास-पौंड) / 15 (12) 13 17 ± 2 (एन = 4) 6 ± 1 (एन = 4)
20μm E8.5 (2-5 somites) / 13 (10) 12 21 ± 4 (एन = 4) 11 ± 4 (एन = 4)
30μm E8.5 (2-5 somites) 02/02 (2) 33 और 26 (एन = 2) 14 और 16 (एन = 2)

PCAG-CRE की तालिका 1. Electroporation दक्षता: माउस भ्रूण में GFP प्लाज्मिड।
संक्षिप्त: रास, देर आदिम लकीर चरण; पौंड: देर कली मंच। भ्रूण के अनुसार मंचन कर रहे हैंचढ़ाव और डेविस 12

Discussion

कलम बांधने का काम

सेल ग्राफ्टिंग प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण कदम पेड़ों का झुरमुट के गोलमाल से बचने के लिए, आदर्श एक एकल कार्रवाई में कोशिकाओं का एक सुसंगत स्ट्रिंग की प्रविष्टि है। इस तकनीक को मुँह पिपेट को नियंत्रित करने में कुछ अभ्यास की आवश्यकता है। दाता कोशिकाओं की मेजबानी में अच्छी तरह से शामिल हैं, तो उनके डेरिवेटिव भ्रूण में फैलाने जाएगा। आगे छितरी दाता ली गई कोशिकाओं की मेजबानी में उचित रूप से अंतर क्या यह निर्धारित करने के लिए, immunostaining भ्रूण वर्गों पर प्रदर्शन किया जा सकता है। दाता कोशिकाओं मेजबान वातावरण के साथ संगत नहीं कर रहे हैं, वे या तो पता चला (वे भ्रूण से निष्कासित कर दिया जाता है) या संस्कृति के बाद भ्रूण में अनिगमित clumps फार्म नहीं किया जा सकता। छितरी हुई कोशिकाओं और सेल झुरमुटों दोनों मनाया गया है, तो यह भी है कि कई कोशिकाओं grafted थे संकेत हो सकता है और आसपास के मेजबान कोशिकाओं के साथ बातचीत नहीं कर सकते हैं जो अत्यधिक दाता कोशिकाओं पेड़ों का झुरमुट गठन में हुई। इस मामले में, अतिरिक्त ग्राफ्ट युक्तकोशिकाओं की एक छोटी संख्या में प्रदर्शन किया जा सकता है।

सेल ग्राफ्टिंग तकनीक की प्रमुख सीमा है कि यह अब से 48 घंटा हासिल नहीं किया गया है अवधि में माउस पूर्व vivo संस्कृति के बाद से कोशिकाओं से भरा इन विवो क्षमता का निर्धारण करने के लिए संभव नहीं है। अल्ट्रासाउंड निर्देशित सेल इंजेक्शन के साथ संयुक्त हालांकि, अगर यह गर्भाशय में भ्रूण को सुसंस्कृत कोशिकाओं को हस्तांतरण करने के लिए संभव हो सकता है। सेल ग्राफ्टिंग प्रयोगों व्यापक रूप से हमारे समूह में इस्तेमाल किया गया है और हमें विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं 4,21,22 के vivo क्षमता के बारे में महत्वपूर्ण सुराग दे दिया है, संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए। यह जल्दी postimplantation भ्रूण में इन विट्रो संवर्धित कोशिकाओं के vivo क्षमता का आकलन करने के लिए सामान्य उपयोगिता की एक तकनीक है।

Electroporation

इस अध्ययन में हम केवल पता चला है हालांकि यह मैं आद्यबहिर्जनस्तर लक्षित करने के लिए केशिका electroporation तकनीक का उपयोग करने के लिए कुशल है किटी जानबूझकर ऐसे अन्तर्जनस्तर कोशिकाओं के रूप में अन्य रोगाणु परतों को लक्षित करने के लिए भी संभव है। केशिका electroporation तकनीक के लिए महत्वपूर्ण कदम पीबीएस जल्दी माउस भ्रूण के लिए बहुत suboptimal है के बाद से प्रत्येक भ्रूण (भ्रूण प्रति <5 मिनट) electroporate करने में लगने वाले समय को कम करने के लिए है। हमारे आंकड़े से ऊपर भ्रूण में अधिकांश क्षेत्रों में, electroporation भ्रूण के विकास को प्रभावित नहीं करता है, कि दिखाया गया है। हालांकि, नोड में इलेक्ट्रोपोरेशन असामान्य विकास के कारण होता है और भ्रूण की अकाल मृत्यु का नेतृत्व किया। इस वजह से महत्वपूर्ण संकेत दे केन्द्रों 23 कि फार्म कोशिकाओं की क्षति या मृत्यु होने की संभावना है। इसलिए, इस क्षेत्र में इस तकनीक के साथ से परहेज करना होगा। एक और चेतावनी परिणाम अनुभाग में उल्लेख किया है आद्यबहिर्जनस्तर या आदिम लकीर कोशिकाओं को निशाना बनाया गया है, जबकि, कुछ अन्तर्जनस्तर कोशिकाओं को भी electroporated थे, कि है। डीएनए आद्यबहिर्जनस्तर उपकला के तहत अंतराल के माध्यम से अन्तर्जनस्तर के लिए पहुंचता है, क्योंकि यह हो सकता है। अन्तर्जनस्तर उपकला कोशिकाओं से बना है और वें हमारे अनुभव में हैese कोशिकाओं के डीएनए को लेने के लिए एक उच्च प्रवृत्ति है। भाग्य मानचित्रण के लिए इस तकनीक को लागू इसलिए, जब यह शुरू में डीएनए हाथ में ले लिया है, जो कोशिकाओं का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है।

GFP प्लास्मिडों कुशलता से इस अध्ययन में दिखाया इलेक्ट्रोपोरेशन मापदंडों का उपयोग कर दिया जा सकता है, अन्य डीएनए निर्माणों की दक्षता में भिन्न है और व्यक्तिगत अनुकूलन की जरूरत हो सकती है: यह भी pCAG GFP और pCAG-CRE हालांकि कि ध्यान दिया जाना चाहिए। प्लास्मिडों transfect करने के लिए मुश्किल हो पाए जाते हैं, तो डीएनए एकाग्रता, इलेक्ट्रोपोरेशन वोल्टेज या दालों की संख्या में बदलाव किया जा सकता है।

सीमित कोशिका मृत्यु के साथ भ्रूण में एक बहुत कुछ कोशिकाओं में GFP प्लास्मिडों: संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, हमारे अनुकूलित केशिका इलेक्ट्रोपोरेशन प्रणाली कुशलतापूर्वक और reproducibly GFP या रचनात्मक वितरित कर सकते हैं। इस विधि महंगा या अति विशिष्ट उपकरण की आवश्यकता नहीं है, यह सेल ट्रैकिंग की पढ़ाई के लिए या अस्थानिक अभिव्यक्ति या सशर्त विलोपन ओ के प्रभाव का परीक्षण करने में बहुत काम का हो सकताजल्दी भ्रूण में च जीन, यदि इलेक्ट्रोपोरेशन floxed सशर्त उत्परिवर्ती alleles ले जाने के भ्रूण में किया जाता है। इसलिए, इस electroporation तकनीक स्थानीयकृत wildtype भ्रूण वातावरण के संदर्भ में एक सेल-दर-सेल आधार पर सेल आंतरिक कारकों की भूमिका को समझने के लिए एक उपयोगी कार्यात्मक उपकरण प्रदान करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps Dumostar T5390
Dissecting stereomicroscope   Zeiss Stemi 2000-C
Stereomicroscope system with fluorescence  Nikon AZ100
Inverted microscope with a digital camera Olympus Olympus BX61
Inverted confocal microscope  Leica Microsystems Leica TCS SP8
Low melting point agarose  Life Technologies 16520-050
Pasteur pipettes Fisher Scientific 11397863
30mm Petri dishes  Fisher Scientific 121V
4-well plates Thermo scientific 179820 
M2 medium  Sigma-Aldrich M7167
Phosphate Buffered Saline (PBS) Life Technologies 10010015 
Paraformaldehyde (PFA)  Sigma-Aldrich P6148
Pipettes  NICHIRYO Nichipet
tips  Greiner Bio One 685280
Cell culture incubator  SANYO MCO-17AIC
Roller culture apparatus  BTC Engineering
Syringe filters 0.45µm, sterile  Sigma-Aldrich 10462100
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) Sigma-Aldrich G5154
non-essential amino acids (NEAA) Life Technologies 11140050
L-glutamine Fisher Scientific SH30549.01
Sodium pyruvate solution Fisher Scientific SH30239.01
Penicillin and Streptomycin 10.000UI/ml Lonza DE17-602E
Gas Cartridge for Portable Meker Burner COLEMAN  COLEMAN 250
Thin Wall Borosilicate Capillary Glass with Fillament, OD 1.0 mm, ID 0.78 mm Harvard Apparatus 640798
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes  Sigma-Aldrich A5177-5EA 
Flaming/Brown micropipette puller  Sutter Instrument Company P-97 
Microforge  De Fonbrune BS030301
Pneumatic pico pump  World Precision Instruments PV830
Microloader tips  Eppendorf 5242956.003
ECM 830 square wave pulse generator  BTX 45-0002
Green food coloring dye Sigma-Aldrich C.I. 42053
A far-red cell membrane-impermeable nuclear dye Biotium 40060-T
pCAG-Cre:GFP  Addgene #13776 
pCAG-GFP  Addgene #16664
Multimeter Excel XL830L
Micromanipulators  Leitz 
0.2mm diameter platinum wire  Agar Scientific E404-2
Anti-GFP antibody Abcam ab13970
Goat anti-Chicken IgY, HRP Santa Cruz sc-2428
Liquid DAB+ Substrate Chromogen System  Dako K3467
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Life Technologies D21490
A far-red fluorescence nuclear counterstain Life Technologies T3605

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 106 ग्राफ्टिंग इलेक्ट्रोपोरेशन postimplantation माउस आद्यबहिर्जनस्तर स्टेम सेल EpiSC भ्रूण संस्कृति
प्रारंभिक Postimplantation माउस भ्रूण में कोशिकाओं या डीएनए के ठीक स्थानीय स्थानांतरण के लिए तरीके
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Huang, Y., Wilkie, R., Wilson, V.… More

Huang, Y., Wilkie, R., Wilson, V. Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (106), e53295, doi:10.3791/53295 (2015).

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