Abstract
Manipulation och kultur av tidiga musembryon är en kraftfull men ändå till stor del underutnyttjade teknik öka värdet av detta modellsystem. Omvänt har cellodling använts i stor utsträckning i utvecklingsbiologiska studier. Det är emellertid viktigt att fastställa om in vitro-odlade celler representerar verkligen in vivo celltyper. Ympning celler i embryon, följt av en bedömning av deras bidrag under utvecklingen är en användbar metod för att bestämma potential in vitro odlade celler. I denna studie beskriver vi en metod för ympning celler i ett definierat ställe av tidig postimplantationsförlust musembryon, följt av ex vivo-odling. Vi introducerar också en optimerad elektroporering metod som använder glaskapillärer av känd diameter, som möjliggör exakt lokalisering och anpassning av antalet celler som får exogent DNA med både hög transfektionseffektivitet och låg celldöd. Dessa tekniker, som inte kräver någon specialized utrustning, gör experimentella manipulationer av gastrulation och tidiga organogenesen stadium musembryo möjligt att tillåta analys av engagemang i odlade cellsubpopulationer och effekten av genetiska manipulationer in situ på celldifferentiering.
Introduction
Cellodling har använts i stor utsträckning i utvecklingsbiologi studier. Mouse embryonala stamceller (ESC) och epiblast stamceller (EpiSCs) kan differentiera till alla tre groddblad in vitro och är en användbar modell för celldifferentiering i början av däggdjur embryogenes. Härledningen av dessa cellinjer har öppnat en möjlighet för in vitro-manipulation och detaljerad utredning av lokal signaleringshändelser och transkriptions nätverk som verkar under tidig foster mönstring. Det är dock fortfarande viktigt att bestämma relevansen av eventuella manipulationer som utförs i odling in vivo. Har bedömts in vivo potential preimplantationsembryot härrörande mus ekonomiska och sociala råd genom att införa dem tillbaka till preimplantatorisk embryon (morulae eller blastocyster) 1. Men EpiSCs som representerar epiblasten celler i postimplantationsförlust embryon kan inte integreras effektivt i preimplantatorisk embryon 2,3. Vår previooss rön har visat att EpiSCs effektivt kan generera chimärer och bidra till alla groddblad när ympas in postimplantationsförlust embryon 4. Således är det bästa sättet att utvärdera de odlade cellerna in vitro för att introducera dem till deras motsvarande miljö in vivo.
Elektroporation är en allmänt använd metod för att leverera exogena molekyler in i målceller i både in vivo- och in vitro-experiment. Elektrisk energi kan generera ett stort antal porer i cellmembranet, vilket möjliggör exogen deoxiribonukleinsyra (DNA) eller ribonukleinsyra (RNA) att komma in i cellerna. En av de största utmaningarna för denna teknik är att kombinera optimal cellviabilitet med hög electrotransfection effektivitet 5,6. För elektroporering av nukleinsyror i embryonala vävnader, guldpläterade elektroder har oftast använts, så att målsökning av celler i ett brett rumslig intervall 7-9. För att uppnå en mer locaseras genöverföring har en nål formad elektrod använts för att uppnå en samlingspunkt elektriskt fält 10,11. Med användning av denna metod, de författare visade att efter elektroporering, hade cirka 30-60 celler tas upp DNA-konstruktionen 11. Ändå verkar det som exakt justera antalet elektroporerade celler fortfarande svårt med en fast bredd elektrod. Den kapillära elektroporering teknik har använts för att leverera plasmider till enstaka celler 12-14. Emellertid har denna teknik inte sökts electroporating plasmider att embryon ex vivo. På senare tid har en mikroanordning rapporterats lokalt electroporate några distala viscerala endoderm celler (mindre än 4 celler) i början av postimplantationsförlust musembryon 15. Emellertid är det fortfarande okänt om denna anordning effektivt kan rikta ektoderm och mesoderm ex vivo.
I denna studie beskriver vi två nya metoder för att bedöma cellulära och geners funktion i början av inlägget-implantation embryon. Vi visar först hur man ympa in vitro odlade celler i definierade platser i tidiga musembryon att bedöma deras in vivo potential. Integrationen av de transplanterade cellerna och deras ättlingar, alla märkt av en genetisk tagg (t.ex. ett grönt fluorescerande protein (GFP), kan undersökas ytterligare genom immunfärgning av vävnadsspecifika proteiner 4. För det andra, beskriver vi en förbättrad metod att exakt leverera DNA till lokaliserade ställen i embryot via elektroporering. Istället för att använda en nål formad elektrod, satte vi in en tunn tråd inuti en spetsig glaskapillär, och visa att denna modifiering kan leverera DNA till ett litet antal celler med hög effektivitet och begränsad celldöd. Dessutom visar vi att med hjälp av glaskapillärer med olika öppningsstorlekar, kan vi styra antalet elektroporerade celler. Därför anser vi att denna metod kan vara till stor nytta för att studera tidig embryonal mönstring som involverar ett litet antal of celler.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med brittiska inrikesdepartementet förordningar som anges i Djur (vetenskapliga förfaranden) Act (1986) under projektlicens nummer 60/4435. För att samla embryon vid specifika utvecklingsstadier, var tidsinställda parningar inrättat O / N. Middagstid på dagen för att finna en vaginal plugg betecknades embryonala dag (E) 0,5.
1. dissekera E7.5 eller E8.5 postimplantationsförlust embryon för ex vivo kultur
- Offra dräktiga möss genom cervikal dislokation.
- Isolera livmodern med sax, håller den med pincett och placera i en 30 mm skål fylld med M2-medium.
- Försiktigt riva isär myometrium med två par fina pincett.
- Skala bort decidua, är noga med att inte punktera extraembryonic hålrum.
- Avlägsna Reichert membran genom att klämma den med pincett och långsamt som avskiljer den från embryot.
- Kontrollera embryona under en dissekerastereomikroskop för att säkerställa att gulesäcken, amnion och ectoplacental kon är intakta.
- Överför embryon till en ren maträtt av M2 med hjälp av en pipett och placera på en 30 mm plast petriskål locket på is (den "ice-plattformen") till delvis chill embryon.
- Om det behövs, lagra embryon i M2 på en is plattform för upp till 1,5 timmar, t ex., Under medie beredning eller manipulation av små partier av ~ 3-4 embryon vid RT.
Obs: Återvinning och dissektion av gnagare embryon har beskrivits i detalj tidigare 7,8,16.
2. Förbered Embryo Culture Medium
- Färskt tina antingen kommersiellt tillgängliga råttserum (se Glanville-Jones et al. 13 för specifikationer) eller råttserum framställd i egen regi enligt Copp och Cockroft 16 som värmeinaktiverades under 30 minuter vid 56 ˚C och frystes i 1 ml alikvoter vid -80 ˚C
Obs: Kommersiellt tillgängliga råttserum är acceptabelt för kulturperioder 24-36 timmar, även om serum som framställts i egen regi är, enligt vår erfarenhet, överlägsen för kulturperioder upp till 48 timmar. - Färskt förbereda ett överskott (t ex., 10 ml) av definierade tillskott bestående av Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM), 1% icke-essentiella aminosyror (NEAA), 2 mM L-glutamin och 1 mM natriumpyruvat.
- Beräkna volymen av odlingsmedium som behövs i enlighet med antalet av embryon från varje steg som kommer att odlas (se avsnitt 3). Blanda råttserum med de definierade tillskott för att kompensera 50% odlingsmedium (1: 1 (volym / volym) råttserum: definierade tillägg) och / eller 75% odlingsmedium (3: 1 (volym / volym) råttserum: definierad tillägg).
- Passera embryot odlingsmediet genom ett 0,45 pm filter och tillsätt 10 tusen IE / ml penicillin och 10 | ig / ml streptomycin.
Obs: färskt tinade L-glutamin och natriumpyruvat lösning är avgörande för embryoutveckling under ex vivo-kultur.
- För E7.5 embryon: statisk odling med användning av 4-brunnsplattor i en inkubator som medföljer 5% CO2 i luft vid 37 C under 24 timmar. Kultur upp till två embryon per brunn i 1 ml 50% odlingsmedium.
- För E8.5 embryon: använda en vals Odlingsapparat 8 roterar med 35 varv / min som innefattar kontinuerlig gasning med 5% CO2 i luft vid 37 C under 24 h (1 ml 50% odlingsmedium per embryo).
- För E9.5 embryon: använda en vals Odlingsapparat som roterar med 35 varv / min som innehåller gaser som levereras med 5% CO2, 40% O2 55% N2 vid 37 C under 24 h (1 ml 75% odlingsmedium per embryo).
Obs: embryon kultur inom 3 timmar efter euthanizing mössen som långa perioder i M2 påverka utvecklingen. Se Copp och Cockroft 16 för beräkning av ex vivo embryoodling.
4. Grafting odlade celler till E7.5 eller E8.5 musembryon
- Fysiskt skrapa EpiSCs, som ubiquitously uttrycker GFP, från en 6-brunnsodlingsplatta med hjälp av en 20-200 mikroliter pipettspets och placera dem i en 30 mm maträtt som innehåller embryon
Obs: Om du vill infoga cellklumpar i embryon, bör cellerna fysiskt skrotas istället för trypsin. - Bifoga en hand drog ympning kapillär till sugröret att göra en mun pipett.
- Suga försiktigt munnen pipetten för att dra en eller flera cellklumpar storlek> 20 celler i ympning kapillär.
- Blås försiktigt ut cellerna, att delvis sprida stora klumpar.
- Välj en cell klump innehållande ~ 10-20 celler och suga in i ympning kapillär igen, hålla det nära till öppnandet av kapillär. Vara noga med att inte flytta cell klump in och ut ur kapillären upprepade gånger, för att undvika att bryta upp i mindre bitar.
- Håll embryot löst på plats med en pincett och sätt i ympningkapillär in i regionen av intresse för att skapa en öppning.
- Utvisa försiktigt klump ur ympning kapillär, lämnar kort sträng av 10-20 celler som lämnats in i embryot.
- Upprepa ympning förfarande för det önskade antalet embryon. Använd satsstorlekar på 3-4 embryon för enkelhetens skull.
- Lämnar embryon i samma maträtt av M2-medium, bild de ympade embryon med hjälp av en fluorescensförening dissekera mikroskop med kamera, hålla avbildningstiden till ett minimum för att undvika exponering av embryon till starkt ljus och värme.
Obs: Bestäm avbildningstider empiriskt eftersom de är beroende på specifikationerna för kameran och mikroskop samt arten och fluorescensintensiteten hos fluoroforen. - Överföra embryot i en pastette med en minimal volym av M2-medium för att förekvilibrerats odlingsmedium (se avsnitt 3) omedelbart efter avbildning.
Obs: Noggrant undersöka morfologin av embryon efter ympning. Endast kulturen intact embryon.
5. Handgjorda Elektroporation Material och apparater Setup (Förbered Efter Inför Elektroporation Experiment):
- För injektions DNA pipetter: dra injektions DNA pipetter med hjälp av en horisontell mikropipett avdragare. Injektionspipetter bör ha en fin spets med en öppning mindre än 10 | am för att undvika vävnadsskada vid insprutning av DNA i de embryonala hålrum.
- För glaskapillär elektroporering: Använd en microforge för att skära öppnandet av DNA-injektion pipetter till en inre diameter på antingen 20 eller 30 pm. För att undvika cellskador när kapillären står i kontakt med embryot för elektroporering, måste spetsen på glaskapillär skäras rent och inte innehålla vassa, brutna kanter.
- För handgjorda kapillär elektrod (anod) (Figur 1): Sätt ett 0,2 mm diameter platinatråd i en elektro glaskapillär med en fast öppning av 20 eller 30 um diameter för att fokusera utvaldaric ström och levererar plasmid-DNA till ett litet område av intresse i embryot.
- För handgjorda L-formad elektrod (katod) (Figur 1): böja ett 0,2 mm platinatråd med diametern skapa en "L" -form, med den horisontella delen av "L" runt 1 mm i längd.
- Fäst varje platinaelektrod till en tunn isolerad tråd och sätt in det i en mikroinjektion nålhållare omfattas av isoleringstejp.
- Montera nålhållare på mikromanipulation instrumenthållare standard.
- Anslut kretsen som visas i figur 1: anslut kapillären elektroden till anoden hos strömförsörjningen; ansluta den L-formade elektrod till anoden hos multimetern; ansluter katoden hos mulimeter till katoden hos strömförsörjningen.
6. Elektroporation E7.5 eller E8.5 musembryon
- Fyll elektroporation glaskapillär med PBS till inom 1-2 mm av toppen och för in straiGHT platinaelektrod (anod) in i glaset kapillären tills den når botten av kapillären.
- Förankra den L-formade elektrod (katod) på ytan av en 30 mm petriskål fylld med PBS.
- Överför embryo från M2-medium i PBS-fyllda elektroporering skålen.
- För in injektionsnålen i sidled epiblast i fostervattenhålan av embryot. Med hjälp av en pneumatisk pico pump, injicera DNA-lösning (pCAG-Cre: GFP eller pCAG-GFP 1-1,5 pg / ml med 0,01% grön karamellfärg färg) in i kaviteten tills den är helt full. För E7.5-E8.5 embryon krävs mindre än 5 l DNA-lösning för ett embryo. Använda grönt färgämne som en indikator, vara noga med att inte brista embryot.
- Sätt försiktigt embryot mellan elektroderna och flytta kapillära elektroden till den exakta platsen där DNA ska levereras.
Obs: Orienteringen av embryot beror på regionen där DNA är som ska elektroporeras. - Electropogradera embryot användning av 200 volt (V) i 6 pulser, var och en av 50 ms varaktighet med en 1 sek intervall mellan varje puls.
- Överför embryo till förekvilibrerats odlingsmedium omedelbart efter elektroporering. Om så önskas, upprepa processen för nästa embryot.
Obs: Lägg till odlingsmediet i en steril behållare och placera den i kulturen inkubatorn att i förväg jämvikt mediet. - För att upptäcka electroporated celler 2 h efter odling, överföra embryon till en ren 30 mm petriskål av M2-medium med hjälp av en pastette. Bild embryona som i steg 5.9 med hjälp av en fluorescensförening dissekera mikroskop.
- Överföra embryon tillbaka till kultur med användning av en pastette omedelbart efter bildalstring.
- För att detektera döda celler förorsakade genom elektroporation, färga embryon med en långt röd cellmembran ogenomträngligt nukleär färgämne (1: 200 i embryoodlingsmedium) vid 37 C under 10 minuter 2 timmar efter elektroporering (Valfritt)
- För att räkna elektroporerade cellerna, fixa embryos i 4% paraformaldehyd (PFA) för 2-4 timmar vid 4 ° C, färga kärnan med en ultraviolett eller långt rött fluorescerande nukleär motfärg och bild embryon med hjälp av en konfokalmikroskop (tillval).
Obs: embryonala tillväxten påverkas negativt om de lämnas för länge i PBS. Se därför till att den tid det tar att electroporate varje embryo minimeras (<5 min per embryo).
Representative Results
Ympning
EpiSCs som ubiquitously uttrycker EGFP (r04-GFP, som härrör från E6.5 epiblast, och C2, erhållna in vitro från mESCs) 4 ades manuellt skrapas bort från odlingsskålen och ympade in i olika områden av E7.5-embryon (figur 2A). Embryona odlades ex vivo och analyserades efter 24 timmar. Fördelningen av givarceller bestämdes genom fluorescensmikroskopi. Om givarceller inkorporerade, prolifererade de och deras derivat dispergerade i värdembryon (Figur 2B). Det har observerats att transplantat innehållande 10-16 celler inkorporerade effektivt i värd embryon (figur 2A, och 2B), dock ympning flera celler inte resulterar i bättre chimaerism. Istället transplanterade cellerna producerade oregistrerade klumpar (Figur 2C och 2D).
Elektroporering
Till enssess effektiviteten i vårt elektroporering systemet, levererade vi GFP-uttryckande plasmider (pCAG-GFP och pCAG-Cre: GFP) till specifika platser i embryot. I överensstämmelse med en tidigare studie 11 var GFP + celler detekterades i embryon 1-2 h efter elektroporering (figur 2E och 2G). När distala epiblast celler vid slutet av primitivstrimman skede embryo var elektro, märkta celler bidrog till det neurala ektoderm efter 24 timmar i kultur (Figur 2E och 2F). Detta resultat stämmer väl överens med kända öde kartor över epiblast celler i gastrulation skede embryon 17. Likaså när GFP expressionsplasmiden elektroporerades i primitivstrimman på E8.5 (2-5 somiter), GFP + celler bidrog till det paraxiella mesoderm (figur 2G och 2H), i överensstämmelse med kända öde kartor över det sena primitivstrimman 18 . Dessutom observerade vi bidrag till alla tre groddblad från elektroporerade celler (Figur 2I-K),vilket tyder på att elektroporering förfarandet inte äventyrar cellens beteende in vivo. Men vi märkte också att även epiblast (E7.5) eller primitivstrimman celler (E8.5) riktade, några endoderm celler även elektro (figur 3C och tabell 1).
En av de stora fördelarna med att använda en kapillär elektrod är att antalet elektroporerade cellerna kan styras, helt enkelt genom att ändra diametern hos dess öppning. För att bestämma antalet elektroporerade celler, embryon fast 2 timmar efter elektroporering och avbildas i wholemount på en konfokalmikroskop. Antalet GFP + celler manuellt räknades i konfokala z-stackar. Tabell 1 visar att, för ett givet stadium, vilket ökar öppningsstorleken av glaskapillären från 20 till 30 | j, m resulterar i DNA-upptag av flera celler. När en enda öppning storlek jämfördes mellan stegen (E7.5 kontra E8.5), har fler celler visat sig vara elektroporeras vid senare skede. Denna effekt kan bero på en högre koncentration av DNA närvarande i fostervattenhålan på E8.5. Eftersom DNA-lösningen blandades med den gröna livsmedelsfärg, kan vi använda den gröna färgen för att bedöma DNA-koncentrationen i fostervattenhålan. I mikroskopet, är det uppenbart att, jämfört med E8.5 embryon, den gröna färgen efter DNA-injektion är mycket lättare i kaviteten av E7.5 embryon. Fastän samma koncentration av DNA-lösning injicerades i E7.5 och E8.5 embryon, mer DNA-lösningen fanns i fostervattenhålan av E8.5 embryon i syfte att fylla den helt eftersom de är större i storlek. Dra ut injektionsnålen, finns det alltid en viss grad av läckage av DNA-lösning från fostervattenhålan, och eftersom punktionshålet är större i jämförelse med storleken av fostervattenhålan i tidigare embryon, är det troligt att det fanns proportionellt mer läckage från E7.5 än E8.5 embryon, vilket leder till en lägre DNA-koncentration. Den olika antal transfekteradeceller kan också bero på att de olika diametrar eller inducerade trans spänning (ITV) trösklar av celler i olika skeden.
En nackdel med elektroporation är den associerade celldöden. I likhet med den traditionella guldpläterade eller nålformade elektroder, elektroporering med användning av en kapillär elektrod orsakar också celldöd. Efter elektroporering målområdet dök mörkare i färgen jämfört med grannregionerna (Figur 3A och 3B), vilket tyder på att en viss grad av celldöd måste ha inträffat inom detta område. För att ytterligare bestämma antalet döda celler som orsakas av elektroporation förfarande framställdes embryon färgades med en fluorescerande cellmembran ogenomträngligt nukleär färgämne. Kärnorna av döda celler märktes med ett membran-ogenomtränglig långt röd fluorescens färgämne. Färgningen bekräftat att detta kapillär elektroporering teknik resulterar endast i ett litet antal döda celler nära elektroporering plats (figur 3D och Taligt en).
Vi märkte att även döda celler visas på elektroporering plats, GFP + celler och döda celler är också mest exklusiva från varandra (Figur 3E och 3F). Dessutom, när den kaudala sido epiblast på E8.5 var elektro med pCAG-GFP och ett glas kapilläröppning av 20 ^ m, ett stort antal GFP + celler detekterades efter 48 timmar i kultur (figur 3G och 3H). Sammantaget tyder dessa resultat på de flesta GFP + celler upptäcktes två timmar efter elektroporering är fortfarande lönsamt under ytterligare odling.
Vi gjorde antalet GFP + celler efter 24 h ex vivo kultur. Sex embryon elektro med pCAG-GFP på E7.5, med hjälp av en kapillär öppning 20 ^ m diameter. 107 ± 31 (medelvärde ± SD) GFP + celler / embryo detekterades. Sedan i början av kulturen (2 timmar), har 9 celler elektro i genomsnitt per embryo (
Figur 1. Kretsschemat visar elektroporation installationen. Embryot innehåller DNA-lösningen i dess fostervattenhålan placerades mellan de två elektroderna. Ström vid de valda parametrarna tillhandahölls av en fyrkantpulsgenerator (strömförsörjning). En multimeter anslöts i serie för att detektera den elektriska ström som passerar embryot. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Fördelningen av ympade eller electroporated celler i embryon värd. (AH) GFP fluorescens över (grön) på bright bilder av wholemount embryon (gråskala) (A) 10-16 GFP + EpiSCs transplanterades in i den distala regionen av ett sent -streak skede embryo. (C) En större klump av GFP + EpiSCs ympades i den distala regionen av en mid-strimma stadiet embryo. (B och D) Fördelningen av EpiSCs härledda celler (grön) i värd embryon (visad i A och C) efter 24 h i kultur. (B) GFP + celler dispergerade i värdembryo, vilket tyder på korrekt integrering av givarcellema. (D) Ympning större cellklumpar gav unincorporated klump-bildning i värden embryot. (EK) pCAG-Cre: GFP plasmid ele ctroporated till specifika områden av vildtyp embryon. Electroporating den distala regionen av en tidig knoppstadiet embryot (E) eller primitivstrimman av en 2-5 somit skede embryo (G) resulterade i GFP + celler i dessa områden 2 h efter ingreppet. (F och H) Fördelningen av GFP + celler i värd embryon efter 24 timmar i kultur, vilket visar att elektroporerade celler bidrar till neuroectoderm (svart pil) (F) och paraxiella mesoderm (vit pil) (H). (IK) DAB-immunofärgning för GFP + celler som visar att de elektroporerade cellerna kan ge upphov till neuroectoderm (I), mesoderm (J) och endoderm (J och K) efter 24 h i kultur. Skalstreck (AH) = 250 pm; skala bar (IK) = 100 nm. Obs: Figur 1A och 1B är omtryckt från vår tidigare offentliggörande 4.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53295/53295fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Fördelning av GFP + celler och döda celler i embryon efter elektroporering (AC) pCAG-Cre. GFP plasmid elektro i stjärtfenan sido epiblast celler i en E8.5 (2-5 somit stadiet) embryo (kapilläröppning storlek :. 20 ^ m) (A) 2 tim efter proceduren, visade målområdet en mörk färg (vit pil) jämfört med andra delar av embryot. Infällda bilden visar en förstoring av electroporated regionen. (B) Brightfield bild (gråskala) belagd med det grönt fluorescerande kanalen som visar elektroporerade celler (grön). (C) A konfokala z-skiva som visar atttvå endoderm celler (gröna) tog också upp plasmiden när stjärtfenan sido cellerna epiblast var riktade. De cellkärnor visas i rött (DF) pCAG-Cre. GFP plasmid elektro i den bakre aspekten av nod i ett E8.5 embryo (kapilläröppning storlek: 30 pm). Embryot odlades under 2 timmar. Electroporated celler visas i grönt och döda celler i rött. (D) Den elektro området innehåller både GFP + celler samt döda celler. Området i den vita rutan analyserades ytterligare i ett konfokalt mikroskop. Manuell räkning av z-stack visade att det fanns 33 GFP + celler och 23 döda celler i detta område. Bara två celler var både positiva för båda fluoroforer. (E och F) XYZ av en konfokal z-skiva från den vita boxed regionen D visar GFP + celler är skilda från de döda cellerna. Kärnorna visas i blått (G och H) pCAG-Cre:. GFP-plasmid elektroporerades in några cells i den bakre sido epiblast av en E8.5 embryo (kapilläröppning storlek: 20 pm) och avbildas efter två (G) och 48 (H) timmar ex vivo kultur Obs: (H) Embryot bröts i två delar efter odling. Huvud- och hjärt regioner togs bort. Skalstreck (A, B, D, G och H) = 250 | im; skala bar (C, E och F) = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Diameter för öppning av kapillärröret | Embryostadiet | Elektroporation verkningsgrad: nej. embryon innehållande GFP + celler efter 2 h / totalt antal. av electroporated embryon (no. GFP + embryon som utvecklades normalt efter 24 eller 48 timmar kultur) | Medelantalet GFP + celler per embryo ± sd (n = nej. Av undersökta embryon) | AntalGFP + endodermala celler per varje embryo ± sd (n = nej. Av undersökta embryon) |
| 20 | im | E7.5 (LS-LB) | 09/07 (7) | 9 ± 3 (n = 4) | 4 ± 2 (n = 4) |
| 30 ^ m | E7.5 (LS-LB) | 13/15 (12) | 17 ± 2 (n = 4) | 6 ± 1 (n = 4) |
| 20 | im | E8.5 (2-5 somiter) | 12/13 (10) | 21 ± 4 (n = 4) | 11 ± 4 (n = 4) |
| 30 ^ m | E8.5 (2-5 somiter) | 02/02 (2) | 33 och 26 (n = 2) | 14 och 16 (n = 2) |
Tabell 1. Elektroporation effektivitet pCAG-Cre: GFP plasmid i musembryon.
Förkortning: LS, sent primitivstrimman skede; LB: sent knoppstadiet. Embryon iscensatt enligtDowns och Davies 12
Discussion
Ympning
Det kritiska steget för cell ympning experiment är införandet av en sammanhängande sträng av celler helst i en enda åtgärd, för att undvika upplösningen av klump. Denna teknik kräver lite övning för att kontrollera munnen pipett. Om donatorceller införliva väl i värden, kommer deras derivat dispergeras i embryot. För att ytterligare fastställa om de dispergerade donator härledda-celler differentierar på lämpligt sätt i värden, kan immunfärgning utföras på embryosektionerna. Om givarceller inte är förenliga med värdmiljön, de antingen inte kan upptäckas (som de utvisas från embryot) eller bildar unincorporated klumpar i embryon efter kultur. Om båda spridda celler och cellklumpar iakttogs, kan det tyda på att alltför många celler ympades och överdrivna givarceller som inte kan interagera med närliggande värdceller resulterade i klumpbildning. I detta fall skall ytterligare transplantat innehållandeett mindre antal celler kan utföras.
Den största begränsningen av cell ympningstekniken är att det inte är möjligt att fastställa den fulla in vivo potential celler eftersom musen ex vivo kultur under perioder längre än 48 timmar har inte uppnåtts. Men om det kombineras med ultraljud-styrda cellinjektion, kan det vara möjligt att överföra odlade celler till embryona i livmodern. För att sammanfatta, cell ympning experiment har använts i stor utsträckning i vår grupp och har gett oss värdefulla ledtrådar om potentialen hos olika celltyper 4,21,22 in vivo. Det är en teknik för allmän verktyg för att bedöma potentialen för in vitro-odlade celler in vivo i tidiga postimplantationsförlust embryon.
Elektroporering
Även i denna studie vi har bara visat att det är effektivt att använda kapillär elektroporering teknik för att rikta epiblasten, jagt är också möjligt att avsiktligt rikta andra groddblad såsom endoderm celler. Det kritiska steget för kapillären elektroporation teknik är att minimera den tid det tar att electroporate varje embryo (<5 min per embryo) eftersom PBS är mycket suboptimalt för tidiga musembryon. Våra data ovan har visat att i de flesta områden i embryon inte elektroporering inte påverka embryotillväxten. Men, elektroporering i noden orsakade onormal utveckling och ledde till för tidig död av embryot. Detta beror sannolikt på grund av skada eller dödsfall av de celler som bildar viktiga signalcentra 23. Följaktligen skulle denna region måste undvikas med denna teknik. En annan varning är att, som nämns i avsnittet resultat, medan epiblast eller primitivstrimman celler riktade vissa endoderm celler också elektro. Detta kan bero på DNA når till endoderm genom luckor under epiblasten epitel. Endoderm består av epitelceller och vår erfarenhet these celler har en högre benägenhet att ta upp DNA. Därför, när tillämpningen av denna teknik för öde kartläggning, är det viktigt att bedöma vilka celler initialt ta upp DNA.
Det bör också noteras att även om pCAG-GFP och pCAG-Cre: kan GFP plasmider effektivt levereras med hjälp av elektroporeringsparametrar som visas i denna studie, kan effektiviteten hos andra DNA-konstruktioner variera och behöver individuell optimering. Förändringar i DNA-koncentration, elektroporering spänning eller antalet pulser kan göras om plasmider har befunnits vara svåra att transfektera.
Sammanfattningsvis kan våra optimerade kapillär elektroporation systemet effektivt och reproducerbart leverera GFP eller Cre: GFP plasmider i ett fåtal celler i embryot med begränsad celldöd. Eftersom denna metod inte kräver dyra eller mycket specialiserad utrustning, kan det vara till stor nytta för att spåra cell studier eller testa effekten av ektopisk uttryck eller villkorlig radering of gener i tidiga embryon är om elektroporering utförs med embryon som bär floxed villkor muterade alleler. Därför ger denna elektroporering teknik ett användbart funktionellt verktyg för att förstå på en cell-för-cellbasis roller cell inneboende faktorer i samband med lokal vildtyp embryonala miljöer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Dumostar | T5390 | |
| Dissecting stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Stereomicroscope system with fluorescence | Nikon | AZ100 | |
| Inverted microscope with a digital camera | Olympus | Olympus BX61 | |
| Inverted confocal microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 | |
| Low melting point agarose | Life Technologies | 16520-050 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 11397863 | |
| 30mm Petri dishes | Fisher Scientific | 121V | |
| 4-well plates | Thermo scientific | 179820 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pipettes | NICHIRYO | Nichipet | |
| tips | Greiner Bio One | 685280 | |
| Cell culture incubator | SANYO | MCO-17AIC | |
| Roller culture apparatus | BTC Engineering | ||
| Syringe filters 0.45µm, sterile | Sigma-Aldrich | 10462100 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| non-essential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | SH30549.01 | |
| Sodium pyruvate solution | Fisher Scientific | SH30239.01 | |
| Penicillin and Streptomycin 10.000UI/ml | Lonza | DE17-602E | |
| Gas Cartridge for Portable Meker Burner | COLEMAN | COLEMAN 250 | |
| Thin Wall Borosilicate Capillary Glass with Fillament, OD 1.0 mm, ID 0.78 mm | Harvard Apparatus | 640798 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Microforge | De Fonbrune | BS030301 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV830 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
| ECM 830 square wave pulse generator | BTX | 45-0002 | |
| Green food coloring dye | Sigma-Aldrich | C.I. 42053 | |
| A far-red cell membrane-impermeable nuclear dye | Biotium | 40060-T | |
| pCAG-Cre:GFP | Addgene | #13776 | |
| pCAG-GFP | Addgene | #16664 | |
| Multimeter | Excel | XL830L | |
| Micromanipulators | Leitz | ||
| 0.2mm diameter platinum wire | Agar Scientific | E404-2 | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | |
| Goat anti-Chicken IgY, HRP | Santa Cruz | sc-2428 | |
| Liquid DAB+ Substrate Chromogen System | Dako | K3467 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D21490 | |
| A far-red fluorescence nuclear counterstain | Life Technologies | T3605 |
References
- O'Hagan, A. R., Morton, R., Eid, N. Loss of asthma control in pediatric patients after discontinuation of long-acting Beta-agonists. Pulmonary med. , 894063 (2012).
- Brons, I. G., et al. Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos. Nature. 448, 191-195 (2007).
- Tesar, P. J., et al. New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells. Nature. 448, 196-199 (2007).
- Huang, Y., Osorno, R., Tsakiridis, A., Wilson, V. In Vivo differentiation potential of epiblast stem cells revealed by chimeric embryo formation. Cell rep. 2, 1571-1578 (2012).
- Sadik, M. M., et al. Scaling relationship and optimization of double-pulse electroporation. Biophys. J. 106, 801-812 (2014).
- Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorg. Med. Chem. Lett. , (2015).
- Soares, M. L., Torres-Padilla, M. E., Zernicka-Goetz, M. Bone morphogenetic protein 4 signaling regulates development of the anterior visceral endoderm in the mouse embryo. Dev. Growth Differ. 50, 615-621 (2008).
- Pierreux, C. E., Poll, A. V., Jacquemin, P., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. Gene transfer into mouse prepancreatic endoderm by whole embryo electroporation. JOP. 6, 128-135 (2005).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7, 107 (2007).
- Davidson, B. P., Tsang, T. E., Khoo, P. L., Gad, J. M., Tam, P. P. Introduction of cell markers into germ layer tissues of the mouse gastrula by whole embryo electroporation. Genesis. 35, 57-62 (2003).
- Khoo, P. L., Franklin, V. J., Tam, P. P. Fate-Mapping Technique: Targeted Whole-Embryo Electroporation of DNA Constructs into the Germ Layers of Mouse Embryos 7-7.5 Days Post-coitum. CSH protocols. 2007. , pdb.prot4893 (2007).
- Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae. Methods Mol Biol. 546, 145-151 (2009).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Nolkrantz, K., et al. Electroporation of single cells and tissues with an electrolyte-filled capillary. Anal. Chem. 73, 4469-4477 (2001).
- Mazari, E., et al. A microdevice to locally electroporate embryos with high efficiency and reduced cell damage. Development. 141, 2349-2359 (2014).
- Copp, A. J., Cockroft, D. L. Postimplantation mammalian embryos : a practical approach. , IRL Press. (1990).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mech. Dev. 68, 3-25 (1997).
- Wilson, V., Beddington, R. S. Cell fate and morphogenetic movement in the late mouse primitive streak. Mech. Dev. 55, 79-89 (1996).
- Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. Redefining the progression of lineage segregations during mammalian embryogenesis by clonal analysis. Dev Cell. 17, 365-376 (2009).
- Bellomo, D., Lander, A., Harragan, I., Brown, N. A. Cell proliferation in mammalian gastrulation: the ventral node and notochord are relatively quiescent. Dev. Dynam. 205, 471-485 (1996).
- Tsakiridis, A., et al. Distinct Wnt-driven primitive streak-like populations reflect in vivo lineage precursors. Development. 141, 1209-1221 (2014).
- Gouti, M., et al. In vitro generation of neuromesodermal progenitors reveals distinct roles for wnt signalling in the specification of spinal cord and paraxial mesoderm identity. PLoS biology. 12, e1001937 (2014).
- Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120, 613-620 (1994).
