Introduction
アデノウイルスは、感染細胞の核内で複製する二本鎖DNAゲノムを含みます。ウイルスDNAは核に入ると、それは、PML核小体1に隣接して局在します。ウイルスの初期遺伝子発現に続いて、核アーキテクチャは劇的と呼ばれる、ウイルスの微小環境の形成を誘導し、再編成されたウイルス複製のコンパートメント（RC）2。アデノウイルス（AD）RCは、ウイルスゲノムの複製およびウイルス後期遺伝子の発現が起こる部位であるので、これらのプロセスに関与するすべての必要なウイルスおよび細胞因子の動員のための環境を提供します。興味深いことに、このようなDNA損傷応答等の細胞抗ウイルス応答を担う細胞タンパク質、種々の、先天性免疫応答および腫瘍抑制は、これらのウイルスの部位2に同時オプトインしています。同時に調整しながらしたがって、広告RCは、効率的なウイルス複製を促進する調節ハブを考慮することができますこれらの構造は、ウイルス - 宿主細胞の相互作用を理解するための鍵であることを示す細胞の抗ウイルス応答、。それにもかかわらず、RC形成の分子機構は、それらの組成および関連する活動があまり理解されていません。
核内で複製する他のDNAウイルスからのアデノウイルスのRCと同様に、RCが細胞質RC 3とは対照的に、膜に関連付けられていません。また、これらのウイルス誘発性構造は、タンパク質および核酸の完全に構成される可能性があります。 RNAウイルス（通常ウイルス工場と呼ばれる）に感染した細胞内に形成されたRCは、その詳細な形態的、機能的および生化学的特徴4が容易になったそれらの細胞質局在性および膜結合状態、を利用して、単離されています。
我々の知る限り、核ウイルスRCはおそらく核アーキテクチャの複雑さと核内メートルがないため、単離されていませんそれらの単離を容易にするであろうembranes。彼らの研究は、免疫蛍光顕微鏡、魚や透過型電子顕微鏡で代わりに依存してきました。しかし、核内構造体を単離することに固有の合併症にもかかわらず、このような核小体とカハール体として他の核ドメインが5,6の前に単離されています。核小体とRCの両方がタンパク質や核酸で構成され、0.5の間の直径持っているので - 5μmで、私たちは、RCはまた、分離に適してなければならないという仮説を立てました。そのため、より正確にはRCに関連する分子組成および機能を特徴付けるために、我々は、RCで強化された核内画分を単離するための新規な方法を確立しました。この目的のために、我々は核 小体7または他の核ドメイン6を単離するために使用される手順と同様の速度勾配およびスクロースクッションを使用して、サブ核画分を調製して、分子組成の研究との関連活動を可能にする無細胞系を確立しましたRC。この技術は、したがって、ウイルス - 宿主細胞相互作用の理解を進め、また、核内で複製する他のウイルスからのRCの詳細な分析を容易にし、アデノウイルス内に形成されたものと同様の寸法の複製区画の形成を誘導するはずである強力なツールを表しているべきですこのような、ヘルペスウイルス、パピローマウイルスまたはポリオーマウイルスなどの感染細胞、。
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Protocol
1. HFF細胞培養およびAd-感染
- 以前に説明したように8 HFF細胞上の蛍光形成単位（FFU）として、HEK-293細胞と力価の単層中のAd5のWTウイルスを伝播します。
- 無菌培養で37ºCで100mmの皿および5％CO 2加湿インキュベーター中DMEM / 10％ウシ胎児血清（FBS）10ml中のヒト包皮線維芽細胞（HFF）を成長させます。 4つの16平方セットで細胞を計数することによってノイバウアーチャンバーを用いて細胞数を決定します。 1ml当たりの細胞数は、4つの16平方セットにおける細胞の平均数を計算し、10 4が 、この数を乗じて得られる。ステップ1.3に含まれる各時間後の感染のために、1×10 7個のHFF細胞を用います。
- 30フォーカス形成単位、またはFFUのMOIで皿当たりDMEM中でのAd5の1ミリリットルを使用して、100mmの組織培養皿にアデノウイルス5型（Ad5）野生型（WT）（H5pg4100 8）とHFF細胞をモック感染または感染、セルあたり。ああで2時間インキュベートします慎重に細胞の上にウイルス接種物の均一な分布を確実にするために15分毎に料理をロッキングumidified細胞培養37ºCでインキュベータ、5％CO 2、。この時間の後、培地を除去し、10％FBSを補充した新鮮なDMEMを加え、16、24または36º37℃の加湿細胞培養インキュベーター中で時間、5％CO 2インキュベートします。 2.1に進みます。
アデノウイルスRCで強化されたサブ核画分の調製
- 収穫のAd5感染または細胞スクレーパーでモック感染したHFF細胞および滅菌遠心管で細胞を集めます。ステップ1.2のように細胞数を決定します。ステップ1.3で指定された各時間後の感染のために、1×10 7個の細胞を使用してください。
- 220×gで、5分間、4ºCで細胞を遠心します。
- 氷冷PBS（137mMの塩化ナトリウム、2.7のKCl、10mMのの Na 2 HPO 4、1.8mMのKH 2 PO 4）で細胞ペレットを再懸濁します。洗浄細胞ペレット1回の洗浄につき氷冷PBS 5mlのを使用して3回。この目的のために、220×gで遠心分離細胞は、5分間の4ºC、デカントして捨て、上清（SN）を、穏やかなピペッティングにより細胞ペレットを再懸濁します。
- プラズマ膜を破壊するために、氷冷低張緩衝液（10mMのHEPES pHは7.9、10mMの塩化カリウム、1.5mMのMgCl 2を、0.5 mMのDTT、20μG / mlのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）の700μLに細胞ペレットを再懸濁、10μグラム/ mlのウシ膵臓トリプシン阻害剤、10μグラム/ mlのペプスタチンA、10μグラム/ mlのN -アセチル-L-ロイシル-L-ロイシル- Lを含むシステイン、セリン、スレオニン及びアスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤の混合物-argininal）、細胞を3時間氷上で膨潤させます。
- 溶解ゆったり型テフロン乳棒でホモジナイザーを用いて細胞。全ての細胞が溶解されていることを確認するために、明視野顕微鏡で80ダウンスストロークと監視のサンプルごとに20ストロークを実行しますが、核は、nを持っていることOT破損または破裂して。
- 300×gで、5分間、4ºCで細胞ホモジネートを遠心します。遠心管で-20ºCでの細胞質画分としてSN保管してください。
- 核から細胞破片を除去するために、（0.25 Mスクロース、10mMのMgCl 2を20μG / mlのPMSF、システインの混合物、セリン、10を含むスレオニンおよびアスパルチルプロテアーゼ阻害剤液1（S1）の750μLにペレットを再懸濁μG / mlのウシ膵臓トリプシンインヒビター、10μG / mlのペプスタチンA、10μG / mlのN -アセチル- L -ロイシル-L-ロイシル-L- argininal）と溶液2等量の上の層（S2） （0.35 Mスクロース、0.5mMのMgCl 2を、20μグラム/ mlのPMSF、10μグラム/ mlのウシ膵臓トリプシンインヒビターを含む、システイン、セリン、スレオニン及びアスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤の混合物、10μグラム/ mlのペプスタチンA、10μグラム/ mlのN -アセチル-L-ロイシル-L-ロイシル-L-argininal）。 CENTR1400×gで、5分間、4ºCでifuge。
- マイクロピペットを使用してSNを破棄します。ペレットを乱さないようにしてください。
- S2の750μLで孤立した核を含むペレットを再懸濁します。
- アデノウイルスRC（RCF）で強化された核内画分を単離するために、2つの5分のパルスを用いて、超音波浴で核を再懸濁し超音波処理、または明視野顕微鏡により観察されるように、すべての核が溶解するまで。 Cで、または4°未満のサンプルを維持するために必要に応じて超音波浴中に氷を使用してください。
- 溶液3（S3）3000×gで（0.88 Mスクロース、0.5のMgCl 2）、遠心分離、10分間4ºC等量の上で超音波処理した核レイヤ。 -70ºCで核質画分（NPL）と1.5ミリリットルの上清を保管してください。 -70ºCでRCFとしてS2の700μLでペレットや店舗を再懸濁します。
RCFの3ウエスタンブロット分析
注：NPLとRCF画分sのウエスタンブロット分析のためにステップ2.11で得られた総容量とは別にらNPLのための640μLとRCFのための300μリットル。
- Laemmli緩衝液の2倍（4％SDS、20％グリセロール、10％2-メルカプトエタノール0.004％ブロモフェノールブルー、0.125 MトリスHCl pHは6.8）5分95ºCで、沸騰中の各核内画分の15μLを混ぜます。 20ミリアンペア（ミリアンペア）で、1.5時間ゲルと別々のタンパク質を変性10％ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）にサンプルをロードします。
- ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜上に400ミリアンペアで1.5時間、エレクトロによってタンパク質を転送します。
- PBS中3％脱脂粉乳を使って室温で2時間ブロック膜。
- PBS / 0.3％の脱脂粉乳で1：500希釈でウイルスのE2A DNA結合タンパク質（B6-8 9）に対する一次抗体と4ºCでO / Nインキュベートします。
- 10分間、PBS / 0.1％Tween 20で洗浄膜3回。
- マウス抗IgG二ANを有する膜をインキュベートRTで2時間、PBS中の1：10,000希釈tibodyは1でホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）に結合されました。
- PBSで膜を3回洗浄/ 0.1％のTween 20を10分間。
- 増強化学発光及びX線フィルムを用いて膜を開発します。
RCF 4.ウイルスDNAの検出
注：両方のNPLとRCF画分からのDNA単離のために、ステップ2.11で得られた全体積のRCFのために不良債権のために210μlの100μLを使用しています。
- プロテイナーゼKを1mg / mlおよび0.5％Tween 20で55ºCで1時間サブ核画分をインキュベートします。
- 95℃で10分間、サンプルをインキュベートすることにより、プロテイナーゼKを不活性化します。
- 2分間室温で20,000×gで試料を遠心。
- SNを収集します。 3M酢酸ナトリウム1/10容量と1容量のイソプロパノールでDNAを沈殿させ、O / Nで4℃にて。
- 室温で10分間20,000×gで試料を遠心。
- SN Uを破棄マイクロピペットを歌います。 20,000×gで70％エタノールと遠心で5分間、4°Cをペレットを洗浄します。
- 10mMトリス-塩酸pH7.4中の10μLに DNAを再懸濁
- 260nmでの光学密度（OD）を測定することによって分光光度計を用いてDNAを定量化します。
- ウイルスDNAを増幅するためのヌクレオチド7273から、主要後期転写ユニット内の領域の増幅を可能にするプライマーを用いて反応容積の25μLでのTaq DNAポリメラーゼを使用する標準的PCR反応において、各核内画分からDNA 100ngのに使用するためにヌクレオチド7353（81塩基対）（FW：GAGCGAGGTGTGGGTGAGC; Rvの：GGATGCGACGACACTGACTTCA）。 95ºCで3分間の初期変性、20増幅（95ºC、72ºCで30秒間62ºCで1分間アニーリングおよび伸長で1分間）のサイクルとの最終的な伸長工程に続く次のサイクル条件を使用してください72ºCで3分間。
- エチジウム90 V.ステインで、2％アガロースゲルでPCR産物を実行します0.5μG / mlの最終濃度で臭化RCFでウイルスDNAの濃縮を裏付けるためにDNAを可視化します。細心の注意を払ってエチジウムブロマイドを処理し、常にこの化合物は強力な変異原であるように、手袋を着用してください。制度ガイドラインに従ってエチジウムブロマイドを廃棄してください。
RCF 5.後期ウイルスmRNAの検出
注：両方のNPLとRCF画分からのRNAの単離のために、ステップ2.11で得られた総容量からRCFのために不良債権のために640μlの300μLを使用しています。
- 製造元の指示に従ったトリゾール使用して核内画分からRNAを分離します。 DEPC（diethilpyrocarbonate）処理水50μlの中のRNAを再懸濁します。
- （約3μgが得られた）、260 nmでODを測定するために分光光度計を用いてRNAを定量化します。 -70ºCで50 ngの/μlのアリコート中のRNAを保管してください。
- 精製されたRNAをチェック5トータルRNAのngのステップ4.9に記載のサイクル条件を用いて、逆転写酵素（RT）の非存在下でのコントロールPCR反応を行うことによりDNA汚染の欠如のために。
- DNAの混入がない場合何のアンプリコンが生成されるべきではありません。 DNA汚染が存在する場合は、37ºCで30分間、10 UのDNase I、RNase阻害剤の10 U、0.1 Mトリス-塩酸pHを8.3、0.5 M KCl及び15mMのMgCl 2を有する試料をインキュベートします。ステップ5.1のように、RNAを再単離するために進んでください。
- RCFに関連するウイルスmRNAを分析するために、異なる遺伝子ファミリー（ 表1）から、アデノウイルス後期のmRNAを検出するために設計されたプライマーを用いたRT-PCRによって、各核内画分からRNA 100ngの増幅。
- 逆転写（RT）については、42ºCで1時間、70ºCで10分間反応容量の20μLの M-MuLVにRT酵素を用いた標準的なRT反応の各核内画分から、RNA 100ngのを使用しています。
- 増幅のために、1を使用しますステップ4.9のように、PCR反応でcDNAのLをμ。 25サイクルの増幅に続いて95ºCで3分間の初期変性、（95ºCで1分間、アニーリング72ºCで30秒間、表1と拡張で指定された温度で1分間）し、次のサイクル条件を使用してください72ºCで3分間の最終伸長工程。
- 0.5μグラム/ mlの最終濃度で、臭化エチジウム90 V.染色ゲルで2％のアガロースゲル中でRT-PCR産物を、実行し、RCFへのウイルス後期mRNAの関連を裏付けるために可視化します。ステップ4.10に示すようにエチジウムブロマイドを処理します。
RCFの6免疫蛍光可視化
注：キャリーアウトは、この手順をクリーンベンチの下にほこり粒子とサンプルの汚染を避けるため、使用する前に、すべてのソリューションをフィルタリングします。
- 悲惨なステップ2.10で得られたRCF画分のスポット5μlのCTLYシランコートスライド上。
- 室温で約5分間のスポット乾燥をしてみましょう。
- 再水和物をゆっくりと間接的にRCFスポットの横にあるドロップでのPBS 500μLをピペッティングして、スライドを傾けることによって流れせることによって。側から過剰のPBSを切ります。
- RTで2時間、PBS / 5％のウシ血清アルブミン（BSA）の500μLに試料を覆うことによりブロック。
- 穏やかに間接的に試料上にPBSを500μリットルをピペットでスライドを3回洗浄します。過剰のPBSを切るためにスライドを傾けます。
- 室温で2時間、PBS中で1：500希釈でウイルスE2A DNA結合タンパク質（B6-8 9）に対する一次抗体とサンプルをインキュベートします。抗体溶液の20μLにスポットされたサンプルをカバーし、乾燥を避けるために、湿ったチャンバー内でインキュベートします。
- 穏やかに間接的に試料上にPBSを500μリットルをピペッティングすることにより、PBS / 0.02％Tween 20でサンプルを3回洗浄します。元を切るためにスライドを傾けてセス洗浄溶液。
- 4ºCで1時間、PBS中で希釈2,000：1で、488 nmで励起される蛍光色素分子に結合されたマウス抗IgG二次抗体を用いて、サンプルをインキュベートします。抗体溶液の20μLにスポットされたサンプルをカバーし、乾燥を避けるために、湿ったチャンバー内でインキュベートします。
- 穏やかに間接的に試料上にPBSを500μリットルをピペッティングすることにより、PBS / 0.02％Tween 20でサンプルを3回洗浄します。過剰の洗浄溶液を切るためにスライドを傾けます。
- メディアをマウントするように2μリットルのPBS / 10％グリセロールを使用したカバーガラスとスライド上にスポットしたサンプルをカバーしています。明確なマニキュアで密封し、アルを保存-20ºC。
- 波長488nmでの63X対物1.4開口数（NA）と、蛍光顕微鏡を用いてサンプルを分析します。
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Representative Results
ウイルス複製区画（RC）は、他の核内ドメインに類似したタンパク質および核酸からなる核内のウイルスによって誘発される構造であるので、それらは、生化学的特徴に基づいて速度勾配によって分離を受けやすいことが判明しました。分画プロトコルにおける重要なステップは、サンプルは、異なる細胞下分画の完全性を保証するために、明視野顕微鏡法によって監視される必要がある各ステップでは、図1に示されています。細胞膨潤時、例えば、低張緩衝液中でのインキュベーション時間は、核への損傷を回避する細胞質を膨潤させるために標準化される必要があります。小胞体膜を含む細胞質成分を含まない細胞の均質化、無傷の核、後に、得られたする必要があります。また、超音波処理の時間は、RCを中断することなく、すべての細胞の核膜を破壊するために標準化される必要があります。
サブ核画分を得た後、キーコントロールは、RCFで善意のRCマーカーの関連性および濃縮を決定するために含める必要があります。アデノウイルスのRCは、一般的に、ウイルスE2A-72Kタンパク質（DBP）に対する抗体を用いて免疫蛍光により感染細胞中で可視化されます。 DBPは、ウイルスゲノムの複製に直接関与するウイルスタンパク質です。 図1に示すように、したがって、RCFに富む粒子でDBPの存在は、単離された粒子と、このウイルスタンパク質の直接的な関連を示す。また、ウエスタンブロットによってRCFにおけるDBPの検出は、単離されたこのタンパク質の関連性を確認しますRC。 図2では 、それはRCが感染後に予想される時間的に反映し、異なる時間に、この手順を用いて得られることを実証し、感染後（36 HPI）後期によって、DBPが核質画分（NPL）と比較して、RCFに富んでいることが示されていますRCにDBP協会のパターン。 RCの本質的なウイルス成分は、ウイルスDNA itseですLF。 図3に示すような実験では、ウイルスの複製サイクルが進むにつれてDBPの場合と同様に、これらの画分中のDNA複製の時間的パターンをも研究することができることを示す、RCFとウイルスDNA会合の量を増加させることを示しています。
ウイルスタンパク質およびウイルスゲノムを含むほか、RCは、ウイルス後期遺伝子発現の部位です。 図4では 、我々は、RT-PCRによるウイルス後期mRNA及び36 HPIでRCFとNPLとの間に、その分離の様々な種のレベルを測定するために設計された実験の代表的な結果を提示します。ウイルス後期mRNAは、RCで合成され、そのpostranscriptional処理はこれらのサイトで開始されます。後でこれらのウイルスmRNAは、RCから解離核質に遊離され、その後細胞質に輸出されています。成熟したウイルス後期mRNAの合計プール（ML mRNAが）、三者リーダーのエクソンジャンクションを増幅するプライマーを用いて測定しました全てのアデノウイルス後期のmRNA（ 図4A）の5 'を構成するシーケンス。 L2、L4とL5の家族の特定の成熟転写物のmRNA中のエキソン接合部も測定しました。これは、ウイルス複製サイクルの後期の進行に伴い、ウイルス後期mRNAの増加量は、細胞質に輸出されていることが確立されています。しかし、後半倍L5 mRNA種の生産は他の後期のmRNAの家族と比較してさらに増加します。予想通り、図4に播種代表的な結果では、ML mRNA中の約2.5倍の差は、RCFと比較して不良債権で観察されます。我々は、特定の家族からのmRNAを比較すると対照的に、L5 mRNAはNPLのほぼ2倍の増加を示した興味深いことに、L2及びL4のmRNAの両方が、両方の核内画分（それぞれ図4BおよびC）の間に同様のレベルで分散されるように思われますRCFと比較。これらの結果は、SYの差動パターンを提案アデノウイルスRC（10前に示唆されているように）異なるウイルス後期mRNA種のnthesisと解放。重要なことに、これらの結果はまた、ウイルスmRNAの生合成における種々の工程の正確な測定は、この新規手順で単離されたRCを使用して行うことができることを示しています。
分別手順中に別の手順の図1明視野顕微鏡。RCの分離時には、サンプルはサブセルラー画分の整合性を確保するために光学顕微鏡で監視する必要があります。図は、スクロースクッションを介して核の分離とRCFの単離に、HFF細胞の腫脹からRCFを取得するための手順に使用されるステップを示しています。 40倍の顕微鏡写真：スケールバー50μメートル。 63X顕微鏡写真：スケールバー5μメートル。 DBPは緑で表示されます。TPS：//www.jove.com/files/ftp_upload/53296/53296fig1large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. DBPに対するウエスタンブロット。サンプルはSDS-PAGEで分析し、DBP、ウイルスRCの善意のマーカーに対するウェスタンブロットのために処理されます。 RCF中のタンパク質の濃縮を決定するために、それは異なる時間感染後にRCFと不良債権の両方に存在し、DBPの相対量を比較することは有用です。 HFF細胞では16 HPIは、アデノウイルスの複製サイクル中の早い時間を表します。ウイルスDNA合成が始まると24 HPIは、感染の後期相への移行をマーク。 36 HPIは、後半時間後の感染を表します。 DBPの予想される分子量が示されている。CLICくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをKです。
図3. PCRアッセイは、24と36 HPIでRCFとNPLから精製したRCF。DNA中のウイルスDNA（vDNA）を検出します 。ウイルスDNAは、ウイルスゲノムに特異的なプライマーを用いてPCRにより増幅しました。グラフは、36 HPIでRCFにおけるウイルスDNAの濃縮を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
。図4.ウイルス後期mRNAの RNA の分析は、RCFとNPLから単離し、そして特定のウイルス後期のmRNAを検出するためにRT-PCRによって分析した（A）全ウイルス後期mRNAを（ML：主要後期）; Lから（B）のmRNA2ファミリー; L4ファミリーから（C）のmRNA; L5ファミリーから（D）のmRNA。値は、3つのサンプルの平均値±標準偏差を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 名 | フォワードプライマー配列（5'-3 '） | リバースプライマー配列（5'-3 '） | 焼なまし温度 |
| MLのmRNA | GCCTCCGAACGGTACTCCGCC | CGCCACGGTGCTCAGCCTACC | 60ºC |
| L2のmRNA | GTCACAGTCGCAAGATGTCCAAGC | GCAACGCCAGCATGTCCTTATGC | 58ºC |
| L4のmRNA | CCTCCGAACGGTACTCCGC | CCTTGCTCATCTTGCGACTGTG | 58ºC |
| L5のmRNA | GTCACAGTCGCAAGATGAAGCG | GGTAACTAGAGGTTCGGATAGGCG | 60ºC |
表ウイルス後期mRNAの増幅のために使用したプライマー1 MLのmRNA：これらのプライマーは、三連リーダー、全てのウイルス後期mRNAに共通している5 '配列内の領域の増幅を可能にします。 L2のmRNAプライマーは、PVのmRNA内の特定の領域の増幅を可能にします。 L4のmRNAプライマーは、100 KのmRNA内の特定の領域の増幅を可能にします。 L5 mRNAは、繊維のmRNA内の領域の増幅を可能にします。各プリムのための配列、およびアニーリング温度ERが示されています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 12100-046 | Warm in 37 ºC water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12484-028 | |
| Sucrose, Ultra Pure | Research Organics | 0928S | Prepare a 2.55 M stock solution and store at 4 ºC |
| Dounce homogenizer | Kontess Glass Company | 884900-0000 | |
| Branson 1800 Ultrasonic Bath | Branson | Z769533 SIGMA | Turn on 15 min before use. |
| Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-21121 | Use at a 1:2,000 dilution in PBS |
| Silane-Prep Slides | Sigma | S4651-72EA | Open in a laminar flow cabinet |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Pierce ThermoScientific | 34080 |
References
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