Abstract
Zebrafische sind ein wichtiger Modellorganismus mit inhärenten Vorteile, die das Potenzial Zebrafisch ein weithin angewandt Modell für die Untersuchung der Energie-Homöostase und Übergewicht zu machen. Die geringe Größe der Zebrafisch ermöglicht Tests an Embryonen in einem 96 oder 384 Well-Plattenformat durchgeführt werden, Morpholino und CRISPR basierte Technologien zu fördern einfache genetische Manipulation, und medikamentöse Behandlung von Badanwendung lebensfähig ist. Darüber hinaus sind Zebrafisch ideal für zukunfts genetischen Screens so dass für neues Gen Entdeckung. Angesichts der relativen Neuheit der Zebrafisch als Modell für Übergewicht, ist es notwendig, Werkzeuge, die diese Vorteile voll ausschöpfen zu entwickeln. Hier beschreiben wir eine Methode, um den Energieverbrauch in Tausenden von embryonalen Zebrafisch gleichzeitig zu messen. Wir haben eine ganze Tiermikroplattform, in der wir Platten mit 96 Vertiefungen zu einzelnen Fische zu isolieren entwickelt und wir beurteilen kumulative NADH 2-Produktion unter Verwendung des im Handel erhältlichen Zellkulturfähigkeit reMittel alamarBlue. In poikilotherms die Beziehung zwischen NADH 2 Produktion und Energieverbrauch ist eng verknüpft. Dieser Energieverbrauch Test schafft das Potenzial, sich rasch zu screenen pharmakologische oder genetische Manipulationen, die den Energieverbrauch direkt zu ändern oder ändern Sie die Reaktion auf eine angelegte Drogen (zB Insulin-Sensitizer).
Introduction
Die Maus ist derzeit das vorherrschende Modell für Adipositas-Forschung. Die kurze Generationsintervall und genetischer Werkzeuge zur Verfügung, in der Maus wurden unerreicht auf dem Laufenden. Allerdings hat der Zebrafisch auch eine kurze Generationsintervall (3-4 Monate) und übertrifft sogar die Maus in eine einfache genetische Manipulation 1,2. Der Zebrafisch unterhält fast 90% der Säugetiergenen, während Sie die Maus weit über der Zahl der Nachkommen und das Potenzial für den Einsatz in genetischen und Drogen-Bildschirme 3.
Um das Potenzial des Zebrafisch-Modell für Studien der Fettleibigkeit zu erschließen, müssen Tests entwickelt werden, um Faktoren, die Gewichtsregulation, einschließlich Energieverbrauch beeinflussen zu untersuchen. Als Metaboliten werden durch β-Oxidation und Tricarbonsäurezyklus Sauerstoff verarbeitet verbraucht und NADH 2 wird erzeugt. Somit NADH 2 ist ein direkter Indikator des Flusses von Metaboliten durch Stoffwechselwege (Metabolit Oxidation). In poikilotherms, H + Leck durch die innere Mitochondrienmembran, die NADH 2 -Oxidation entkoppelt von der ATP-Synthese ist 4-5-fach geringer als bei Warmblütern 4. Dementsprechend wird in Zebrafisch NADH 2 sehr fest an die ATP-Produktion durch oxidative Phosphorylierung verknüpft. Hier beschreiben wir einen Test, der NADH 2 Produktion misst in Larven Zebrafisch als Proxy für den Energieverbrauch 5.
Der Sauerstoffverbrauch ist der Goldstandard zur Messung der Energieaufwand. Doch am besten nutzen Sie die Hochdurchsatz-Potenzial des Zebrafisch-Assays des Energieverbrauchs muss zugänglich für Hochdurchsatz sein. Sauerstoffverbrauch Systeme, die auf einer geschlossenen Kammer Umlaufsystem abhängt, werden im Durchsatz durch die Anzahl von Kammern vorhanden 6 begrenzt. Open-Air-O 2 Verbrauch / CO 2 -Produktion Assays wurden ebenfalls in der Zebrafisch 5,7 angewandt. Diese Open-Air-Platte mit 96 Vertiefungen BasisD Systems zugänglich sind hohem Durchsatz. Leider Gasaustausch mit der Umgebung begrenzt Empfindlichkeit dieser Assays. Wir haben vor kurzem veröffentlicht die Anwendung eines Assays, die NADH 2 Monitore mit dem Redoxindikator alamarBlue 5. Dieser Test überwindet die Beschränkungen in Durchsatz und Empfindlichkeit gemeinsam Analysen der Sauerstoffverbrauch in der Zebrafisch.
Der Zebrafisch ist ein zunehmend wichtiges Modell für die Untersuchung der ganze Körper Energie-Homöostase. Zum Teil, weil Zebrafisch zugänglich sind in den zukunfts genetischen Screens und Drogen-Bildschirme verwenden. Darüber hinaus gezielte genetische Manipulation, einschließlich Zuschlags und Knock-in, kann schnell angewendet werden. Wir haben bereits gezeigt, dass dieser Test kann mit Badewanne Medikamentenapplikation und der genetischen Zuschlags oder KO kombiniert werden, um Verbindungen und Gene, die Stoffwechselrate zu ändern 5 zu identifizieren. Außerdem ist dieser Test für die hohen Durchsatzvorteile inhärent Zebrabärbling auszunutzen.
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Protocol
Hinweis: Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Universität von Arizona Amt für verantwortliches Handeln in der Forschung und wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss gebilligt wurde
1. Zebrafisch-Embryo Zucht und Wartung
- Bereiten E3 Embryo Medium 8. Um 60x Stammlösung machen, lösen sich 34,8 g NaCl, 1,6 g KCl, 5,8 g CaCl 2 ● 2 H 2 O und 9,78 g MgCl 2 ● 6 H 2 O in 1,95 L ddiH 2 O. Der pH-Wert auf 7,2 unter Verwendung von NaOH und HCl Lautstärke bis 2 L mit ddiH 2 O.
- Um 1x E3 Embryo Medium herzustellen, verdünnte 16,5 ml 60x Lager in 1 L ddiH20. Fügen Sie 100 ul 1% Methylenblau.
- Zucht
- Haus Männliche und weibliche Zuchtbestands (7-18 Monate alt) separat an Fruchtbarkeit zu maximieren.
- Mach das Licht aus 1-2 Stunden vor der am Tag vor der Eier erwünscht sind. Richten Sie Paarung (1 männlich und 1-2 Weibchen) in cRossing Käfige 9, wie zuvor beschrieben. Crossing Käfigen ermöglichen die Eier Raub zu entkommen, als sie durch den perforierten Boden des Tanks Einsatz, in dem die ausgewachsene Fische gehalten werden, übergeben.
- Optional:. Für zeitgesteuerte Zucht, (wie es für Studien mit Morpholino Injektion erforderlich), trennen Sie den männlichen und weiblichen Fische von einem durchsichtigen Kunststoff-Teiler, entfernen diese am Morgen, um in zeitlicher Verlegung der Eier und die Befruchtung führen. Für Morpholino Studien durchführen Leistungsberechnungen, die Zahl der embryonalen Fisch pro Behandlung erforderlich zu bewerten. Ohne eine Schätzung der Größe des Effekts oder Abwandlung kann eine vorläufige Prüfung bei der n = 8 ausgeführt.
- Gießen Sie die Eier aus der Kreuzung Käfig in eine Petrischale (100 bis 150 Embryonen / 10 cm Petrischale). Lassen Sie die Eier auf den Boden der Schale niederzulassen und abgießen. Entfernen Sie das restliche Wasser mit einer feinen Spitze Einweg-Transferpipette. Zurück E3 Embryo Medium in Schritt 1.1 gemacht hinzufügen.
- Machen aflame poliert Einwegpipette für zukünftige Ei und Fisch Übertragung. Mit einer Schere, schneiden Sie ein absolvierte Einmaltransferpipette an der 0,25 ml Graduierung. Um Ecken und Kanten, Flammpolitur der Schnitt Spitze über einem Bunsenbrenner zu entfernen.
- Pflegen embryonale Fisch bis 4 Tage nach der Befruchtung (DPF) in 10 cm Petrischalen im Zebrafisch E3 Embryo Medium bei 28,5 ○ C Zweimal täglich, verwenden Sie eine Flamme poliert absolvierte Einmaltransferpipette, um alle unbefruchteten Eiern oder toten Embryonen (opak weißes Aussehen) zu entfernen. Einmal täglich, tauschen E3 Embryo Medium. Abgießen E3 Embryo Medium, entfernen Sie verbleibende Flüssigkeit mit einer feinen Spitze Einweg-Transferpipette, und fügen Sie wieder vorgewärmten (28,5 ○ C) E3 Embryo Medium.
2. Bereiten Sie Testlösung
- Vorbereitung der Testlösung gemäß Tabelle 1. Sterile Filter Assay Lösung unter Verwendung eines 0,22 um-Filter. Vor Beginn testen, warm die sterile Testlösung in einer 28,5 ○ CWasserbad.
| Bestandteil | % Der Gesamt | Volumen (ul / 10 ml) |
| 60x E3 Embryo Medium | 1,667 | 166,7 |
| Doppel deionisiertem (DDI) H 2 0 | 96,233 | 9.623,3 |
| Alamar-Blau- | 1 | 100 |
| 400 mM NaOH | 1 | 100 |
| DMSO | 0.1 | 10 |
Tabelle 1 Assay-Medium
3. Führen Assay
- Spülen Zebrafischembryonen 3 mal mit steril filtriert E3 Embryo Medium. Kombinieren Sie alle lebensfähigen Zebrafischembryonen von der Kupplung in ein Becherglas. Sterilfilter 75 ml E3 Embryo Medium. Mit einer feinen Spitze Einweg-Transferpipette, rebewegen, wie viel von der E3 Embryo Medium aus den Zebrafischembryonen wie möglich. 20 ml steril filtriert E3 Embryo Medium Rücken. Entfernen und 3 mal ersetzen E3 Embryo Medium.
- Fischplatte 1 in jede der 93 Vertiefungen einer 96-Loch schwarz Seitige durchsichtigen Bodenplatte. Übertragen Sie die embryonale Fisch auf den Teller durch individuelles Einfangen eines Embryos in eine Flamme poliert absolvierte Kunststoff-Einweg-Transferpipette (Schritt 1.5) und sanft Auswerfen in den Brunnen. Bringen E3 Embryo Medium aus dem Becherglas gespült Fisch in den 3 leeren Brunnen entnommen. Dies stellt sicher, dass leere Brunnen wurden auf die gleiche Wasser wie die Brunnen, die Fisch enthalten ausgesetzt. Beide Brunnen, die Fisch und leere Brunnen enthalten sollte mindestens ½ volle (200 ul) auf den Abschluss dieser Schritt sein.
- Ersetzen E3 Embryo Medium mit Assay-Lösung in allen 96 Wells, einschließlich leere Brunnen. Dieser Schritt sollte 1 Spalte zu einer Zeit für jede der 12 Spalten in einer 96-Well-Platte durchgeführt werden. Mit einer feinen Spitze Einweg-transfer Pipette entfernen E3 Embryo Medium aus jeder auch in einer Spalte der Platte (8 Kavitäten). Achten Sie auf die Zebrafischembryo nicht berühren. Werden 300 & mgr; l Assay-Lösung zu jeder Vertiefung, aus dem Wasser entfernt wurde. Wiederholen die Entfernung von E3 Embryo Mediums und Ersatz mit Assaylösung für alle 12 Spalten der Platte.
- Optional: Um die metabolische Rate Änderung in Reaktion auf eine Testverbindung, stellen eine Lösung, die 100-mal (100X) die gewünschte Behandlungskonzentration ist. Zu beachten ist, sicherzustellen, dass die Lösung 100x 10% DMSO nicht überschreiten, um die endgültige DMSO-Konzentration auf nicht mehr als 0,1% zu begrenzen. Werden 3 ul des 100-fach-Lösung in jede der Behandlungs Vertiefungen.
HINWEIS: Führen Sie Leistungsberechnungen, die Zahl der Behandlungs Brunnen zu bewerten. Jedoch ohne eine Schätzung der Grße der Reaktion oder einer Variation, einem Vorversuch kann in 8 Verbindung behandelten und 8 mit Vehikel behandelten Kontrollvertiefungen, die Fische enthalten ausgeführt werden.- In 3 ul Fahrzeugkontrolle, die Kontrolle (keine drug Behandlung) Brunnen, die Fisch enthalten. Um sicherzustellen, dass das fluoreszierende Reaktion auf Verbindung ist ein Ergebnis der Maßnahmen, die im Fisch, gelten Drogen-und Fahrzeuganwendungen bis 3 leere Wells in einer Platte mit 96 Vertiefungen.
- Lesen Fischen gefüllt Platte auf Fluoreszenzplattenlesegerät mit Anregungswellenlänge bei 530 nm und die Emissionswellenlänge bei 590 nm.
- Platz Platte in befeuchteten Inkubator auf 28,5 ○ C (halten Platte in der Dunkelheit über sie Assay zur Photobleichen der Testlösung zu vermeiden) eingestellt. Der Test kann für die Dauer der Zeit, die von 1 Stunde bis 24 Stunden reichen ausgeführt werden. Die Dauer des Tests hängt von der Zielsetzung der Studie. Zum Testen der Reaktion auf eine kurzwirksamen nicht stabile Verbindung eine kurze Dauer kann am besten geeignet. Doch die Maximierung Assay Dauer für eine stabile Verbindung, Tests oder Prüfungen der genetische Effekte, vorzuziehen, die Vorteile mit der Summensignal zugeordnet zu nutzen.
- Zu einem vorbestimmten Zeitpunkt (siehe Schritt 3.6, um festzustellen Timing)Lesen Fluoreszenz des fischreichen Platte wieder mit den gleichen Einstellungen wie in Schritt 3.5.
4. Bewerten Sie die relative Veränderung der Fluoreszenz Verbunden mit Treatment
- Änderung in der Fluoreszenz von jeder Berechnung auch durch Subtrahieren der Fluoreszenz zum Zeitpunkt 0 von der Fluoreszenz am Ende der Studie. Wells ohne Fisch (Rohlinge) sollten Werte nahe 0 haben, weit unter Werte von Brunnen, die Fisch enthalten.
Veränderung der Fluoreszenz = Fluorescence am Schluss - Fluoreszenz zum Zeitpunkt 0 - Um die relative Veränderung der Fluoreszenz zu ermitteln, berechnen die durchschnittliche Veränderung der Fluoreszenz für die Kontrollvertiefungen dann teilen die Veränderung der Fluoreszenz jedes vom durchschnittlichen Veränderung der Fluoreszenz der Kontrollvertiefungen. Zu beachten ist, könnte Kontrollen entweder Fahrzeugsteuerungen oder genetische Kontrolle zu sein.
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Representative Results
Assay-Lösung nicht-Fluoreszenz in Abwesenheit von embryonalen Fisch (1) zu erhöhen. Jedoch ist der Test sehr empfindlich auf kleine Änderungen der Stoffwechselrate im Bohrloch. Eine einzelne Fische innerhalb einer gut schafft ein Signal deutlich von leeren Brunnen innerhalb 1 Stunde (P <0,0001). Abbildung 2 bietet eine visuelle Darstellung der Signale, die von embryonalen Fische nach 24 Stunden Inkubation erzeugt. Für die Zwecke dieses Bildes klar seitige Vertiefungen wurden verwendet. Dennoch sind schwarz seitige Brunnen für die Assay-Leistung bevorzugt, Auslaugung des Fluoreszenzsignals aus dem nahe gelegenen Brunnen zu verhindern.
Da das NADH 2-induzierten Reduktion von alamarBlue ist nicht reversibel, das Signal mit der Zeit akkumuliert. Dies ermöglicht kleine Änderungen verstärkt werden. Um zu zeigen, dass die Unterschiede zu akkumulieren und dadurch mit der Zeit erhöhen, verfolgten wir die relative Veränderung in der Fluoreszenz durch 1-5 Fisch 1 induzierte, 2 und 4 Stunden (Abbildung 3). Bei jeder Anzahl von Fischen / well die relative Änderung der Fluoreszenz mit der Zeit signifikant (P <0,001) erhöht. Noch wichtiger ist, da das Signal mit der Zeit akkumuliert, die gewaltigen Unterschiede in der Fluoreszenzänderung, die von der Manipulation der Anzahl der Fische führen / Vertiefung ist robuster bei 4 h als bei 1 h Inkubation. Somit wird durch die Erhöhung der Dauer der Belichtung können wir die Fähigkeit von Differenzen mit einem bestimmten Behandlung verbunden werden, zu verbessern.
Abbildung 1. Vergleich der Rausch-Signal. Eine nachweisbare Veränderung der Fluoreszenz wird durch ein Zebrafisch in einer Platte mit 96 Vertiefungen bei 1 h erzeugt wird. Wells, die keine Fische (Rohlinge) zu erzeugen kleine Signal. Fehlerbalken stellen SEM (n = 5-8). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehendiese Figur.
Abbildung 2. visuelle Darstellung der Testplatte bei 24 Stunden. Repräsentatives Bild der Ergebnisse unter Verwendung dieses Tests erhalten. Rosa Brunnen weisen auf Fisch mit einem hohen Stoffwechselrate, lila Brunnen mäßiger Stoffwechselrate und Blau Brunnen eine niedrige Stoffwechselrate. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 3 Signaldifferenzen Amplify mit der Zeit. Der Unterschied in der durch Variieren der Anzahl von Fisch / Vertiefung mit der Zeit zunimmt erzeugten Fluoreszenzsignals. Da Signal sammelt sich mit der Zeit, die Größe der Fluoreszenzänderung weicht mit der Zeit betweensamples tHut unterscheiden sich in der Geschwindigkeit der Signalerzeugung. Fehlerbalken stellen SEM (n = 7).
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Discussion
Kontamination mit Bakterien oder Pilzen stark begrenzen Anwendung dieses Assays. Methylenblau in der E3-Embryomedium begrenzt die Möglichkeit einer Kontamination mit Pilzen. Im gesamten Embryo Aufzucht es wichtig, dass darauf geachtet wird, tote Embryonen zu entfernen zweimal täglich ist. Zusätzlich ist es wichtig, die Embryos mit sterilem E3 Embryo Medium gründlich am Tag Assayinitierungsbereich. Diese 2 Schritte begrenzen das Potenzial für bakterielle Kontamination der Embryonen. Die Einbeziehung der in Schritt 3.2 beschrieben leere Brunnen ermöglicht Nachweis einer etwaigen bakteriellen Kontamination. Bakterielle Kontamination, die ein messbares Signal liefert, ist selten. Allerdings, wenn die leeren Brunnen zu tun zeigen ein zuverlässiges Signal, das Assay sollte darauf geachtet werden, Sauberkeit Embryo zu erhalten wiederholt werden. Wenn der Benutzer erwartet, daß eine Verunreinigung ist, die vor dem Besamungs können die Embryonen gebleicht werden, wie vorstehend beschrieben (s. 22) 10. Alternativ, falls der Experimentator vermutetKontamination nach der Entnahme auftretende kann der Benutzer E2 mit Penicillin und Streptomycin nach hinten die Embryonen bis 4 dpf (p. 23) 10 zu verwenden.
Obwohl dieser Test ist wertvoll für die Anwendung in Embryonen, haben wir nicht auf ihre Gültigkeit in erwachsenen Zebrafisch untersucht. Wir vermuten, dass alle Funktionen in diesem Test würde bei erwachsenen Fischen durch schlechte Gewebepenetration von AlamarBlue begrenzt werden. Darüber hinaus ist in das Füttern von Fisch die Darmflora kann eine tiefgreifende Signal, keine Bedeutung für den Fischstoffwechsels zu erzeugen. Somit ist dieser Test auf die Verwendung in Eigelb Zuführen embryonalen Fisch nutzen. Die relative Untätigkeit der embryonalen Fisch bietet einen einzigartigen Vorteil, da dies die Variabilität, die mit Aktivität induzierte Energieaufwand 11 verbunden wäre begrenzt. Damit dieser Test ist ein einzigartiges Werkzeug, um die Stoffwechselrate als Reaktion auf genetische oder pharmakologische Manipulation in einem ganzen Tier-System zu untersuchen.
Der Zebrafisch ist schnell zu einem führenden Modell zur metabolic Störungen, die Fettleibigkeit zu begleiten. In der Tat, es gibt Modelle sowohl von transgenen und ernährungsbedingte Fettleibigkeit Zebrafisch 12,13 publiziert. Ähnlich wie bei Mausmodellen, Diät-induzierte Fettleibigkeit in der Zebrafisch erhöht Serumtriglyceride und Leberlipidakkumulation 12. Darüber hinaus haben füttert Zebrafisch Nüchternglukose erhöht, was darauf hindeutet, Glukoseintoleranz 14. Unter Verwendung der hier beschriebenen wir haben gezeigt, dass 24 h Vorbehandlung mit Metformin, einem Insulin-Sensibilisator, erhöht die Stoffwechselrate als Reaktion auf Insulin-Behandlung 5-Test. So kann die Zebrafisch zu beweisen, um eine ideale ganze Tiermodell, um Medikamente, die Insulinsensitivität (Embryo) verbessern zu entdecken und auf ihre Wirksamkeit bei der Linderung von Fettleibigkeit Insulinresistenz (Erwachsene) zu etablieren.
Die Entwicklung von genetischen und Diät-induzierten adipösen Zebrafisch-Modelle, die bei übergewichtigen Säugetieren beobachteten Phänotypen imitieren schafft den Anstoß für die Einleitung Zebrafisch stustirbt auf Stoffwechselerkrankungen konzentriert. Hochdurchsatz-Assays sind für vollständig schätzen den Wert des Zebrafisch-Modell zum Studium der Energie-Homöostase. Innovative Tools zur phagic Antriebs Beurteilung für Bildschirme auf Energieaufnahme konzentriert zu ermöglichen, während die Hochdurchsatz-Lipidspeichertests wird auf Studien über den ganzen Körper Lipidhomöostase 15-17 führen. Der Assay beschreiben wir hier ein hoher Durchsatz Werkzeug die Beteiligung der Gene, Verbindungen oder deren Interaktionen auf den ganzen Körper Energieaufwand zu bewerten.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlamarBlue | Fisher Scientific | 10-230-103 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fine Tip DisposableTransfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-26 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-771-9AM | Manufactured by Thermo Scientific |
| Black sided clear bottom 96-well plates | Fisher Scientific | 50-320-785 | Manufactured by E&K Scientific Products Inc. |
References
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