Abstract
El pez cebra son un importante organismo modelo con ventajas inherentes que tienen el potencial de hacer que el pez cebra un modelo ampliamente aplicado para el estudio de la homeostasis energética y la obesidad. El pequeño tamaño del pez cebra permite ensayos con embriones que se llevan a cabo en un formato de placa de 96 o 384 pocillos, tecnologías basadas Morfolino y CRISPR promueven facilidad de manipulación genética, y el tratamiento de drogas mediante la aplicación del baño es viable. Por otra parte, el pez cebra son ideales para pantallas adelante genéticos que permitan la novela de descubrimiento de genes. Dada la relativa novedad del pez cebra como modelo para la obesidad, es necesario desarrollar herramientas que explotan plenamente estos beneficios. En este documento, se describe un método para medir el gasto de energía en miles de pez cebra embrionarias simultáneamente. Hemos desarrollado una plataforma de microplacas animal completamente en que utilizamos placas de 96 pocillos para aislar peces individuales y evaluar la producción acumulada NADH 2 mediante el cultivo de células viabilidad re disponible en el mercadoagente alamarBlue. En poiquilotermos la relación entre NADH 2 la producción y el gasto de energía está estrechamente vinculado. Este ensayo gasto de energía crea el potencial para cribar rápidamente manipulaciones farmacológicas o genéticas que alteran directamente el gasto de energía o alteran la respuesta a un fármaco aplicado (por ejemplo, sensibilizadores a la insulina).
Introduction
El ratón es actualmente el modelo predominante para la investigación de la obesidad. El intervalo generacional corto y herramientas genéticas disponibles en el ratón han sido sin igual hasta la fecha. Sin embargo, el pez cebra también tiene un intervalo de generación corto (3 - 4 meses) y supera incluso el ratón en la facilidad de manipulación genética 1,2. El pez cebra mantiene cerca del 90% de los genes de mamíferos, mientras que muy por encima del ratón en el número de para su uso en pantallas genéticas y drogas 3 potencial y descendencia.
Para aprovechar el potencial del modelo de pez cebra para el estudio de la obesidad, los ensayos deben ser desarrollados para investigar los factores que influyen en la regulación del peso corporal, incluyendo el gasto de energía. Como metabolitos se procesan a través de β-oxidación y el oxígeno ciclo de ácido tricarboxílico se consume NADH y 2 se produce. Por lo tanto, NADH 2 es un indicador directo del flujo de metabolitos a través de las vías metabólicas de oxidación (metabolito). En poikilotherms, H + a través de fugas de la membrana mitocondrial interna, que desacopla la oxidación de NADH 2 la síntesis de ATP, es 4 - 5 veces más baja que en homeotermos 4. En consecuencia, en el pez cebra NADH 2 está muy estrechamente vinculada a la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa. En este documento, se describe un ensayo que mide NADH 2 la producción en larvas de pez cebra como un proxy para el gasto de energía 5.
El consumo de oxígeno es el estándar de oro para medir el gasto de energía. Sin embargo, para aprovechar al máximo el alto potencial de rendimiento del pez cebra, los ensayos de gasto de energía deben ser susceptibles de alto rendimiento. Sistemas de consumo de oxígeno que dependen de una cámara cerrada sistema de circulación están limitadas en el rendimiento por el número de cámaras disponibles 6. Abrir aire consumo de O 2 / CO 2 ensayos de producción también se han aplicado en el pez cebra 5,7. Estos al aire libre de 96 pocillos placa basesistemas d son susceptibles de alto rendimiento. Desafortunadamente, el intercambio de gases con el medio ambiente limita la sensibilidad de estos ensayos. Hemos publicado recientemente la aplicación de un ensayo que monitoriza NADH 2 utilizando el indicador redox alamarBlue 5. Este ensayo supera las limitaciones en el rendimiento y la sensibilidad común a los análisis de consumo de oxígeno en el pez cebra.
El pez cebra se está convirtiendo en un modelo cada vez más importante para el estudio de toda la homeostasis de la energía del cuerpo. En parte, porque el pez cebra son susceptibles de uso en pantallas adelante genéticos y las pantallas de drogas. Por otra parte, dirigida manipulación genética, incluyendo caída y knock-in, se puede aplicar rápidamente. Hemos demostrado anteriormente que este ensayo se puede combinar con la aplicación del fármaco bañera y desmontables genética o knockout para identificar compuestos y genes que alteran la tasa metabólica 5. Por otra parte, este ensayo está diseñado para explotar las ventajas de alto rendimiento inherentes al pez cebra.
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Protocol
Nota: Este protocolo sigue las directrices de la Universidad de Arizona Oficina para la Realización responsable de la investigación y ha sido aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional
1. cría de pez cebra y mantenimiento de embriones
- Preparar E3 medio embrión 8. Hacer 60x solución madre, disolver 34,8 g de NaCl, 1,6 g de KCl, CaCl 2 5,8 g ● 2H 2 O, y 9,78 g de MgCl 2 ● 6H 2 O en 1,95 L ddiH 2 O. Ajustar el pH a 7,2 con NaOH y HCl Ajustar el volumen a 2 L utilizando ddiH 2 O.
- Para preparar el medio embrión 1x E3, diluir 16,5 ml 60x acciones en 1 L ddiH20. Añadir 100 l 1% de azul de metileno.
- Cría
- Casa Masculino y Femenino cría de valores (7 - 18 meses de edad) por separado para maximizar la fecundidad.
- Apague las luces 1 - 2 horas antes del día anterior se desean huevos. Configurar el apareamiento (1 macho y 1 - 2 hembras) en la cjaulas Rossing anteriormente descritos 9. Cruce de jaulas permiten los huevos para escapar de la depredación a medida que pasan a través de la base perforada de la inserción tanque en el que se llevan a cabo los peces adultos.
- Opcional:. Para la reproducción programada, (como sería necesario para estudios con morfolino inyección), separar el macho y las hembras por un divisor de plástico transparente, Eliminar a esta por la mañana para dar lugar a la colocación oportuna de los huevos y la fertilización. Para morfolino estudios, realizar cálculos de potencia para evaluar el número de peces embrionaria requerido por tratamiento. Sin una estimación de la magnitud del efecto o variación, un ensayo preliminar se puede ejecutar con un n = 8.
- Verter los huevos de la jaula de cruce en una placa de Petri (100 - 150 embriones / 10 cm placa de Petri). Permitir que los huevos se depositan en el fondo del plato y verter fuera del agua. Retire cualquier resto de agua utilizando una punta fina transferencia desechables pipeta. Añadir espalda medio E3 embrión hecho en el paso 1.1.
- Hacer afpipeta desechable pulido cojo para el futuro de huevo y la transferencia de los peces. Con unas tijeras, corte una pipeta de transferencia desechable se graduó en la graduación de 0,25 ml. Para eliminar los bordes ásperos, esmalte de la llama de la punta de corte sobre un mechero Bunsen.
- Mantener peces embrionaria hasta 4 días después de la fertilización (dpf) en 10 cm placas de Petri en medio de embrión de pez cebra E3 28.5 ○ C. Dos veces al día, use una llama pulido graduó pipeta de transferencia desechable para eliminar los huevos no fertilizados o embriones muertos (de apariencia blanca opaca). Una vez que cada día, sustituya medio embrión E3. Vierta medio embrión E3, eliminar el líquido restante utilizando una punta fina transferencia desechables pipeta, y añadir de nuevo precalentado (28.5 ○ C) medio embrión E3.
2. Prepare la solución de ensayo
- Preparar la solución de ensayo de acuerdo con la Tabla 1. solución de ensayo de filtro estéril utilizando un filtro de 0,22 mM. Antes del ensayo de iniciación, calentar la solución de ensayo estéril en un 28,5 ○ Cbaño de agua.
| Ingrediente | % del total | Volumen (l / 10 ml) |
| 60x E3 Embrión Medio | 1,667 | 166.7 |
| Doble desionizada (ddi) H 2 0 | 96.233 | 9623.3 |
| Alamar Blue | 1 | 100 |
| NaOH 400 mM | 1 | 100 |
| DMSO | 0.1 | 10 |
Tabla 1. Medio de Ensayo
3. Realizar Ensayo
- Enjuague embriones de pez cebra 3 veces con medio de embrión E3 filtrada estéril. Combine todos los embriones de pez cebra viables desde el embrague en un vaso. Filtro estéril 75 ml medio embrión E3. Usando una punta fina transferencia desechables pipeta, remover la mayor cantidad de medio de embrión E3 a partir de los embriones de pez cebra como sea posible. Añadir volver 20 ml de medio embrión E3 filtrada estéril. Retire y reemplace medio embrión E3 3 veces.
- Placa 1 pescado en cada uno de los 93 pozos de un negro de 96 pocillos se puso del lado clara placa inferior. Transferir el pescado embrionaria a la placa mediante la captura individualmente un embrión dentro de una llama pulida pipeta de transferencia de plástico desechable se graduó (paso 1.5) y expulsar suavemente en el pozo. Traslado medio embrión E3 tomado del vaso que contiene el pescado se enjuaga en los 3 pozos en blanco. Esto asegura que los pozos en blanco han sido expuestas a la misma agua exacta que los pocillos que contienen pescado. Ambos pozos que contienen los peces y los pozos en blanco debe ser de al menos ½ completo (200 l) en la conclusión de este paso.
- Reemplace medio embrión E3 con una solución de ensayo en los 96 pozos, incluyendo pozos en blanco. Este paso se debe realizar 1 columna a la vez para cada una de las 12 columnas en una placa de 96 pocillos. Usando una multa punta desechable transfer pipeta, retire medio de embrión E3 a partir de cada pocillo en una columna de la placa (8 pocillos). Tenga cuidado de no tocar el embrión de pez cebra. Añadir 300 l de solución de ensayo a cada pocillo de la que se elimina el agua. Repita la eliminación de medio de embrión E3 y el reemplazo con una solución de ensayo para todas las 12 columnas de la placa.
- Opcional: Para probar el cambio de tasa metabólica en respuesta a un compuesto, hacer una solución que es 100 veces (100X) la concentración de tratamiento deseado. De nota, asegúrese de que la solución 100x no supere el 10% de DMSO para limitar la concentración final de DMSO a no más de 0,1%. Añadir 3 l de la solución 100x para cada uno de los pozos de tratamiento.
NOTA: Realizar cálculos de potencia para evaluar el número de pozos de tratamiento. Sin embargo, sin una estimación de la magnitud de la respuesta o variación, un ensayo preliminar se puede ejecutar en 8 compuesto tratado y 8 pocillos de control tratados con el vehículo que contienen pescado.- Añadir 3 l de control del vehículo al control (sin drug tratamiento) pozos que contienen peces. Para asegurar que la respuesta fluorescente compuesto es un resultado de las acciones dentro de los peces, aplicar tratamientos farmacológicos y de vehículos para 3 pozos en blanco en una placa de 96 pocillos.
- Leer pescado plato lleno de lector de placas fluorescente con la longitud de onda de excitación a 530 nm y longitud de onda de emisión a 590 nm.
- Coloque la placa en la incubadora humidificado establece en 28,5 ○ C (mantener la placa en la oscuridad durante todo el ensayo para evitar photobleaching de la solución de ensayo). El ensayo se puede ejecutar para las duraciones de tiempo que van desde 1 hr a 24 hr. La duración del ensayo depende del objetivo del estudio. Para probar la respuesta a una corta compuesto no estable actuación corta duración puede ser más adecuado. Sin embargo, para las pruebas compuesto estable o pruebas de efectos genéticos, es preferible para explotar las ventajas asociadas con la señal acumulativa maximizar la duración del ensayo.
- En un punto de tiempo predeterminado (consulte el paso 3.6 para ayudar a determinar el momento)leer la fluorescencia de la placa de peces llenos de nuevo con la misma configuración que el paso 3.5.
4. Evaluar el cambio relativo en la fluorescencia asociada con el tratamiento
- Calcular cambio en la fluorescencia de cada pocillo restando la fluorescencia en el tiempo 0 de la fluorescencia a la conclusión del estudio. Wells sin peces (espacios) deben tener valores cercanos a 0, muy por debajo de los valores de los pozos que contienen peces.
Cambio en la fluorescencia = Fluorescencia en la conclusión - de fluorescencia en el tiempo 0 - Para determinar el cambio relativo en la fluorescencia, calcular el cambio medio en la fluorescencia de los pocillos de control luego dividen el cambio en la fluorescencia de cada pocillo por la variación media de la fluorescencia de los pocillos de control. Es de destacar que los controles podrían ser tanto los controles del vehículo o controles genéticos.
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Representative Results
Solución de ensayo no aumenta la fluorescencia en ausencia de peces embrionario (Figura 1). Sin embargo, el ensayo es altamente sensible a pequeños cambios en la tasa metabólica dentro del pozo. Un solo pez dentro de un pozo crea una señal significativamente diferente de los pozos en blanco dentro de 1 h (P <0,0001). La Figura 2 proporciona una representación visual de las señales generadas por los peces embrionario después de 24 h de incubación. Para el propósito de esta imagen se utilizaron pozos lados claros. Sin embargo, se prefieren los pozos negros lados para el rendimiento del ensayo para evitar la lixiviación de la señal fluorescente de los pozos cercanos.
Debido a que la reducción de NADH 2 inducida de alamarBlue es no reversible, la señal se acumula con el tiempo. Esto permite pequeños cambios a amplificar. Para demostrar que las diferencias se acumulan y por lo tanto aumentan con el tiempo, que supervisó el cambio relativo en la fluorescencia inducida por 1 a 5 peces en 1, 2 y 4 horas (Figura 3). En cada número de peces / bien el cambio relativo en la fluorescencia aumentó significativamente con el tiempo (p <0,001). Más importante, porque la señal se acumula con el tiempo, la magnitud de las diferencias en cambio de fluorescencia que resultan de la manipulación de la cantidad de peces / pocillo es más robusto en 4 hr 1 hr que en la incubación. Por lo tanto, mediante el aumento de la duración de la exposición que podemos mejorar la capacidad de detectar diferencias asociadas con un tratamiento dado.
Figura 1. Comparación de ruido a la señal. Un cambio detectable en la fluorescencia se genera por 1 pez cebra en una placa de 96 pocillos en 1 hr. Wells que no contienen pescado (espacios) generan poca señal. Las barras de error representan SEM (n = 5-8). Haga clic aquí para ver una versión más grande deesta figura.
Figura 2. Representación visual del ensayo de placa a las 24 horas. Imagen representativa de los resultados obtenidos con este ensayo. Pozos rosa son indicativos de pescado con una alta tasa metabólica, pozos púrpura una tasa metabólica moderada, y los pozos azules una tasa metabólica baja. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Diferencias Figura 3. La señal Amplifique con el tiempo. La diferencia en la señal fluorescente generada por la variación del número de peces / pocillo aumenta con el tiempo. Debido a que la señal se acumula con el tiempo, la magnitud del cambio de fluorescencia diverge con betweensamples tiempo tsombrero diferencia en la tasa de generación de señal. Las barras de error representan SEM (n = 7).
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Discussion
La contaminación con bacterias u hongos limitará en gran medida la aplicación de este ensayo. El azul de metileno en el medio embrión E3 limita la posibilidad de contaminación por hongos. A lo largo del embrión criando es fundamental que se tenga cuidado para eliminar embriones muertos dos veces al día. Además, es esencial para enjuagar bien los embriones con medio de embrión E3 estéril en el día de la iniciación del ensayo. Estos 2 pasos limitan el potencial para la contaminación bacteriana de los embriones. La inclusión de pocillos de blanco descrito en la etapa 3.2 permite la detección de cualquier contaminación bacteriana. La contaminación bacteriana que produce una señal medible es raro. Sin embargo, si los pozos en blanco sí muestran una señal robusta, el ensayo debe repetirse con cuidado para mantener la limpieza de embriones. Si el usuario espera que la contaminación está surgiendo antes de la recolección de los embriones, los embriones pueden blanquearse como se describió previamente (p. 22) 10. Alternativamente, si el experimentador sospecha quela contaminación se produce después de la recolección el usuario puede utilizar E2 con penicilina y estreptomicina a la parte posterior de los embriones a 4 dpf (p. 23) 10.
Aunque este ensayo es valioso para su aplicación en los embriones, no hemos probado su validez en el pez cebra adulto. Tenemos la sospecha de que la funcionalidad de este ensayo se limitaría en peces adultos por la mala penetración en el tejido de alamarBlue. Por otra parte, en los peces alimentar la microbiota intestinal puede producir una señal profunda, no es indicativo del metabolismo de los peces. Por lo tanto, este ensayo se limita al uso en la yema de alimentación de los peces embrionario. La inactividad relativa de peces embrionaria ofrece una ventaja única, ya que esto limita la variabilidad que se asocia con la actividad inducida por el gasto de energía 11. Por lo tanto este ensayo es una herramienta única para detectar la respuesta de la tasa metabólica a la manipulación genética o farmacológica en un sistema animal completo.
El pez cebra se está convirtiendo rápidamente en un modelo de líder para la mperturbaciones etabolic que acompañan a la obesidad. De hecho, no se publican los modelos tanto de la obesidad pez cebra transgénico y inducida por la dieta 12,13. Al igual que en los modelos de ratón, la dieta obesidad inducida en el pez cebra aumenta los triglicéridos séricos y lípidos hepáticos acumulación 12. Además, el pez cebra sobrealimentado han elevado de glucosa en ayunas, lo que sugiere intolerancia a la glucosa 14. Utilizando el ensayo descrito aquí hemos demostrado que 24 h de pretratamiento con metformina, un sensibilizador de insulina, aumenta la respuesta tasa metabólica para el tratamiento con insulina 5. Así, el pez cebra puede llegar a ser un modelo animal entero ideal para descubrir fármacos que mejoran la sensibilidad a la insulina (embrión) y establecer su eficacia en el alivio de resistencia a la insulina relacionada con la obesidad (adulto).
El desarrollo de modelos de pez cebra con obesidad genéticos e inducidos por la dieta que imitan los fenotipos observados en mamíferos obesos crea el impulso para iniciar stu pez cebramuere centrado en la enfermedad metabólica. Ensayos de alto rendimiento son esenciales para apreciar plenamente el valor del modelo de pez cebra a los estudios de la homeostasis energética. Herramientas innovadoras diseñadas para evaluar unidad fágico permitirán pantallas centradas en el consumo de energía, mientras que los ensayos de almacenamiento de lípidos de alto rendimiento conducirán a estudios sobre todo el cuerpo de lípidos homeostasis 15-17. El ensayo se describe aquí proporciona una herramienta de alto rendimiento para evaluar el papel de los genes, compuestos o sus interacciones en el gasto de energía de todo el cuerpo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlamarBlue | Fisher Scientific | 10-230-103 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fine Tip DisposableTransfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-26 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-771-9AM | Manufactured by Thermo Scientific |
| Black sided clear bottom 96-well plates | Fisher Scientific | 50-320-785 | Manufactured by E&K Scientific Products Inc. |
References
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. PNAS. 110, 13904-13909 (2013).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Sci. Rep. 4, 6545 (2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile. Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).
- Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish. Zebrafish. 10, 343-352 (2013).
- Livingston, R. J. A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals. J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).
- Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish. J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).
- E3 medium (for zebrafish embryos) Cold Spring Harb. Protoc. , http://cshprotocols.cshlp.org/citmgr?gca=protocols%3B2011%2F10%2Fpdb.rec66449 (2011).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53, 161-168 (2012).
- Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Zebrafish, A practical approach. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).
- Fry, F. E. J., Hart, J. S. Cruising speed of goldfish in relation to water temperature. J. Fish. Res. Board Can. 7, 169-175 (1948).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC physiol. 10 (21), (2010).
- Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).
- Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner. Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).
- Flynn, E. J. 3rd, Trent , C. M., Rawls, J. F. Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio). J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).
- Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PloS one. 7, e52549 (2012).
- Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity. J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).
