Introduction
最近的癌症研究已发现遗传变异，分子变化和可能的治疗各种脑肿瘤取得显著的进步。尽管这一进展，脑肿瘤仍然是癌症相关死亡的成人和儿童的顶尖原因之一。限制因素脑瘤研究包括伯患者样本和细胞系的有限的可及在复制在可访问的实验系统的独特和异构脑微环境的难度。对于许多脑瘤维持肿瘤细胞随时间尚未得知所要求的条件。甚至对于可以在细胞悬浮液作为神经球来生长脑瘤，培养条件可影响肿瘤细胞1,2-。实际上，在加入碱性成纤维细胞生长因子或表皮生长因子，以鼓励增殖，抑制分化可以改变基因的表达1。其它方法对于肿瘤细胞的生长，例如如通过肿瘤细胞的原位或皮下异种移植物的小鼠的肿瘤传播是有价值的测定法，但由因子如肿瘤发展（尤其是对于低级别肿瘤），成本，和肿瘤细胞的数量的时间可以注射和研究是有限。因此，目前的方法种植人脑肿瘤细胞是不足以维持某些类型的肿瘤，而且还提供人工环境不这样做密切模仿体内肿瘤环境中。
不同类型的小儿脑肿瘤大脑内生长中高度专业化的位置[3,4]，这是可能反映肿瘤生长不同微环境的要求[5]。这个协议描述了一种新颖的系统，其中的细胞是难以在正常培养条件来传播可以在器官型脑微环境中生长该模拟在体内肿瘤生长的条件。在这种定量测定中，荧光标记的脑肿瘤细胞接种在幼年小鼠大脑器官切片，并随时间监测。该测定可用于研究微环境对肿瘤生长的影响，并在临床相关的脑微环境，以测试新的药物治疗方法。
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Protocol
伦理声明：以下步骤涉及动物受试者按照卫生准则的国家机构完成并批准Dana-Farber癌症机构动物护理和使用委员会。所有的人类受试者的工作得到了机构审查委员会委员会的布莱根妇女医院和Dana-Farber癌症研究所，以及斯坦福大学的适当使用，所有受试者在需要时获得了知情同意书，并适当减免同意要求审查为最低风险的研究获得。
时间线切片文化协议：
图1.时间表脑肿瘤/器官切片共培养协议 。此图描绘了切片培养过程的时间表涵盖所有8天Øf显示实验并且过程的主要步骤。时间轴是相对于0天当细胞以突出电镀细胞前开始的程序天的重要性镀到切片。 请点击此处查看该图的放大版本。
1.解剖缓冲区
- 制备15mM的HEPES（1μM），6.5mg / ml的葡萄糖，1.3毫硫酸镁（1μM），20mM的氯化钾（2 M）和1％青霉素/链霉素在1×HBSS中。
- 调节pH至7.4，用NaOH。
- 过滤并储存在-20℃。
2.切片文化传媒
- 制备2％的B-27，1％N2补充，1％青霉素/链霉素，1％Glutamax的，和1.5mg / ml的葡萄糖中的Neurobasal-A培养基减去苯酚红。
- 过滤并储存在-20℃。根据需要解冻，和1周后丢弃在4℃。
注意：下面的过程可以做到上Ë日开始解剖前。 - 3％低熔点琼脂糖
注意：下面的过程可以做高达一天开始解剖前。 - 琼脂糖混合0.9克低熔点成〜31毫升夹层缓冲液，微波25秒，瓶盖松动。微波，直到融化并确保混合物不溢出。
- 保持在55-65°C，直到需要。
注意：下面的过程可以做高达一天开始解剖前。
4.大衣切片文化插入与层粘连蛋白
注意：下面的过程可以做高达一天开始解剖前。
- 在组织培养罩，用无菌镊子，将一个切片培养插管在一个6孔板的每个孔（符合打算获得的片数，大约为12可以从一个过程回收。下面的过程用于书面6个片层）。填写一个15毫升的锥形牛逼 UBE用1×PBS（800微升/插入），并添加层粘连蛋白（10微克/毫升）。
- 添加800微升层粘连蛋白混合物与每个切片培养插管的顶部。直到需要在37℃。
5.准备解剖
- 填充6孔板的每个孔与1200微升切片培养介质。填充任何未使用的井1200微升PBS和填充板的中心空间用5毫升1X PBS。存放该板在37℃。
- 消毒在70％乙醇清扫工具。擦拭vibratome刀片用丙酮去除油污，使用前消毒。
- 将三个35毫米2菜肴和五个10cm 2的组织培养皿中的油烟机。填写1个10 平方厘米的菜在冰上解剖缓冲和地点。
注意：进程幼仔一次一个。
6.解剖
注意：进程幼仔一次一个。
ES / ftp_upload / 53304 / 53304fig2.jpg“/>
图2.解剖削减。这些图像显示了必要的清扫削减从P6小鼠的大脑取出的头骨。切口是如虚线所示。（A）的剪切1被示出。削减1和2被从脑干/后部两侧连接到眼窝每侧..（B）的剪切3和4示出制成。切3从一个眼窝向其他削减连接1和2.切4开始在切割3的中线，并继续朝着鼻子划分嗅球之间的头骨（比例尺= 4.4Hz毫米）。尖请点击此处查看该图的放大版本。
- 麻醉用异氟醚曝光（100％异氟醚）的P6鼠标。大约5分钟呼吸变慢或出现呼吸的迹象时，迅速斩首鼠标用锋利的剪刀。喷雾头，用70％的乙醇，并装在一个组织培养皿。
- 采用大钝钳捏住鼻子头抱稳。使用中型清扫剪刀，去除多余的皮肤露出头骨。
- 使削减1和2切割颅骨两侧，从上向两侧前方的颅骨后，连接切到眼窝。保持尽可能靠近颅骨尽可能避免组织损伤的剪刀的尖端。
- 对于切3，用小弹簧剪刀连接削减1和2。然后用小钝钳轻轻剥离头骨。
- 使用小弹簧剪刀，轻轻沿中线切开剩余颅骨上顶，这样剩余颅骨变为2半部（ 图2中 ，切＃4）。使用镊子剥离颅骨以显示两个嗅球。
- 将平面铲（沾夹层缓冲，所以组织会不会坚持下去）的B之间脑和颅底ottom，轻轻取出大脑并放入冰夹层缓冲的菜。
- 重复步骤6，以获得第二脑切片
7.嵌入在琼脂糖大脑
- 放置两个第35毫米2碗碟上的冰开放和擦拭的一对大钝钳用70％的乙醇。
- 倾3％低熔点琼脂糖（在步骤3中制备）进入两个菜直到在顶部的圆顶形式。 3分钟设置计时器。在3分钟（试验通过触摸琼脂糖填充圆顶的边缘，如果能够观察到琼脂糖的聚合，它已经准备好）拿起1脑钝钳和地方变成琼脂糖填充35mm培养皿的一侧，然后移动它的菜心（这去除多余的夹层缓冲大脑周围所以它挂载更好）。
- 重复的第二大脑。启动一个定时器10分钟。
- 10分钟后，将平铲入之间的空间琼脂糖和菜弹出包含P6大脑聚合琼脂糖。
- 使用平刀片修剪琼脂糖到周围的脑立方体，确保其边缘尽量伸直。
- 将强力胶的vibratome板两条。然后，拿起琼脂糖安装的大脑，轻轻地往下砸过胶，定位于矢状切片。用同样的方法在其他脑。确保两个大脑一字排开彼此。
- 让胶水干在室温下5-8分钟。在这段时间里，填充用碎冰和水的vibratome的冰保持器区域。
8.与Vibratome切片
- 将切割藏进了冰架区，移动的标签来锁定到位的权利。
- 使用圆形头螺丝刀，拿起圆vibratome板粘在它的大脑，并适应它进入水库。取出螺丝刀和固定板的地方有个Ë六角螺丝刀。确保板和切割水库坚决到位。
- 使用镊子，皮卡vibratome刀片，将它列入切割头，锁到位内六角螺丝刀。然后，固定切削头与附接的叶片上使用轮螺丝vibratome。
- 调出剃刀到尽可能靠近琼脂糖包埋脑尽可能的位置，同时确保剃刀是在相同的高度（或正上方）的大脑。填充室具有足够的冷解剖缓冲器以覆盖刀片。
- 按↕按钮（你应该看到它闪烁，该按钮定义了边界时将刀片来回走），然后按住“前进”手动剪切嵌入的大脑，释放到剃刀清除琼脂糖块。立即再次按下↕按钮，这将确定自动切割的范围的结束。
- 按“SINGLE / CONT”按钮一次，第l飞行由CONT应该继续下去。切割厚度设定为400-450微米，振动频率以5.5-6，以及速度为4。这将是剪裁设置。
- 按“启动/停止”键一次，自动切割应该开始。按“暂停”用勺孔，因为需要收集组织。它大约需要5-10分钟，以达到接近中线。在这一点上，按“暂停”，改变速度为3，厚度改为200微米。不要收集进行此更改后产生的第一片。
- 为200μm厚度所需的切片将不得不通过小脑嗅球很好地限定。转移的每个期望的切片，因为它们切成6孔板填充在冰上解剖缓冲器。通过移动的缓冲区切片室组织周围漂浮片，触摸它尽可能少的，将其从缓冲区时，它是正视在漏勺做到这一点。通常约为12片具有所需的结构可以收集。切片可留在解剖上冰缓冲液中达20分钟。
- 而切片是在冰上，取出6孔板带插入涂覆有从37℃培养箱层粘连蛋白。在夹层罩丢弃层粘连蛋白，注意不要损坏刀片。添加3.5 ml的切片培养介质的每个刀片的顶。媒体的顶部会形成一个圆顶形状而不溅出入井。
9.镀切片到插入
- 使用漏勺工具，将脑切片到媒体上的插入，轻轻推片被完全淹没。重复所有切片。
- 使用P1000绘制出1 ml的切片培养介质从刀片的顶和分配入井的底部。卸下并丢弃多余的介质，直到周围的大脑琼脂糖边缘slicebecome可见。这样做对其余切片。
- 拿起吨他用钳，倾斜的边缘插入和取出多余的介质。然后，插入迅速转移到35毫米2道菜含有1ml片培养基。使用2对尖锐钳去除周围组织琼脂糖，注意不要伸/损坏片或戳一个孔膜（最简单的，如果你犯了一个催泪在琼脂糖的边缘，然后将除了琼脂糖任何一方）。然后将插入物回6孔板并重复对其余切片。
- 在组织培养罩与鼓风机关闭（以防止变干片）从每个膜除去琼脂糖片段。
- 转移切片在步骤5.1中制备的6孔板和板存储于37℃。片孵育24-48小时。
10.更改切片文化传媒
- 用新鲜的6孔板重复步骤5.1。
- 在组织培养罩与送风机关闭时，插入物转移到新的6孔板续癌宁新鲜切片媒体。
对11片镀肿瘤细胞
- 超声处理的CM的DiI染料和旋转中速2分钟。
- 被用于覆盖在201×g离心5分钟降速肿瘤细胞。然后悬浮在2ml片培养基。
- 加7微升出Cm的DiI入2 ml的细胞和培养基的孵育在37℃下20分钟。
- 在200μl切片媒体降速细胞在201 XG 5分钟，重悬。轻轻磨碎以解离细胞（10-20次，或直至沉淀消失），然后添加800微升切片媒体，使1000微升总体积。
- 计数采用台盼蓝存活的肿瘤细胞。绿色荧光微球添加到肿瘤细胞，在相同的浓度的细胞。这些惰性微球将作为对照。在201×g离心降速细胞/微球体混合物5分钟，然后重悬在切片培养介质的所需量。板细胞以6000个细胞的密度/ SL冰在65微升的体积。细胞每片镀的数量可以根据喜好和可用性增加。
- 在组织培养罩分配细胞在65微升媒体/切片置于该片中的中心。
12.成像和修复
注：尼康的Eclipse镍C2si直立共聚焦被用来取整矢状切片的大图像扫描4×红色和绿色荧光通道。如果扫描功能不可用，取多个图像顺序地穿过切片和后来拼接图像在Photoshop（使用微球的位置和片的边缘进行导航）。
- 第二天（1天成像），转移片分为六35毫米2菜1毫升片培养基。图像中的每个切片一次一个在荧光显微镜直立。采取全矢状切片在4X用红色和绿色荧光通道的大图像扫描。保持激光和增益设置相同的每个片段。在成像结束，全部转让切片回含有新鲜切片媒体6孔板。
- 如果另外EDU，其它增殖标志物或药物情况的需要，建立分片介质的股票与将日常使用的介质改变了治疗病情的药物。治疗情况应该在步骤12.1（紧接第1天成像）被引入。任何EDU或增殖标记应添加到媒体也开始在12.1和每日刷新（使用EDU在10μM）。
- 图片第7天再次使用相同的设置第1天的图像。
- 经过7天的成像完成后，将每片到6孔板每孔含1.2毫升4％多聚甲醛（PFA）的。小心缓慢地滴上每一片的顶部额外1毫升煤灰。留在RT 1小时。
- 从每个孔，并从每个切片的顶部除去煤灰。用PBS洗涤每口井的3倍。存储在PBS切片在4℃染色或安装在载玻片上。
注意：ImageJ的设置可能需要调整和优化，以考虑图象和显微镜质量以及肿瘤细胞大小。
图片13定量（使用ImageJ）
注意：ImageJ的设置可能需要调整和优化，以考虑图象和显微镜质量以及肿瘤细胞大小。
- 在ImageJ的，使用多边形工具来勾勒整个切片或要量化的区域。加入此选择的投资回报率经理，你可以将其重命名并保存它。
- 右键单击选定区域，然后选择复制。名称与本地区，分片，一天，这个重复的图像。按CTL + Shift键+ E显示轮廓，然后选择过程 - 扣除背景 - 风水球半径= 4。
- 经过背景减法，选择“图像”下拉菜单中选择“调整门槛”。检查黑暗的背景 -;看图像放大和设置的阈值。当你通过移动阈值条设置的阈值，确保所有细胞都包含/突出，但非常小圆点是碎片（或小于电池）不包括在内。使用相同的阈值的所有图像。移动阈值窗的一侧。
- 选择“程序” - “查找千里马”，并设置5至10的噪声容限和检查以下内容：预览点选择，输出类型为分段颗粒，排除边缘最大值，高于下限阈值。然后按CTL + Shift键+ E重新选择感兴趣的区域。
- 选择从分析下拉菜单“分析粒子”。设置像素大小到4-40和圆形到0.00-1.00。也可以点击“显示叠加轮廓”，“显示结果”和“汇总”，然后按确定。
- 记录所有的原始数据，并在Microsoft Office文档的摘要。 “计数”为每个区域我Ş需要计算在周文化的倍数变化。
- 重复此过程为所有图像和感兴趣的领域，确保门槛和其他设置保持一致。
- 周期间计算细胞数量的倍数变化在该切片上培养由细胞的第1天同样的切片上数除肿瘤细胞的数量的片上在第7天，每个区域内的倍数变化在细胞数通过在第7天分裂细胞的数量在该区域由细胞的数目在该区域第1天计算的。
- 执行的微步13.8为好。片上微球数量应该是在第7天的相同的第1天（倍数变化= 1）。类似地，每个区域内的微球数量应该是在第7天的相同的第1天（倍数变化= 1）。如果折变化不同于1，表示随时间的变化片形貌。
14.染色
- 磁带在th一块封口膜Ë实验台，并绘制六界与液体阻滞剂PAP笔（每个分片，只是比片的大小）。放置约400微升PBS中在每个圆的中间的点。号或标记的圆圈，以确定每个切片。
- 1毫升的PBS，用刀片切割片围绕一个正方形，留下膜切片周围的一些空间。使用镊子将切出片到第一圈，仔细躺在PBS的泡沫顶部的切片。重要的是要确保切片不翻转折迭或得到翻转在此过程颠倒。然后，从切片下方取出PBS，并把它放在片的顶部，如果需要的话，以确保它仍然淹没添加更多的PBS。重复每个片这一步。
- 使10个ml的在PBS中的3％BSA的。取输出2毫升，并加入100微升毛地黄皂苷的吧。混合，并加入到切片以阻止和透化，在室温30分钟。
注意：使用的其他透剂如三吨X-100将导致的CM-的DiI标记的损失。 - 除去透化/封闭溶液和冲洗3次，用PBS 10分钟。
- 如果染色EDU，按照提供的套件组装混合物的方向。 45分钟涂敷混合物。如果与其它抗体染色，协议必须为初级和次级抗体的浓度（〜1小时RT下主和次）进行优化。冲洗3次，用PBS 10分钟。
- 染色用DAPI 1:1,000在PBS 5分钟室温。漂洗2次，用PBS。
15.安装了片
- 切片转移至显微镜载玻片。确保与片膜的一面仍然朝上，并且不翻转折迭。绘制切片周围的边框有液体阻滞剂PAP笔。
- 放置一个小玻璃盖玻片（5毫米）上的片的每一侧（保持被损坏的切片）。上的顶部落下的两个或三滴Fluoromount-G（对于免疫荧光）切片只是勉强覆盖。然后盖片长盖玻片（24×50毫米）。
- 重复每个切片。密封用指甲油和存储幻灯片的边缘，在4℃。做染色共聚焦成像。
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Representative Results
本节中举例说明了从利用所述脑瘤/器官切片共培养来研究区域微环境的偏好，以及测试新的疗法预期的结果的类型。我们表明，在测定被设计为复制的微环境脑肿瘤，作为组织的组织和切片的增殖状态被维持（图3）。我们还表明，增加了片随时间对肿瘤细胞的数目可以部分地是由于细胞到脑切片微环境的迁移（ 图4）。我们还表明，这个共培养可作为一个定量测定通过计算细胞数的倍数变化在周中培养切片的特定区域，或为整个脑切片（图6）从多个初步结果肿瘤细胞类型表明，肿瘤细胞的数目可以通过共焦成像来定量200微米厚的片，由于这样的事实，将细胞仅迁移到深度为20-50微米到切片。
我们已发现，绿色荧光微球是一种有效的控制更改在切片地形，因为它们表明在培养无运动或变化的数量在整个时间（图5）。定影共培养后，染色可以做到以检查肿瘤细胞中的一个脑微环境和药物对肿瘤细胞的增殖，细胞死亡，或改变蛋白质表达的影响（图7）。我们已经证明，此测定法可用于通过与一个的Smo（的Smoothened）拮抗剂LDE225（Sonidegib）或与载体对照处理的小鼠髓母细胞瘤细胞的比较，以测试药物疗法。在培养折片上增加细胞数目超过一周，进行了量化，并用图形表示（关于第1天第7 /细胞数细胞数）这些数据表明，LDE225大大德相比于对照6折痕肿瘤细胞数。这个效果也可以在代表性图像看出包括（图8）。我们还表明，在切片培养法（图9）生长的人类髓母细胞瘤细 胞的图像。
图3.脑肿瘤/器官型切片共培养检测设计。（A）中从一个P6小鼠器官矢状脑切片直接放置在一个半多孔膜和介质加入到培养皿的底部。培养浸没在介质上的一个侧面，并且可供从另一侧氧气。标记的肿瘤细胞被覆盖在切片和细胞数目可以遵循随时间。（B）中在培养中，切片保持组织的组织，非常类似于在体内观察到的。 Preservation中的脑微环境是表现为对在切片培养内小脑的外部颗粒层（EGL）增殖性颗粒神经元前体EDU标记。在切片培养，这些前体细胞纳入胸苷模拟EDU， 它可以在体内 ，在这个发展阶段（P6）（白色箭头指示EGL）来观察。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.人星形细胞瘤细 胞在脑肿瘤/器官切片共同培养实验，在切片上人类的大脑肿瘤细胞可能反映了从膜的切片培养重新定位的肿瘤细胞的增加。（A）上的边缘的区域切片在1天（上）和第7天（下）其中细胞可米从膜到脑切片igrate。（B）的可能的细胞迁移的第二个例子到大脑切片的边缘。 1日（上图）和第7天（底部）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5.微球控制珠。第1天（红色）和第7天（绿色）控制荧光微球的图像叠加（黄色），以揭示微球没有运动过了一个星期的文化。第1天和第7天拍摄图像的片段（比例尺= 45微米）范围内的同一位置。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6.在量化ImageJ的。（A）切片的图像将被打开，ImageJ的，整个片和/或区域概述了定量分析。（B）感兴趣的区域选择和重复的图像进行。（C ）背景荧光减去出图像的。（D）中的阈值被设定为细胞大小和形状，确定什么将被计数。（E）的分析颗粒计数感兴趣的区域内的小区数。细胞数量变化倍数就可以通过将细胞在第7天数除以细胞第1天为每个感兴趣的区域或切片的整个区域的数量来计算。 请点击此处查看该图的放大版本。 。
图7.染色进行扩散 。图片体现了怎样染色（固定在PFA切片后）可以成功地在切片上培养一周后进行。图像显示DAPInuclear染色（蓝色），红色荧光标记的小鼠髓母细胞瘤细胞，和绿色标记掺入胸苷类似物的成DNA作为标记的增殖。 EDU被列入切片文化传媒（10μM）一周（白色箭头指示细胞阳性EDU和黄色箭头指示细胞阴性EDU）（比例尺= 50微米）。 请点击此处查看本一个更大的版本数字。
图8.鼠标Medulloblas瘤细胞治疗LDE225。该图演示了肿瘤细胞中的片覆盖测定系统的药物治疗。从小鼠髓母细胞瘤的实验收集的数据（A）的图形表示。 DMSO为对照条件（CTL）和LDE225（Sonidegib）（1μM）（LDE）是处理条件。在培养折片上增加细胞数目超过一周，进行了量化（细胞数第7天/细胞数在第1天），（12例的CTL中，n = 13 LDE，误差棒= SEM）。（B）的代表第1天（上）和第7天（底部）车辆控制处理的切片的图像。（C）的 LDE的代表性图像处理第1天（上）和第7天（底）片。图片拍摄于放大4倍。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图9.人类髓母细胞瘤细 胞在脑肿瘤/器官切片共培养 。人类髓母细胞瘤细 胞从詹姆斯·M·奥尔森在获得华盛顿大学，和生长在切片培养试验一个星期。（A）日1图像 生长在小鼠脑切片上的人类髓母细胞瘤细 胞。（B）中相同的鼠脑切片与人类髓母细胞瘤细 胞在培养一周（7天）后的图像。图片拍摄于放大4倍。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这个协议描述如何脑瘤细胞可荧光标记并接种在P6小鼠的矢状脑切片，然后在培养监视一周。这种脑肿瘤/器官切片共培养测定可用于确定区域微环境对肿瘤细胞数量的影响，并且也可以用作用于测量对人肿瘤生长的新的药物治疗的功效的系统。以前的研究已经使用了类似的策略，以评估脑微环境的神经前体细胞增殖7,8的作用。
该测定中，其中脑肿瘤细胞接种在一个器官切片培养9提供用于生长人脑肿瘤细胞，是很难在正常细胞培养条件来传播的系统。这个过程的一个重要方面是保持片和肿瘤细胞的健康的重要性。的时间长度，该切片对d期间坐在缓冲issection并在室温成像期间应限制，以确保片和细胞保持尽可能健康。如果原代人脑肿瘤细胞在该试验中所使用，将细胞应在切片尽快活检后镀。因此，切片术前应做好准备。为了防止成像时间片之间的任何差的效果，所需的时间量花出去培养箱的应该是短期和一致的用于在实验中的所有切片培养。微球的控制是重要的，因为随着时间的推移提供空间一致的标志。另外，由于收缩，撕裂，或折叠失真在切片培养是通过成像微球珠显而易见。
一个此协议的一个限制是，该细胞只能在这个切片培养系统被传播大约一个星期。尽管如此，对某些类型的脑肿瘤，这是一个显著改进目前状态Ò˚F事务。第二个限制是，血 - 脑屏障被消除，这是评价药物可用于治疗脑肿瘤的重要考虑因素。第三个需要考虑的是，这是一个不能被用于测试化合物的文库的低通量检测方法。
该测定是通用的，容易修改来研究不同类型的肿瘤细胞和多种侦查的问题。这个协议可以用作定量测定检查的新疗法对肿瘤细胞的存活和生长的影响（Sun等人，个人通讯）。的倍数变化在肿瘤细胞数目在脑的不同区域的比较提供用于解密对肿瘤生长的微环境的影响的方法。
这种脑肿瘤/器官切片共培养系统还提供调查脑肿瘤细胞和特定脑微环境之间的关系的可能性。嘛ny的类型的脑肿瘤的发展中显示出在特定脑区和微环境3,4的独特图案。通过在矢状小鼠脑切片生长标记的人肿瘤细胞，细胞可为区域优惠，其可以是与生长的体内区域一致来监测。该肿瘤细胞偏爱可能导致支持肿瘤细胞生长的潜在因素的识别微环境的进一步检查。该测定可有助于在体外细胞培养条件改善，还可能提供一个系统来研究如何肿瘤启动，可以防止或更有效的治疗。
有特定类型的脑肿瘤，不能在正常细胞培养条件或通过鼠标原位或皮下异种移植物被传播。对于这些肿瘤类型是困难的测试对人肿瘤细胞的新的药物治疗方法。这个协议证明人脑肿瘤细胞能够在该切片中生长培养测定和药物治疗可以定量地评估。下列药物治疗，共染色的肿瘤细胞可以提供的对肿瘤细胞增殖和途径抑制药物的作用进一步评估。最近的研究表明，有可能是对癌细胞具有药物作用在正常单层细胞培养与一个三维异质细胞培养环境10之间的急剧差异。类似成人正常和肿瘤的上皮细胞，其具有短的寿命在体外 ，已经显示出有条件地重新编程到一增殖状态结合Rho激酶抑制剂11上的成纤维细胞饲养细胞上生长时。这些研究进一步支持维持肿瘤细胞在器官，3D，临床相关的微环境，而这种细胞培养体系对当前癌症研究的相关性的重要性。因此，这是一个有价值的测定法，用于测试药物对人肿瘤细胞的临床relevan牛逼的方式。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Invitrogen | 17504044 | |
| Glucose | Invitrogen | 17502048 | |
| Pennicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Neurobasal-A- Medium minus phenol red | Invitrogen | 12349015 | |
| Low Melting Point Agarose | Promega | V2111 | |
| Slice Culture Inserts | Milipore | PICM0RG50 | |
| laminin | Invitrogen | 23017015 | |
| Cm-DiI | Invitrogen | V22888 | |
| EDU (Labeling and Detection) | Life Technologies | c10337 | |
| Microspheres | Life Technologies | F-21010 | |
| Vibratome | Leica | ||
| Confocal Microscope | Nikon Eclipse Ni C2si | ||
| ImageJ software | |||
| 5 mm Cover Glasses | Fisher Scientific | 64-0700 (CS-5R) |
References
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