En hjernetumor / Organotypiske Slice Co-kultur System til at studere tumormikromiljøet og Målrettet Drug Terapier

Introduction

Nyere kræftforskning har gjort betydelige fremskridt med at identificere genetiske mutationer, molekylære forandringer og mulige behandlinger for en række af hjernetumorer. Trods disse fremskridt er fortsat hjernetumorer en af ​​de øverste årsager til kræft-relaterede dødsfald for voksne og børn. Begrænsende faktorer i hjernesvulst forskning omfatter den begrænsede tilgængelighed af primære patientprøver og cellelinjer og vanskeligheden ved at kopiere den unikke og heterogene hjerne mikromiljø i tilgængelige eksperimentelle systemer. For mange hjernetumorer de betingelser, der kræves for at opretholde tumorceller over tid er endnu ikke kendt. Selv for hjernetumorer, der kan dyrkes i cellesuspension som neurosfærer, kan dyrkningsbetingelser påvirke tumorcellerne ^1,2. Faktisk tilsætningen af basisk fibroblastvækstfaktor eller epidermal vækstfaktor fremmer proliferation og differentiering inhibere kan ændre genekspression ^1. Andre fremgangsmåder til økonomisk vækst, f.eks tumorcelletumor opformering i mus via ortotopisk eller subkutan xenograft af tumorceller er værdifulde assays, men er begrænset af faktorer såsom tidspunktet for tumorudvikling (især for lav kvalitet tumorer), omkostninger og antallet af tumorceller, som kan injiceres og undersøges . Således nuværende metoder til dyrkning menneskelige hjerne tumorceller er utilstrækkelige til at opretholde visse tumortyper, og giver ofte kunstige miljøer, der ikke nøje efterligner in vivo tumor miljøer.

Forskellige former for pædiatriske hjernetumorer vokse i højt specialiserede steder i hjernen ^{[3, 4],} og dette afspejler sandsynligvis distinkte microenvironmental krav til tumorvækst ^[5]. Denne protokol beskriver et hidtil ukendt system, hvor celler, der er vanskelige at udbrede sig i normale dyrkningsbetingelser kan dyrkes i organotypisk hjernen mikromiljø, som efterligner in vivo tumor vækstbetingelser. I denne kvantitativ analyse, fluorescens-mærkethjernetumorceller udplades på unge musehjerne organotypiske skiver og overvåges over tid. Dette assay kan anvendes til at undersøge effekten af ​​mikromiljø på tumorvækst, og til at teste nye lægemiddelterapier i en klinisk relevant hjerne mikromiljø.

Protocol

Etik Statement: Følgende procedure involverer dyr forsøgspersoner blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health retningslinjer og blev godkendt af Dana-Farber Cancer Institutional Animal Care og brug Udvalg. Alt mennesker arbejde blev gennemgået af Institutional Review Board udvalg i Brigham og kvinders Hospital og Dana-Farber Cancer Institute, og ved Stanford University for hensigtsmæssig anvendelse, der informerede samtykke blev opnået fra alle fag, når det kræves, og passende afkald på krav til samtykke blev opnået for risikogrupper undersøgelser minimal.

Tidslinje for Slice Kultur Protokol:

Figur 1. Tidslinje for Brain Tumor / Organotypiske Slice Co-kultur-protokollen. Denne figur viser tidslinjen af ​​proceduren skive kultur omfatter alle otte dage of eksperimentet og store skridt i proceduren. Tidslinjen er i forhold til dag 0, når cellerne udplades på udsnittet for at understrege, hvor vigtigt det begynder procedureblindprøverne dage før plating celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

1. Dissektion Buffer

1. Forbered 15 mM HEPES (1 M), 6,5 mg / ml glucose, 1,3 mM MgSO4 (1 M), 20 mM KCI (2 M) og 1% penicillin / streptomycin i 1x HBSS.
2. Juster pH til 7,4 med NaOH.
3. Filter og opbevares ved -20 ° C.

2. Slice kultur medier

1. Forbered 2% B-27, 1% N2 Supplement, 1% penicillin / streptomycin, 1% Glutamax og 1,5 mg / ml glucose i Neurobasal-A Medium minus phenolrødt.
2. Filter og opbevares ved -20 ° C. Tø efter behov, og kasseres efter 1 uge ved 4 ° C.
   Bemærk: Følgende procedure kan gøres op til påe dag, før du starter dissektion.
3. 3% agarose med lavt smeltepunkt
   Bemærk: Følgende procedure kan gøres op til en dag før du starter dissektion.
4. Bland 0,9 g agarose med lavt smeltepunkt ind ~ 31 ml dissektion buffer, mikrobølgeovn i 25 sekunder med hætte løs. Mikroovn indtil smeltet og sørg blandingen ikke løbe over.
5. Opbevares ved 55-65 ° C, indtil de skal bruges.
   Bemærk: Følgende procedure kan gøres op til en dag før du starter dissektion.

4. Smør Slice Kultur Indstik med laminin

Bemærk: Følgende procedure kan gøres op til en dag før du starter dissektion.

1. I en vævskultur hætte under anvendelse af steril pincet, placeres en skive kultur insert i hver brønd i en 6-brønds plade (svarer til antal skiver du ønsker at opnå, kan omkring 12 indsamles fra den ene procedure. Følgende procedure er skrevet til seks skiver). Fyld en 15 ml konisk t Ube med 1x PBS (800 ul / indsæt) og tilsæt laminin (10 ug / ml).
2. Tilføj 800 pi af laminin blandingen til toppen af ​​hver skive kultur insert. Der inkuberes ved 37 ° C indtil brug.

5. Forberedelse til Dissection

1. Fyld hver brønd i en plade med 6 brønde med 1.200 pi skive dyrkningsmedier. Fyld ubrugte brønde med 1.200 pi PBS og fylde center plads af pladen med 5 ml 1x PBS. Opbevar denne plade ved 37 ° C.
2. Sterilisere dissektion værktøjer i 70% ethanol. Tør vibratome bladet med acetone for at fjerne olie og steriliseres før brug.
3. Placer tre 35 mm ² retter og fem 10 cm ² vævskulturskåle i hætten. Fyld en 10 cm ² skål med dissektion buffer og sted på is.
   Bemærk: Fremgangsmåde pups én ad gangen.

6. Dissektion

Bemærk: Fremgangsmåde pups én ad gangen.

es / ftp_upload / 53304 / 53304fig2.jpg "/>

Figur 2. Dissektion nedskæringer. Disse billeder viser de nødvendige dissektion udskæringer for at fjerne skallen fra hjernen af ​​en P6 mus. Cuts er vist som stiplede linier. (A) Skær 1 er vist. Cuts 1 og 2 er fremstillet af hjernestammen / posterior bilateralt tilslutning til øjenhulen på hver side .. (B) Cuts 3 og 4 er vist. Skær 3 er fremstillet af et øjenhulen til de øvrige forbinder Cuts 1 og 2. Cut 4 begynder ved midterlinjen af snittet 3 og fortsætter mod spidsen af næsen dividere kraniet mellem olfaktoriske pærer (Scale bar = 4,4 mm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

1. Bedøver P6 mus ved hjælp af isofluran eksponering (100% isofluran). Efter ca 5 min, når vejrtrækningen bliver langsommere, eller der er ingen tegn på respiration, hurtigt halshugge denmus med en skarp saks. Spray hovedet med 70% ethanol og anbringes i en vævskulturskål.
2. Brug af store stumpe pincet holde hovedet stabilt ved at snuppe næsen. Brug af mellemstore dissektion saks, fjerne overskydende hud til at afsløre kraniet.
3. Foretag snit 1 og 2 ved at skære kraniet bilateralt fra posterior af kraniet fremad på hver side, der forbinder snittet til øjenhulen. Hold spidsen af ​​saksen så tæt på kraniet som muligt for at undgå vævsbeskadigelse.
4. For snit 3, bruge små foråret saks til at forbinde snit 1 og 2. Brug derefter de små stumpe pincet til forsigtigt skrælle kraniet.
5. Brug af lille fjeder saks, forsigtigt skære den resterende kraniet langs midterlinien på toppen, således at den resterende kraniet bliver 2 halvdele (figur 2, sender # 4). Brug af pincet skrælle kraniet til at afsløre de to olfaktoriske pærer.
6. Indsæt en flad-faced spatel (fugtet med dissektion buffer, så væv vil ikke holde sig til det) i mellem bottom af hjernen og bunden af ​​kraniet, fjern forsigtigt hjernen og anbringes i skålen, der indeholder dissektion buffer på is.
7. Gentag trin 6 til opnåelse af en anden hjerne til udskæring

7. Indlejring det Brains i Agarose

1. Placer to af de 35 mm ² retter åben på isen og tørre ned et par store stumpe pincet med 70% ethanol.
2. Hæld 3% lavtsmeltende agarose (fremstillet i trin 3) i de to skåle, indtil en kuppel formularer på toppen. Indstil timeren i 3 min. På 3 minutter (test ved at røre ved kanten af ​​agarose-fyldte kuppel, hvis der kan observeres polymerisering af agarose, den er klar) afhente en hjerne med stumpe pincet og sted ind i siden af ​​en agarose-fyldte 35 mm skål, derefter flytte den til midten af ​​skålen (dette fjerner overskydende dissektion buffer omkring hjernen, så det monterer bedre).
3. Gentag for ^2. hjernen. Start en timer til 10 minutter.
4. Efter 10 minutter, indsætte en flad spatel ind i mellemrummet mellemagarose og parabol til pop ud polymeriserede agarose indeholder P6 hjerner.
5. Brug en flad barberblad til at trimme agarose i en kube omkring hjernen, og sørg for, at kanterne er så lige som muligt.
6. Placer superlim på vibratome plade i to strimler. Derefter afhente agarose monteret hjernen og forsigtigt slip den ned over den lim, positioneret til sagittale skiver. Gør det samme med den anden hjerne. Sørg for, at begge hjerner er linet op med hinanden.
7. Lad limen tørre ved stuetemperatur i 5-8 min. I løbet af denne tid, position isen indehaveren område af vibratome med knust is og vand.

8. Udskæring med Vibratome

1. Placer skære reservoiret i isen holder området, flytte tappen til højre for at låse den på plads.
2. Brug den cirkulære hoved skruetrækker, afhente den cirkulære vibratome plade med hjernerne limet på det, og passer det ind i reservoiret. Fjern skruetrækkeren og fastgør pladen på plads med the sekskantet hoved skruetrækker. Sørg for, at pladen og skære reservoiret er på plads.
3. Brug af pincet, pickup vibratome klinge, passer det ind i skærehovedet, låse på plads med sekskantet skruetrækker. Derpå gøres skærehovedet med vedlagte klinge på vibratome hjælp af runde skruen.
4. Åbn position barbermaskine til så tæt på agarose-embedded hjerner som muligt, samtidig med at sørge for, barbermaskine er i samme højde (eller lige over) hjerner. Fyld kammeret med nok koldt dissekere buffer til at dække klingen.
5. Tryk ↕ knappen én gang (bør du se det blinke, denne knap definerer grænserne når bladet vil gå frem og tilbage), tryk og hold "Frem" for manuelt at skære den integrerede hjernen, frigivelse indtil barbermaskine rydder agarose blokken. Trykke Umiddelbart ↕ knappen igen, vil dette definere ende af intervallet for automatisk skæring.
6. Tryk på "SINGLE / CONT" knappen én gang og light af CONT skal gå videre. Sæt skære tykkelse til 400-450 um, vibrerende frekvens til 5,5-6, og hastigheden til 4. Dette vil være trimning indstilling.
7. Tryk på "start / stop" knappen én gang, og automatisk skæring skal begynde. Tryk på "pause" at samle vævet med skeen med huller, som det er nødvendigt. Det bør tage omkring 5-10 min, for at nå tættere på midterlinjen. På dette tidspunkt, skal du trykke på "pause", og ændre hastigheden til 3 og ændre tykkelse til 200 um. Du må ikke indsamle de første skive er produceret efter at have foretaget denne ændring.
8. De ønskede udsnit af 200 um tykkelse vil have lugtekolben gennem lillehjernen pænt defineret. Overfør hver ønsket skive, som de er skåret i 6-brønds plader fyldt med dissektion buffer på is. Gør dette ved at flytte buffer i udskæring kammer omkring vævet til at flyde den skive, røre ved det så lidt som muligt, løft den ud af bufferen, når det er helt og holdent over hulske. Typisk omkring 12 skiver med de ønskede strukturer kan opsamles. Skiverne kan efterlades i dissekere puffer på is i op til 20 min.
9. Mens udsnit er på is, tegne plade med 6 brønde med indsatser er belagt med laminin fra 37 ° C inkubator. I dissektion hætte kassere laminin pas på ikke at beskadige skær. Tilføj 3,5 ml skive dyrkningsmedier til toppen af ​​hver indsats. Toppen af ​​medierne vil danne en kuppel-form uden at løbe ud i brøndene.

9. Plating den Udsnit onto Indstik

1. Brug af hulske værktøj, placere en hjerne skive ind medierne på indsatsen, forsigtigt at skubbe skive at være fuldt neddykket. Gentag for alle skiver.
2. Brug en P1000 at trække 1 ml skive dyrkningsmedier fra toppen af ​​indsatsen og dispensere det i bunden af ​​brønden. Fjern og kassér overskydende medier, indtil kanterne af agarose omkring hjernen slicebecome synlige. Gør dette for de resterende skiver.
3. Pick up tHan indsætter ved randen med pincet, tilt og fjerne overskydende medier. Derefter hurtigt overføre indsatsen ind 35 ^mm2 skål indeholdende 1 ml skive dyrkningsmedier. Brug 2 par skarpe pincet til at fjerne agarose omkring vævet, pas på ikke at strække / skader skive eller stikke et hul i membranen (nemmest hvis du laver en tåre i selve kanten af ​​agarose, og træk fra hinanden agarose fra hver side). Derefter flytte indsatsen tilbage til 6-brønds plade og gentag for de resterende skiver.
4. I en vævskultur hætte med blæseren (for at forhindre skiverne i at udtørre) fjerne agarose-fragmenter fra hver membran.
5. Overfør skiverne til 6-brønds plade fremstillet i trin 5.1 og opbevare pladen ved 37 ° C. Inkuber skiver for 24-48 timer.

10. Ændring af Slice Kultur Medier

1. Gentag trin 5.1 med en frisk plade med 6 brønde.
2. I en vævskultur hætte med blæseren, overføre indsatserne til nye plader med 6 brønde containing frisk skive medier.

11. Plating tumorceller på Slice

1. Sonikeres Cm-Dii farvestof og spin på medium hastighed i 2 min.
2. Spin ned tumorceller bliver brugt til overlay på 201 xg i 5 min. Derefter resuspenderes i 2 ml skive dyrkningsmedier.
3. Tilføj 7 pi CM-Dil i 2 ml celler og medier og inkuberes ved 37 ° C i 20 minutter.
4. Spin ned celler ved 201 xg i 5 min og resuspender i 200 pi udskæring medier. Triturat forsigtigt at adskille cellerne (10-20 gange, eller indtil pellet er væk) og derefter tilføje 800 ul udskæring medier til at gøre 1000 pi samlede volumen.
5. Tæl levedygtige tumorceller under anvendelse af Trypan blå. Tilføj grønt fluorescerende mikrosfærer til tumorceller, ved den samme koncentration som celler. Disse inaktive mikrosfærer vil tjene som en kontrol. Spin ned celle / mikrosfære blandingen ved 201 xg i 5 minutter og resuspender i den ønskede mængde skive dyrkningsmedier. Plate celler ved en densitet på 6.000 celler / slis i 65 pi volumen. Antallet af celler udpladet pr skive kan øges afhængigt af præference og tilgængelighed.
6. I vævskultur hætte dispensere celler i 65 pi media / skive på midten af ​​udsnittet.

12. Billedbehandling og Fixing

Bemærk: et Nikon Eclipse Ni C2si opretstående konfokal blev brugt til at tage et stort billede scanning af hele sagittale skive på 4X med røde og grønne fluorescerende kanaler. Hvis scanning funktion er ikke tilgængelig, tage flere billeder i rækkefølge på tværs af skive og senere sy billederne sammen i Photoshop (ved hjælp af placeringen af ​​mikrokugler og kanten af ​​skiven til at navigere).

1. Den næste dag (dag 1 billeddannelse), overføre skiver i seks 35 mm ² retter med 1 ml skive kulturmedier. Billede hver skive en ad gangen på fluorescerende opretstående mikroskop. Tag et stort billede scanning af hele sagittale skive på 4X med røde og grønne fluorescerende kanaler. Hold laserog forstærkningsindstillinger det samme for hver skive. Ved udgangen af ​​billedbehandling, overføre alle skiver tilbage til en 6-brønds plade indeholdende frisk skive medier.
2. Hvis der ønskes tilsætning af EDU andre proliferationsmarkør eller lægemiddel tilstand, skaber et lager af skive medier med lægemidlet, der skal anvendes til de medieændringer dagligt til behandling tilstand. Behandlingen betingelse bør indføres ved trin 12,1 (direkte efter dag 1 billeddannelse). Enhver EDU eller proliferationsmarkør bør tilføjes til medierne også begynder ved 12,1 og opdateres dagligt (brug EDU ved 10 uM).
3. Billede igen på Dag 7 ved hjælp af de samme indstillinger som den Dag 1 billeder.
4. Efter dag 7 billeddannelse er færdig, flytter hver skive i en 6-brønds plade med hver brønd indeholdende 1,2 ml 4% paraformaldehyd (PFA). Forsigtigt og langsomt falde yderligere 1 ml PFA oven på hver skive. Efterlad ved stuetemperatur i 1 time.
5. Fjern PFA fra hver brønd, og fra toppen af ​​hver skive. Vask hver brønd 3 x med PBS. Opbevar skiver i PBS ved4 ° C til farvning eller montering på dias.
   Kan være nødvendigt at blive justeret og optimeret ImageJ indstillinger til at redegøre for image og mikroskop kvalitet samt tumor celle størrelse: note.

13. Kvantificering af billeder (Brug ImageJ)

Kan være nødvendigt at blive justeret og optimeret ImageJ indstillinger til at redegøre for image og mikroskop kvalitet samt tumor celle størrelse: note.

1. I ImageJ bruge polygon værktøj til at skitsere hele skive eller det område, du ønsker at sætte tal på. Føj dette valg til ROI leder, hvor du kan omdøbe den og gemme den.
2. Højreklik på det valgte område, og vælg duplikere. Navngiv denne kopi af billedet med regionen, skive, dag. Tryk CTL + Shift + E for at vise omridset, og vælg derefter Proces - trække baggrund - Rullende kugle Radius = 4.
3. Efter baggrundssubtraktion, skal du vælge "justere tærskel" i "Image" dropdown-menuen. Check mørk baggrund -; se på billedet zoomet ind og sætte tærsklen. Som du sætter grænsen ved at flytte grænsen bar, sikre, at alle celler er inkluderet / fremhævet men yderst små prikker, der er snavs (eller mindre end en celle) er ikke medtaget. Brug samme tærskel for alle billeder. Flyt tærsklen vinduet til siden.
4. Vælg "Proces" - "Find Maxima", og indstil støj tolerance mellem 5 og 10, og kontrollere følgende: Eksempel punkt valg, output type som segmenterede partikler, udelukke kant maksima, over lavere tærskel. Så genvælge området af interesse ved at trykke CTL + Shift + E.
5. Vælg "Analyser Partikler" fra analyse-drop down menuen. Indstil pixelstørrelsen til 4-40 og cirkularitet til 0,00-1,00. Klik Også "Vis overlay skitserer" "display resultater" og "sammenfatte", tryk derefter på OK.
6. Registrere alle rådata og resuméet i et Microsoft Office-dokument. Den "Count" for hver region is behov for at beregne fold ændring i forhold til ugen i kultur.
7. Gentag denne proces for alle billeder og områder af interesse, og sørg for, at tærsklen og andre indstillinger være konsekvent.
8. Beregn fold ændring i celleantal på udsnittet i ugen i kultur ved at dividere antallet af tumorceller på skive på dag 7 med antallet af celler på udsnittet på dag 1. Tilsvarende fold ændring i celleantal i hver region beregnes ved at dividere antallet af celler i denne region på dag 7 med antallet af celler i denne region på dag 1.
9. Udfør trin 13,8 for mikrosfærer samt. Mikrosfæren nummer på udsnittet bør være den samme på dag 7 som på dag 1 (Fold ændring = 1). Tilsvarende bør mikrosfære nummer indenfor hver region være den samme på dag 7 som på dag 1 (Fold ændring = 1). Hvis Fold ændring afviger fra 1, angiver, at det ændringer i skive topografi over tid.

14. Farvning

1. Tape et stykke parafilm på the laboratoriearbejdet og tegne seks cirkler med en flydende blocker pap pen (en for hver skive, bare større end størrelsen af ​​et udsnit). Sted omkring 400 pi PBS i en prik i midten af ​​hver cirkel. Nummer eller mærke de cirkler for at identificere hver skive.
2. I 1 ml PBS, skal du bruge et barberblad til at skære en firkant omkring skive, efterlader noget plads af membran omkring skive. Ved hjælp af pincet flytte skåret ud udsnit i den første cirkel og omhyggeligt lægge skive på toppen af ​​boblen PBS. Det er vigtigt at sørge for, at skiven ikke fold over på sig selv eller få vendt på hovedet i løbet af denne proces. Fjern derefter PBS fra undersiden af ​​skive og sætte det på toppen af ​​skive og tilføje flere PBS hvis det er nødvendigt for at sikre det forbliver neddykket. Gentag dette trin for hver skive.
3. Lav 10 ml 3% BSA i PBS. Tag 2 ml, og der tilsættes 100 ul digitonin til det. Bland og tilføje til skiver til at blokere og permeabilisere, 30 minutter ved stuetemperatur.
   Bemærk: Anvendelse af andre permeabilisering såsom Triton X-100 vil resultere i tab af CM-Dil mærkning.
4. Fjern permeabilisering / blokerende opløsning og skylles 3 gange med PBS i 10 min.
5. Hvis farvning for EDU, skal du følge de anvisninger, som sættet til at samle blandingen. Anvende blandingen i 45 minutter. Hvis farvning med andre antistoffer, skal protokollen være optimeret til koncentrationen af ​​primære og sekundære antistoffer (~ 1 time RT i primær og sekundær). Skyl 3 x med PBS i 10 min.
6. Pletten med DAPI 1: 1.000 i PBS i 5 min RT. Skyl 2 gange med PBS.

15. Montering af Udsnit

1. Overfør udsnittet til et mikroskopobjektglas. Sørg for, at side af membranen med skive forbliver opad, og ikke folde over på sig selv. Tegn en kant rundt om skive med en flydende blokker pap pen.
2. Placere en lille dækglas (5 mm) på hver side af udsnittet (for at holde udsnittet fra at blive beskadiget). Drop to eller tre dråber Fluoromount-G (for immunfluorescens) oven påskive til lige netop dække det. Så dækker skive lange dækglas (24 x 50 mm).
3. Gentag for hver skive. Forsegle kanterne af dias med neglelak og opbevares ved 4 ° C. Gør konfokal billeddannelse af farvning.

Representative Results

Dette afsnit eksemplificerer type resultater forventes fra anvendelse af hjernetumor / organotypisk skive co-kultur at undersøge regionale mikromiljø præference samt at afprøve nye behandlingsformer. Vi viser, at assayet er designet til at kopiere mikromiljøet for hjernetumorer, som vævet organisation og proliferativ tilstand udsnittet opretholdes (figur 3). Vi demonstrerer også, at en stigning i antallet af tumorceller på skive over tiden delvist kan skyldes migreringen af celler på hjernen skive mikromiljø (figur 4). Vi har også vist, at denne co-kultur kan anvendes som en kvantitativ analyse ved at beregne fold ændring i celleantal over uge i kultur i specifikke områder af udsnittet eller til hele hjernen skive (figur 6) Foreløbige resultater fra flere tumor celletyper har vist, at antallet af tumorceller kan kvantificeres ved konfokal billeddannelse af200 um tyk udsnit skyldes, at cellerne kun migrere til en dybde på 20-50 um i udsnit.

Vi har fundet, at grønt fluorescerende mikrosfærer er en effektiv kontrol for ændringer i udsnit topografi, fordi de viser ingen bevægelse eller ændring i antal hele tiden i kultur (figur 5). Efter fastsættelse af co-kultur, kan farvning gøres for at undersøge tumorceller i en hjerne mikromiljø og virkningerne af lægemidler på tumorcelleproliferation, celledød, eller ændringer i proteinekspression (figur 7). Vi har vist, at dette assay kan anvendes til at teste lægemiddelbehandlinger gennem en sammenligning af muse medulloblastom celler behandlet med en Smo (Smoothened) antagonist LDE225 (Sonidegib) eller med en vehikelkontrol. Fold stigning i celle nummer på skive over en uge i kultur blev kvantificeret og gengives grafisk (celletal på dag 7 / celle nummer på dag 1) Disse data viser, at LDE225 stærkt defolder tumor celleantal sammenlignet med kontrolgruppen ^6. Denne virkning kan også ses i de repræsentative billeder indgår (figur 8). Vi viser også billeder af humane medulloblastom celler dyrket i kultur skive assay (figur 9).

Figur 3. Brain Tumor / organotypisk Slice samdyrkning assayudformning. (A) organotypisk sagittale udsnit hjernen fra en P6 mus anbringes direkte på en semi-porøs membran og mellemstore tilsættes til bunden af dyrkningsskålen. Kulturen er nedsænket i mediet på den ene side og er tilgængelig for oxygen fra den anden side. Mærkede tumorceller overlejres på skive og celletallet kan følges over tid. (B) i kultur, udsnittet opretholder et væv organisation, der ligner den iagttaget in vivo. Preservation af hjernen mikromiljø demonstreres ved edu mærkning af proliferative granulat neuron prækursorer i den eksterne granulat lag (EGL) af lillehjernen i udsnit kultur. I skive kultur, disse præcursorceller indarbejde thymidin analog edu, som ville blive observeret in vivo på dette udviklingstrin (P6) (hvid pil viser EGL). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Humant astrocytomceller i Brain Tumor / Organotypiske Slice Co-kultur-analysen. En stigning i menneskelige hjerne tumorceller på skive kan afspejle relocalization af tumorceller fra membranen til skive kultur. (A) Et område på kanten af en skive ved dag 1 (øverst) og Dag 7 (nederst), hvor celler kan m igrate fra membranen på hjernen skive. (B) Et andet eksempel af eventuel migration celle på hjernen på kanten af skiven. Dag 1 (øverst) og Dag 7 (nederst). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. Mikrosfærepellets Kontrol perler. Dag 1 (rød) og Dag 7 (grøn) kontrol billeder af fluorescerende mikrokugler overlejret (gul) til at afsløre nogen bevægelse af mikrosfærerne over en uge i kultur. Dag 1 og Dag 7 billeder blev taget på samme position i skive (Scale bar = 45 um). Klik her for at se en større version af dette tal.

lways ">
Figur 6. Kvantificering i ImageJ. (A) Billedet af en skive åbnes i ImageJ og hele skive og / eller regioner er skitseret til kvantificering. (B) Regionen af interesse er valgt, og en kopi af billedet er lavet. (C ) Baggrunden fluorescens trækkes ud af billedet. (D) Tærsklen er sat for celle størrelse og form, at bestemme, hvad der vil blive talt. (E) Analyser partikler til at tælle celle nummer i regionen af interesse. Fold ændring i celle nummer kan derefter beregnes ved at dividere antallet af celler på dag 7 med antallet af celler på dag 1 for hver region af interesse, eller hele området af den pågældende del. Klik her for at se en større version af dette tal .

Figur 7. Farvning for spredning. Billede eksemplificerer hvordan farvning (efter fastsættelse af skive i PFA) kan med held gøres på skive efter en uge i kultur. Billedet viser DAPInuclear farvning (blå), rød fluorescens-mærkede mus medulloblastom celler, og grøn mærkning af inkorporering af thymidin-analog i DNA som en markør for spredning. EDU blev inkluderet i skive dyrkningsmedier (10 uM) i en uge (hvide pile indikerer celler er positive for EDU og gule pile viser celler er negative for EDU) (Skala bar = 50 um). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 8. Mus Medulloblas Toma celler behandlet med LDE225. Dette tal viser narkotika behandling af tumorceller i skive overlay analysesystem. (A) Grafisk fremstilling af data indsamlet fra en mus medulloblastom eksperiment. DMSO var kontrollen betingelse (CTL) og LDE225 (Sonidegib) (1 uM) (LDE) blev behandling tilstand. Fold stigning i celletal på skive over en uge i kultur blev kvantificeret (celletal på dag 7 / celletal på dag 1), (n = 12 CTL, n = 13 LDE, Fejlsøjler = SEM). (B) repræsentant billeder af vehikelkontrol behandlede skiver på dag 1 (øverst) og Dag 7 (nederst). (C) Repræsentative billeder af LDE behandlede skiver på dag 1 (øverst) og Dag 7 (nederst). Billeder blev taget på 4X forstørrelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

9 "src =" / files / ftp_upload / 53304 / 53304fig9.jpg "/>
Figur 9. Menneskelig medulloblastom Celler i Brain Tumor / Organotypiske Slice Co-kultur. Humane medulloblastom celler blev opnået fra James M. Olson på University of Washington, og blev dyrket i en uge i udsnittet kultur assay. (A) Dag 1 billede af humane medulloblastom celler dyrket på musehjernen udsnit. (B) et billede af den samme musehjerne skive med humane celler medulloblastom efter en uge i kultur (dag 7). Billeder blev taget på 4X forstørrelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Denne protokol beskriver, hvordan hjernetumorceller kan fluorescensmærket og udpladet på en sagittal hjerne sektion af en P6 mus og overvåges så for en uge i kultur. Denne hjernetumor / organotypisk skive co-kultur-assay kan anvendes til at bestemme virkningen af ​​regionale mikromiljø på tumorcellen nummer og kan også anvendes som et system til måling af effektiviteten af ​​nye lægemiddelbehandlinger på menneskers tumorvækst. Tidligere undersøgelser har brugt en lignende strategi til at vurdere den rolle, som hjernen mikro-miljø på neurale spredning forløber ^7,8.

Dette assay, hvor hjernetumorceller podes i en organotypisk kultur skive ⁹ tilvejebringer et system til dyrkning af humane hjernetumorceller der er vanskelige at udbrede sig i normal celle dyrkningsbetingelser. Et kritisk aspekt af denne procedure er vigtigheden af ​​at opretholde sundheden af ​​skive og tumorcellerne. Længden af ​​tid, skiverne sidder i buffer under dissection og ved RT under billedbehandling bør begrænses, for at sikre, at de skiver og celler forbliver så sundt som muligt. Hvis primære humane hjernetumorceller bliver brugt i dette assay bør cellerne udpladet på skiverne så hurtigt som muligt efter biopsi. Derfor skiverne skal være forberedt før operation. For at undgå differentierede virkning af afbildningstiden blandt skiver, mængden af ​​tid brugt ud af inkubatoren skal være kort og konsistente for alle skivekulturer i et eksperiment. Mikrosfæresammensætningerne kontroller er vigtige, da de giver rumligt konsistente mærker over tid. Desuden forvridninger i skive kultur på grund af svind, tåreflåd, eller folde er let synlige ved billeddannelse af mikrokugleblærer.

En af begrænsningerne ved denne protokol er, at cellerne kun kan opformeres i dette udsnit kultursystem i ca. en uge. Ikke desto mindre, for nogle typer af hjernetumorer dette er en væsentlig forbedring i forhold til nuværende tilstand of anliggender. En anden begrænsning er, at blod-hjerne-barrieren er elimineret, hvilket er en vigtig overvejelse ved vurdering lægemidler, der kan anvendes til behandling af hjernetumorer. En tredje overvejelse er, at det er en lille produktion assay, der ikke kan bruges til afprøvning af et bibliotek af forbindelser.

Dette assay er alsidig og let modificeres til at studere forskellige typer af tumorceller og en række af undersøgelsesmetoder spørgsmål. Denne protokol kan anvendes som en kvantitativ analyse for at undersøge virkningerne af nye terapier for tumor celle overlevelse og vækst (Sun et al., Personlig kommunikation). En sammenligning af folden ændring i tumor celleantal i forskellige regioner af hjernen tilvejebringer en fremgangsmåde til at dechifrere virkningerne af mikromiljø på tumorvækst.

Denne hjernetumor / organotypisk skive co-kultur Systemet giver også mulighed for at undersøge forholdet mellem hjernen tumorceller og specifikke hjerneregioner mikromiljøer. MaNY typer af hjernesvulster viser en tydelig mønster for at udvikle i bestemte områder af hjernen og mikromiljøer ^3,4. Ved at dyrke mærkede humane tumorceller på en sagittal musehjerne skive kan celler monitoreres for regional præference, som kan være i overensstemmelse med in vivo vækstregion. Yderligere undersøgelse af mikromiljø, at tumorcellerne foretrækker kunne føre til identifikation af potentielle faktorer, der understøtter tumorcellevækst. Denne analyse kan hjælpe med at forbedre in vitro celle dyrkningsbetingelser og kan også give et system til at undersøge, hvordan tumor initiering kan forebygges eller mere effektivt behandlet.

Der er særlige typer af hjernetumorer, der ikke kan opformeres i normal celle dyrkningsbetingelser eller ved muse ortotopisk eller subkutane xenotransplantater. For disse tumortyper er det svært at teste nye behandlingsformer narkotika på humane tumorceller. Denne protokol viser, at menneskelige hjerne tumorceller kan dyrkes i skivekultur assay og medicinsk behandling kan vurderes kvantitativt. Efter lægemiddelbehandling, co-farvning af tumorcellerne kan give yderligere vurdering af lægemidlets virkning på tumorcelleproliferation og pathway inhibering. Nylige undersøgelser har vist, at der kan være en drastisk forskel mellem en medicin virkning på cancerceller i en normal monolag cellekultur vs. et 3D heterogen celledyrkningsmiljøet ^10. Ligeledes voksne normale og tumor epitelceller, som har en kort levetid in vitro, er blevet vist at betinget omprogrammere til en proliferativ tilstand, når dyrkes på fibroblast fødeceller i kombination med en Rho-kinase inhibitor ^11. Disse undersøgelser støtter vigtigheden af ​​at opretholde tumorceller i en organotypisk, 3D, klinisk relevant mikromiljø, og relevansen af ​​dette cellekultursystem til aktuel kræftforskning. Derfor er dette en værdifuld assay til at teste lægemidler på humane tumorceller i en klinisk relevant måde.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Invitrogen	17504044
Glucose	Invitrogen	17502048
Pennicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
HBSS	Life Technologies	14185-052
B-27	Life Technologies	17504-044
N2	Life Technologies	17502-048
Glutamax	Life Technologies	35050061
Neurobasal-A- Medium minus phenol red	Invitrogen	12349015
Low Melting Point Agarose	Promega	V2111
Slice Culture Inserts	Milipore	PICM0RG50
laminin	Invitrogen	23017015
Cm-DiI	Invitrogen	V22888
EDU (Labeling and Detection)	Life Technologies	c10337
Microspheres	Life Technologies	F-21010
Vibratome	Leica
Confocal Microscope	Nikon Eclipse Ni C2si
ImageJ software
5 mm Cover Glasses	Fisher Scientific	64-0700 (CS-5R)