Ein Hirntumor / Organotypischen Co-Kultursystem für die Untersuchung Tumor-Microenvironment und gezielte Arzneimitteltherapie

Introduction

Jüngsten Krebsforschung hat bedeutende Fortschritte bei der Identifizierung von genetischen Mutationen, molekulare Veränderungen und mögliche Behandlungen für eine Vielzahl von Hirntumoren hergestellt. Trotz dieser Fortschritte Hirntumoren bleibt eine der Top-Ursachen von Krebs-Mortalität für Erwachsene und Kinder. Begrenzenden Faktoren in Hirntumorforschung gehören die eingeschränkte Verfügbarkeit der primären Patientenproben und Zelllinien und die Schwierigkeiten bei der Replikation der einzigartigen und heterogenen Hirnmikroumgebung in zugänglichen experimentellen Systemen. Seit vielen Hirntumoren die erforderlich sind, um Tumorzellen zu halten über die Zeit noch nicht bekannten Bedingungen. Selbst bei Hirntumoren, die in Zellsuspension als Neurosphären angebaut werden kann, kann Kulturbedingungen die Tumorzellen ^1,2 beeinflussen. Tatsächlich ist die Zugabe von basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor oder epidermaler Wachstumsfaktor, um die Proliferation zu fördern und die Differenzierung inhibieren kann Genexpression ¹ verändern. Andere Verfahren zum Wachstum von Tumorzellen wie beispielsals Tumorausbreitung in Mäusen über orthotope oder subkutane Xenotransplantat-Tumorzellen sind wertvolle Assays, werden aber von Faktoren wie Zeit der Entwicklung von Tumoren (insbesondere für Grade Tumoren niedrig), der Kosten und der Anzahl der Tumorzellen, injiziert und untersucht werden können, begrenzt . So aktuellen Methoden zur Züchtung menschlicher Gehirntumorzellen sind für die Aufrechterhaltung bestimmter Tumorarten unzureichend und oft künstliche Umgebungen, die nicht mimisch in vivo Tumor Umgebungen zu tun eng.

Verschiedene Arten von pädiatrischen Hirntumoren wachsen in hoch spezialisierten Stellen innerhalb des Gehirns ^{[3, 4],} und dies ist wahrscheinlich unterschiedliche Mikroumgebungsanforderungen für das Tumorwachstum zu reflektieren ^[5]. Dieses Protokoll beschreibt ein neuartiges System, in dem Zellen, die nur schwer unter normalen Kulturbedingungen ausbreiten, kann in einer organotypischen Hirnmikroumgebung gezüchtet werden, die imitiert Tumorwachstum in vivo Bedingungen. In diesem quantitative Assay fluoreszierend markiertenHirntumorzellen sind auf jugendliche Gehirn der Maus organotypischen Schnitten plattiert und über die Zeit verfolgt. Dieser Assay kann verwendet werden, um die Wirkung der Mikroumgebung auf das Tumorwachstum zu untersuchen, und um neue Arzneimitteltherapien in einem klinisch relevanten Hirnmikroumgebung zu testen.

Protocol

Ethics Statement: Das folgende Verfahren mit tierischen Probanden wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health-Richtlinien durchgeführt und wurden von der Dana-Farber Cancer Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. Alle Versuchspersonen Arbeit wurde von der Institutional Review Board Ausschüsse des Brigham and Women s Hospital und Dana-Farber Cancer Institute und der Stanford University für die angemessene Verwendung, die Einwilligung informiert wurde von allen Probanden erhalten, wenn erforderlich und angemessen Verzicht auf Zustimmung Anforderungen überprüft wurde für minimales Risiko Studien erhalten.

Zeitachse der Scheibe Kultur-Protokoll:

Abbildung 1. Zeitleiste der Brain Tumor / Organotypischen Co-Kultur-Protokoll. Diese Figur zeigt die Zeitleiste des Schnittkultur Verfahren umfasst alle acht o Tagenf Experiments und wichtigsten Schritte des Verfahrens. Die Timeline ist in Bezug auf Tag 0, wenn die Zellen auf die Scheibe, um die Bedeutung von Beginn des Verfahrens Tage vor Plattierzellen markieren plattiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

1. Dissection Buffer

1. Vorbereitung 15 mM HEPES (1 M), 6,5 mg / ml Glucose, 1,3 mM MgSO 4 (1 M), 20 mM KCl (2 M) und 1% Penicillin / Streptomycin in 1x HBSS.
2. PH-Wert auf 7,4 mit NaOH.
3. Filter und bei -20 ° C.

2. Scheibe Kultur Medien

1. Vorzubereiten 2% B-27, 1% N 2 Supplement, 1% Penicillin / Streptomycin, 1% Glutamax und 1,5 mg / ml Glukose in Neurobasal-A-Medium ohne Phenolrot.
2. Filter und bei -20 ° C. Tauen nach Bedarf, und entsorgen Sie nach 1 Woche bei 4 ° C.
   Hinweis: Das folgende Verfahren kann bis zu auf durchgeführt werdene Tag vor dem Beginn der Dissektion.
3. 3% niedrigschmelzender Agarose
   Hinweis: Das folgende Verfahren kann bis zu einem Tag vor dem Beginn der Präparation durchgeführt werden.
4. Mischen Sie 0,9 g niedrigschmelzender Agarose in ~ 31 ml Dissektion Puffer, Mikrowelle für 25 sec mit Kappe locker. Mikrowelle, bis sie geschmolzen und sicherstellen, dass sich die Mischung nicht überlaufen.
5. Halten Sie bei 55-65 ° C, bis sie benötigt.
   Hinweis: Das folgende Verfahren kann bis zu einem Tag vor dem Beginn der Präparation durchgeführt werden.

4. Mantel der Scheibe Kultureinsätze mit Laminin

Hinweis: Das folgende Verfahren kann bis zu einem Tag vor dem Beginn der Präparation durchgeführt werden.

1. In einer Gewebekultur Kapuze, mit einer sterilen Pinzette, legen Sie ein Stück Kultureinsatzes in jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte (mit der Anzahl der Scheiben Sie beabsichtigen, zu erhalten, können rund 12 von einem Verfahren gesammelt werden. Das folgende Verfahren wird für die schriftliche sechs Scheiben). Füllen Sie einen 15-ml-Erlen t ube mit 1x PBS (800 ul / Einsatz) und fügen Laminin (10 ug / ml).
2. Zugabe von 800 ul des Laminin Mischung auf der Oberseite jeder Scheibe Kultureinsatzes. Inkubieren bei 37 ° C, bis es benötigt.

5. Vorbereitung für Dissection

1. Füllen Sie jede Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 1200 ul Scheibe Kulturmedien. Füllen Sie alle nicht verwendeten Vertiefungen mit 1.200 & mgr; l PBS und füllen Sie den zentralen Raum der Platte mit 5 ml 1x PBS. Bewahren Sie diese Platte bei 37 ° C.
2. Sterilisieren Dissektionswerkzeuge in 70% Ethanol. Wischen Vibratom Klinge mit Aceton, um Öl zu entfernen und zu sterilisieren vor der Verwendung.
3. Platzieren Sie drei ³⁵ mm 2 Gerichte und fünf ¹⁰ cm 2 Gewebekulturschalen in der Kapuze. Füllen Sie einen ¹⁰ cm 2 Teller mit Dissektion Puffer und auf Eis.
   Hinweis: Prozess Welpen eine zu einem Zeitpunkt.

6. Dissection

Hinweis: Prozess Welpen eine zu einem Zeitpunkt.

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Abbildung 2. Dissection Cuts. Diese Bilder zeigen die notwendigen Präparation Schnitte, um den Schädel aus dem Gehirn eines P6 der Maus zu entfernen. Schnitte sind als gestrichelte Linien gezeigt. (A) Schneiden 1 dargestellt. Schnitte 1 und 2 sind aus dem Hirnstamm / posterior bilateral Anschluss an die Augenhöhle auf jeder Seite .. (B) Schnitte 3 und 4 gezeigt sind, hergestellt. Schneiden 3 wird von einer Augenhöhle zu den anderen Verbindungs ​​Cuts 1 und 2 Cut 4 beginnt an der Mittellinie geschnitten 3 und weiter in Richtung der Spitze der Nase Division des Schädels zwischen den Riechkolben (Maßstab = 4,4 mm). Machte Bitte Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

1. Betäuben die P6-Maus mit Isofluran-Exposition (100% Isofluran). Nach ca. 5 min, wenn die Atmung verlangsamt oder es gibt kein Zeichen der Atmung, die schnell zu enthauptenMaus mit einer scharfen Schere. Sprühen Sie den Kopf mit 70% Ethanol und in eine Gewebekulturschale.
2. Unter Verwendung der großen stumpfen Pinzette halten Kopf ruhig durch Greifen die Nase. Verwenden mittlere Dissektion Schere, entfernen überschüssige Haut am Schädel zu offenbaren.
3. Stellen Schnitte 1 und 2 durch Schneiden des Schädels bilateral von posterior des Schädels nach vorne auf jeder Seite, Verbinden der Schnitt an der Augenhöhle. Halten Sie die Spitze der Schere so nah an den Schädel wie möglich, um Gewebeschäden zu vermeiden.
4. Für die Schnitt 3, verwenden Sie kleine Feder Schere schneidet 1 verbinden und 2. Verwenden Sie dann die kleinen stumpfen Pinzette vorsichtig abziehen den Schädel.
5. Mit den kleinen Federschere, vorsichtig schneiden Sie die restlichen Schädel entlang der Mittellinie auf der Oberseite, so dass die verbleibende Schädel wird 2 Hälften (Abbildung 2, geschnitten # 4). Mit einer Pinzette ablösen den Schädel, um die beiden Riechkolben offenbaren.
6. Legen Sie eine abgeflachte Spachtel (mit Dissektion Puffer angefeuchtet, so dass Gewebe wird nicht dabei bleiben) zwischen bottom des Gehirns und der Schädelbasis, entfernen Sie vorsichtig das Gehirn und setzen Sie in die Schale mit Dissektion Puffer auf Eis.
7. Wiederholen Sie Schritt 6, um ein zweites Gehirn für das Schneiden zu erhalten

7. Einbetten der Gehirne in Agarose

1. Legen Sie zwei der 35 mm ^{2 Gerichte} auf dem Eis auf und wischen Sie ein Paar große stumpfen Pinzette mit 70% Ethanol.
2. Gießen Sie 3% niedrig schmelzender Agarose (in Schritt 3 hergestellt) in die beiden Gerichte, bis sich eine Kuppel bildet an der Spitze. Stellen Sie Timer für 3 min. An 3 Minuten (Test durch Berühren des Randes der Agarose gefüllten Kuppel, wenn die Polymerisation von Agarose zu beobachten ist, ist es bereit) abholen einem Gehirn mit stumpfen Pinzette und Ort in die Seite eines Agarose gefüllten 35 mm Schale, dann Umzug es in die Mitte der Schale (dies entfernt überschüssiges Dissektion Puffer um das Gehirn herum so montiert besser).
3. Wiederholen Sie ^für die 2. Gehirn. Starten Sie einen Timer für 10 Minuten.
4. Nach 10 Minuten, stecken Sie einen flachen Spatel in den Raum zwischenAgarose und Teller zu knallen das polymerisierte Agarose, die die P6 Gehirnen.
5. Verwenden Sie einen flachen Rasierklinge, um die Agarose in einen Würfel um das Gehirn zu trimmen, um sicherzustellen, dass die Kanten so gerade wie möglich.
6. Zeigen Sekundenkleber auf der Vibratom Platte in zwei Streifen. Dann holen die Agarose montiert Gehirn und legen Sie es vorsichtig nach unten über die Klebstoff, für sagittal positioniert. Machen Sie dasselbe für die anderen Gehirn. Stellen Sie sicher, beide Gehirne up miteinander ausgekleidet.
7. Lassen Sie den Kleber trocken bei RT für 5-8 min. Während dieser Zeit, füllen Sie das Eis Halter Bereich des Vibratom mit zerstoßenem Eis und Wasser.

8. Schneiden mit dem Vibratom

1. Setzen Sie den Schneidreservoir in das Eis Halter Bereich, bewegen Sie die Registerkarte auf der rechten Seite, um sie zu verriegeln.
2. Unter Verwendung der kreisförmigen Schraubenzieher, nehmen Sie den Kreis Vibratom Platte mit den Gehirnen darauf geklebt, und setzen Sie ihn in das Reservoir. Entfernen Sie den Schraubenzieher und befestigen Sie die Platte an Ort und Stelle mit the Sechskantschraubendreher. Achten Sie darauf, die Platte und die Schneidbehälter sind fest an seinem Platz.
3. Mit einer Pinzette, Abholung der Vibratom Klinge, passen sie in den Schneidkopf einrasten mit Sechskant-Schraubendreher. Dann sichern Sie den Schneidkopf mit dem angebrachten Klinge auf der Vibratom mit der Rundschrauben.
4. Rufen Sie die Position des Rasierers, als in der Nähe der Agarose-eingebetteten Gehirne wie möglich, gleichzeitig aber dafür sorgen der Rasierer in der gleichen Höhe (oder knapp darüber) die Gehirne. Füllen Kammer mit ausreichend kaltem Sezieren Puffer, um die Klinge zu decken.
5. Drücken ↕ Taste einmal (Sie sollten sehen, es blinkt diese Taste definiert die Grenzen, wenn die Klinge hin und her zu gehen), und drücken Sie dann "Weiter", um manuell schneiden die eingebettete Gehirn, Freigabe, bis der Rasierer löscht die Agarose-Block. Drücken Sie sofort ↕ Taste erneut, wird dies das Ende des Bereichs für die automatische Schneid definieren.
6. Drücken Sie die "SINGLE / CONT" Taste einmal, und der Light durch CONT sollte weitergehen. Stellen Sie die Schnittstärke auf 400-450 & mgr; m, Vibrationsfrequenz auf 5,5-6, und die Geschwindigkeit bis 4. Dadurch wird die Ausschnitteinstellung sein.
7. Drücken Sie die "Start / Stop" Taste einmal, und automatische Schneiden beginnen soll. Drücken Sie auf "Pause", um Gewebe zu sammeln mit dem Löffel mit Löchern, wie gebraucht. Es sollte etwa 5-10 min zu nehmen, um näher an der Mittellinie zu erreichen. An dieser Stelle drücken Sie "Pause" und ändern Sie die Geschwindigkeit auf 3, und ändern Sie die Dicke auf 200 um. Sammeln Sie nicht die erste Scheibe nach dieser Änderung produziert.
8. Die gewünschten Scheiben von 200 & mgr; m Dicke wird der Riechkolben durch das Kleinhirn schön definiert. Übertragen Sie jede gewünschte Scheibe, während sie in 6-Well-Platten mit Dissektion Puffer auf Eis gefüllt geschnitten. Tun Sie dies, indem Sie den Puffer in der Schneidkammer um das Gewebe, um die Scheibe zu schweben, es zu berühren so wenig wie möglich, heben Sie sie aus dem Puffer, wenn es direkt über dem Schaumlöffel. Typischerweise etwa 12 Scheiben mit den gewünschten Strukturen gesammelt werden können. Die Scheiben können in Sezieren Puffer auf Eis für 20 min belassen werden.
9. Während Scheiben sind auf Eis, nehmen Sie 6-Well-Platte mit Einsätzen mit Laminin von 37 ° C-Inkubator überzogen. In der Dissektion Haube entsorgen Sie die Laminin kümmert sich nicht um die Einsätze zu beschädigen. In 3,5 ml Scheibe Kulturmedien an die Spitze jedes Einsatzes. Die Oberseite der Medien eine Kuppelform ohne Verschütten in die Vertiefungen zu bilden.

9. Auflage der Scheiben auf die Einsätze

1. Unter Verwendung des Schaumlöffel Werkzeug, platzieren Sie einen Hirnschnitt in die Medien auf dem Einsatz, leichtem Druck die Scheibe vollständig eingetaucht werden. Wiederholen Sie für alle Scheiben.
2. Verwenden Sie einen p1000 von der Oberseite des Einsatzes ziehen 1 ml Scheibe Kulturmedien und verzichten sie in den Boden des Bohrlochs. Entfernen und entsorgen Sie die überschüssige Medien, bis die Ränder der Agarose um das Gehirn slicebecome sichtbar. Tun Sie dies für die restlichen Scheiben schneiden.
3. Pick up tEr einfügen, indem Sie den Rand mit einer Pinzette, Neigung und entfernen Sie überschüssige Medien. Dann schnell das Einsatzführung in ³⁵ mm 2 Schale mit 1 ml Scheibe Kulturmedien. Verwenden Sie 2 Paar scharfe Pinzette, um die Agarose um das Gewebe zu entfernen, dabei nicht zu strecken / Beschädigung Slice oder Sack ein Loch in die Membran (am einfachsten, wenn Sie einen Riss am Rand der Agarose zu machen, dann auseinanderziehen die Agarose aus jeder Seite). Dann bewegen Sie den Einsatz zurück in die 6-Well-Platte, und wiederholen Sie für die restlichen Scheiben schneiden.
4. In einer Gewebekultur Kapuze mit dem Gebläse ausschalten (um Scheiben austrocknen) entfernen Agarose-Fragmente aus jeder Membran.
5. Übertragen Sie die Scheiben auf die 6-Well-Platte in Schritt 5.1 vorbereitet und speichern Sie die Platte bei 37 ° C. Scheiben Inkubieren für 24-48 Std.

10. Ändern der Scheibe Kultur Medien

1. Wiederholen Sie Schritt 5.1 mit einem neuen 6-Well-Platte.
2. In einer Gewebekultur Kapuze mit dem Gebläse aus, übertragen Sie die Einsätze, neue 6-Well-Platten containing frische Scheibe Medien.

11. Plating Tumorzellen auf der Scheibe

1. Beschallen das CM-Dil Farbstoff und Spin auf mittlerer Geschwindigkeit für 2 Min.
2. Spin down Tumorzellen, die für die Überlagerung bei 201 xg für 5 min verwendet. Dann resuspendieren in 2 ml Scheibe Kulturmedien.
3. Hinzufügen 7 ul CM-DiI in die 2 ml von Zellen und Medien und bei 37 ° C für 20 min.
4. Spin down Zellen bei 201 × g für 5 Minuten und resuspendieren in 200 ul Schneiden Medien. Man reibt vorsichtig, um die Zellen zu trennen (10-20 mal oder bis Pellet ist weg) und fügen Sie dann 800 ul Schneiden Medien bis 1.000 & mgr; l Gesamtvolumen.
5. Graf lebensfähigen Tumorzellen unter Verwendung von Trypanblau. Hinzuzufügen grün fluoreszierenden Mikrokugeln, um Tumorzellen, in der gleichen Konzentration wie Zellen. Diese inerten Mikrosphären werden als Kontrolle zu dienen. Spin down die Zelle / Mikrokügelchen-Mischung bei 201 xg für 5 min und resuspendieren in gewünschte Menge Scheibe Kulturmedien. Platten Zellen in einer Dichte von 6000 Zellen / slEis in 65 ul Volumen. Je nach Wunsch und Verfügbarkeit können die Anzahl der Zellen plattiert pro Schicht erhöht werden.
6. In der Gewebekultur Haube verzichtet Zellen in 65 ul Medium / Scheibe auf die Mitte der Scheibe.

12. Imaging und Befestigung

Hinweis: eine Nikon Eclipse-Ni C2si aufrecht konfokalen wurde verwendet, um ein großes Bild Scan des gesamten Sagittalscheibe bei 4X mit roten und grünen Fluoreszenzkanäle zu nehmen. Wenn Scan-Funktion nicht verfügbar ist, nehmen Sie mehrere Bilder nacheinander auf der Scheibe und spätere Zusammenfügen der Bilder in Photoshop (mit dem Standort von Mikrokügelchen und den Rand der Scheibe zu navigieren).

1. Am nächsten Tag (Tag 1 Bildgebung), übertragen Scheiben in sechs ³⁵ mm 2 Gerichte mit 1 ml Scheibe Kulturmedien. Bild jede Scheibe eine zu einem Zeitpunkt auf der fluoreszierenden aufrechte Mikroskop. Nehmen Sie eine große Bild Scan des gesamten Sagittalscheibe bei 4X mit roten und grünen Leuchtstoffkanälen. Halten Laserund Gain-Einstellungen die gleichen für jede Scheibe. Am Ende der Bildgebung, übertragen alle Scheiben auf eine 6-Well-Platte mit frische Scheibe Medien.
2. Wenn neben der EDU, andere Proliferationsmarker oder Drogen Zustand gewünscht wird, erstellen Sie eine Bestandsaufnahme der Scheibe Medien mit dem Medikament, das für die Medien Veränderungen der Tages zur Behandlung Zustand verwendet wird. Die Behandlungsbedingungen sollten bei Schritt 12.1 (direkt nach Tag 1 Bildgebung) eingeführt werden. Jede EDU oder Proliferationsmarker sollten die Medien auch bei 12,1 beginnend aufgenommen und täglich aktualisiert (verwenden EDU bei 10 uM) werden.
3. Bild erneut am Tag 7 mit den gleichen Einstellungen wie das Tag 1 Bilder.
4. Nach dem 7. Tag Bildgebung abgeschlossen ist, bewegen jede Scheibe in einer 6-Well-Platte mit jeder Vertiefung mit 1,2 ml 4% Paraformaldehyd (PFA). Vorsichtig und langsam fallen zusätzlich 1 ml PFA auf jeder Scheibe. Lassen Sie bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
5. Entfernen PFA aus jeder Vertiefung und von der Oberseite jeder Scheibe. Mit PBS waschen jeden gut 3x. Bewahren Sie die Scheiben in PBS bei4 ° C für die Färbung oder Montage auf Folien.
   Hinweis: ImageJ Einstellungen muss möglicherweise angepasst und optimiert werden, um für die Bild- und Objektqualität sowie Tumorzellgröße zu berücksichtigen.

13. Die Quantifizierung der Bilder (mit ImageJ)

Hinweis: ImageJ Einstellungen muss möglicherweise angepasst und optimiert werden, um für die Bild- und Objektqualität sowie Tumorzellgröße zu berücksichtigen.

1. In ImageJ, verwenden Sie das Polygon-Werkzeug, um die ganze Slice oder die Region, die Sie zu quantifizieren wollen, zu skizzieren. Fügen Sie diese Auswahl auf die ROI-Manager, wo Sie es umzubenennen und zu speichern.
2. Rechtsklick auf den ausgewählten Bereich, und wählen Sie Duplizieren. Benennen Sie diese Kopie des Bildes mit der Region, Scheibe, Tag. Drücken Sie Strg + Umschalt + E, um den Umriss zu zeigen, dann wählen Sie Bearbeiten - subtrahieren Hintergrund - Rollkugel Radius = 4.
3. Nach Abzug des Hintergrunds, wählen Sie "einzustellen Schwelle" in der "Bild" im Dropdown-Menü. Überprüfen dunklem Hintergrund -; sehen Sie Bild vergrößert und stellen Sie die Schwelle. Haben sie die Schwelle, indem die Schwelle bar eingestellt ist, sicherzustellen, dass alle Zellen enthalten / markiert, aber extrem kleine Punkte, die Trümmer sind (oder kleiner als eine Zelle) sind nicht enthalten. Verwenden Sie den gleichen Schwellenwert für alle Bilder. Bewegen Sie den Schwellenfenster zur Seite.
4. Wählen Sie "Bearbeiten" - "Finden Maxima" und stellen Sie die Rauschtoleranz zwischen 5 und 10 und prüfen Sie folgendes: Vorschau Punktauswahl, Ausgangstyp als segmentierte Partikel auszuschließen Kante Maxima, oberhalb der unteren Schwelle. Dann wählen Sie erneut die Region von Interesse, indem Sie Strg + Umschalt + E.
5. Wählen Sie "Analysieren Particles" von dem Analysieren Sie im Dropdown-Menü. Stellen Sie die Pixelgröße auf 4-40 und die Rundheit, um 0,00 bis 1,00. Auch auf "Show Overlay-Konturen" "Display-Ergebnisse" und "zusammenfassen", und drücken Sie OK.
6. Nehmen Sie alle Rohdaten und die Zusammenfassung in einem Microsoft Office-Dokument. Der "Count" für jede Region is benötigt, um fache Veränderung über die Woche in der Kultur zu berechnen.
7. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Bilder und Bereiche von Interesse, dafür zu sorgen, dass die Schwelle und andere Einstellungen konsistent bleiben.
8. Errechnen fache Veränderung der Zellzahl auf der Scheibe während der Woche in Kultur durch Dividieren der Anzahl der Tumorzellen auf der Scheibe an Tag 7 auf der Anzahl von Zellen auf der Scheibe an Tag 1. Ähnlich fache Veränderung der Zellzahl in den einzelnen Regionen wird berechnet, indem die Anzahl der Zellen in dieser Region am Tag 7 durch die Anzahl der Zellen in dieser Region am 1. Tag ermittelt.
9. Führen Sie Schritt für 13,8 Mikrosphären als auch. Die Mikrokügelchen-Nummer auf der Scheibe sollte als an Tag 1 (Fold Change = 1) ist das gleiche auf Tag 7 sein. Ebenso sollten Mikrosphärenzahl innerhalb jeder Region das gleiche auf Tag 7 als an Tag 1 (Fold Change = 1) sein. Wenn fache Änderung unterscheidet sich von 1, bedeutet dies, Veränderungen in der Scheibe Topographie über die Zeit.

14. Die Färbung

1. Band ein Stück Parafilm auf the Labortisch und zeichnen sechs Kreise mit einem flüssigen Blocker Pap Pen (eine für jede Scheibe, nur größer als die Größe einer Scheibe). Jeweils etwa 400 ul PBS in einem Punkt in der Mitte jedes Kreises. Nummer oder beschriften Sie die Kreise, um jede Scheibe zu identifizieren.
2. In 1 ml PBS, nutzen einer Rasierklinge, um ein Quadrat um die Scheibe geschnitten, etwas Platz der Membran um die Scheibe verlassen. Mit einer Pinzette bewegen Sie den ausgeschnittenen Scheibe in dem ersten Kreis und sorgfältig legen Sie die Scheibe auf der Oberseite der Blase von PBS. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Scheibe nicht mehr klappen auf sich selbst oder auf dem Kopf bei diesem Prozess umgedreht zu werden. Entfernen Sie dann die PBS von der Unterseite der Scheibe und legen Sie sie auf der Oberseite der Scheibe und, wenn nötig, um sicherzustellen, dass es unter Wasser bleibt, fügen Sie mehr PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt für jede Scheibe.
3. Machen 10 ml 3% BSA in PBS. Nehmen Sie 2 ml, und fügen Sie 100 ul Digitonin zu. Mischen und in den Scheiben zu blockieren und permeabilisieren, 30 min bei RT.
   Hinweis: Die Verwendung anderer Permeabilisierung Mittel wie Triton X-100 führt zum Verlust des CM-Dil-Kennzeichnung führen.
4. Entfernen Permeabilisierung / Blockierlösung und spülen Sie 3x mit PBS für 10 min.
5. Wenn Färbung für EDU, folgen Sie den Anweisungen von dem Kit bereitgestellt, um die Mischung zu montieren. Wenden Sie die Mischung für 45 min. Wenn die Färbung mit anderen Antikörpern, muss das Protokoll für die Konzentration von primären und sekundären Antikörpern (~ 1 h RT für primäre und sekundäre) optimiert werden. Spülen 3x mit PBS für 10 min.
6. Fleck mit DAPI 1: 1000 in PBS für 5 min RT. Spülen 2 × mit PBS.

15. Montage der Scheiben

1. Übertragen Sie die Scheibe auf einen Objektträger. Sicherzustellen, dass die Seite der Membran mit der Scheibe bleibt nach oben und nicht falten sich zusammen. Zeichnen Sie einen Rahmen um die Scheibe mit einem flüssigen Blocker pap Stift.
2. Legen Sie eine kleine Deckglas (5 mm) auf jeder Seite der Scheibe (die Scheibe vor Beschädigung zu halten). Drop zwei oder drei Tropfen Fluoromount-G (für Immunfluoreszenz) auf der Oberseite desScheibe, um gerade noch abdecken. Dann decken die Scheibe lange Deckglas (24 x 50 mm).
3. Wiederholen Sie für jede Scheibe. Seal die Ränder der Objektträger mit Nagellack und bei 4 ° C. Do konfokale Abbildung der Färbung.

Representative Results

In diesem Abschnitt wird ein Beispiel für die Art der Ergebnisse, welche durch Verwendung der Hirntumor / organotypischen Kokultur zur regionalen Mikroumgebung bevorzugt untersuchen sowie neue Therapien zu testen erwarten. Wir zeigen, dass der Assay wurde entwickelt, um die Mikroumgebung bei Hirntumoren replizieren, da der Gewebeorganisation und proliferativen Zustand der Scheibe eingehalten wird (Figur 3). Wir zeigen auch, dass eine Erhöhung der Anzahl der Tumorzellen auf der Scheibe mit der Zeit können teilweise aufgrund der Wanderung von Zellen auf der Hirnschnitt-Mikroumgebung (Abbildung 4). Wir haben auch gezeigt, dass diese Co-Kultur kann als quantitatives Assay verwendet werden, indem die Falte Veränderung in der Zellzahl über die Woche in Kultur für bestimmte Bereiche der Scheibe oder für die gesamte Hirnschnitt (Figur 6) Vorläufige Ergebnisse aus mehreren Tumorzelltypen haben gezeigt, daß die Anzahl der Tumorzellen kann durch konfokale Bildgebung quantifiziertdie 200 & mgr; m dicke Scheibe aufgrund der Tatsache, dass die Zellen zu einer Tiefe von 20-50 um in die Scheibe wandern nur.

Wir haben festgestellt, dass das grün fluoreszierende Mikrokugeln eine effektive Steuerung für Änderungen in Scheibentopographie, da sie keine Bewegung oder Veränderung in der Zahl der gesamten Zeit in der Kultur zeigen (Figur 5). Nach Befestigung der Co-Kultur kann Färbung durchgeführt, um Tumorzellen in einem Gehirn-Mikroumgebung und die Auswirkungen von Medikamenten auf die Tumorzellproliferation, Zelltod, die Veränderungen in der Proteinexpression (Figur 7) zu prüfen. Wir haben gezeigt, dass dieser Test verwendet werden, um Arzneimitteltherapien durch einen Vergleich der Maus Medulloblastomzellen mit Smo (Smoothened) antagonist LDE225 (Sonidegib) oder mit einer Fahrzeugsteuerung behandelt zu testen. Zunahme der Zellzahl auf der Scheibe fach mehr als einer Woche in Kultur wurde quantifiziert und graphisch dargestellt (Zellzahl an Tag 7 / Zellzahl an Tag 1) Diese Daten zeigen, dass LDE225 stark deFalten Tumorzellzahl im Vergleich zu ^der Steuerung 6. Dieser Effekt kann auch in den repräsentativen Bildern gesehen werden eingeschlossen (Bild 8). Wir zeigen auch, Bilder menschlichen Medulloblastomzellen im Schnittkultur-Assay (9) gezüchtet.

Abbildung 3 Hirntumor / organotypischen Kokultur Assaydesign. (A) organotypischen Hirnschnitt sagittalen aus einem P6 Maus direkt auf eine halbporöse Membran angeordnet und Medium wird auf dem Boden der Kulturschale gegeben. Die Kultur wird in dem Medium auf der einen Seite eingetaucht und zugänglich ist, um Sauerstoff von der anderen Seite. Markierten Tumorzellen werden überlagert auf der Scheibe und Zellzahl über die Zeit verfolgt werden. (B) In der Kultur, der Slice unterhält eine Gewebe-Organisation, die sehr ähnlich ist, dass in vivo beobachtet. Preservation des Gehirns Mikroumgebung wird durch EdU Kennzeichnung proliferative Granulat Neuron-Vorstufen in der äußeren Körnerschicht (EGL) des Kleinhirns in der Schnittkultur demonstriert. In der Schnittkultur, diese Vorläuferzellen übernehmen die Thymidin-Analogon EDU, wie es in vivo in diesem Entwicklungsstadium (P6) (weißer Pfeil zeigt an, EGL) beobachtet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4. Human Astrozytomzellen in Brain Tumor / organotypischen Kokultur Assay. Eine Erhöhung der menschlichen Gehirntumorzellen auf der Scheibe kann die Relokalisierung von Tumorzellen von der Membran zu der Schnittkultur Rechnung zu tragen. (A) ein Bereich auf dem Rand des eine Scheibe am Tag 1 (oben) und Tag 7 (unten), wo Zellen kann m igrate von der Membran auf die Hirnschnitt. (B) eines zweiten Beispiels einer möglichen Zellmigration auf die Hirnoberfläche am Rand der Scheibe. Tag 1 (oben) und Tag 7 (unten). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5. Microsphere Kontrollkügelchen. Tag 1 (rot) und Tag 7 (grün) Steuerung Bilder von fluoreszierenden Mikrosphären werden überlagert (gelb), um keine Bewegung der Mikrokügelchen mehr als eine Woche in der Kultur zu offenbaren. Tag 1 und Tag 7 Bilder wurden in der gleichen Position innerhalb der Scheibe (Maßstab = 45 & mgr; m) übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 6. Quantifizierung in ImageJ. (A) Das Bild von einer Scheibe in ImageJ geöffnet und die ganze Scheibe und / oder Regionen sind für die Quantifizierung skizziert. (B) Die Region von Interesse ausgewählt ist und eine Kopie des Bildes gemacht wird. (C ) Die Hintergrundfluoreszenz aus dem Bild subtrahiert. (D) Die Schwelle wird für die Zellgröße und -form einstellen, der Bestimmung, was gezählt werden. (E) Analysieren Partikel, um die Zellzahl in der Region von Interesse zählen. Fache Veränderung der Zellzahl kann dann durch Division der Anzahl der Zellen an Tag 7 durch die Anzahl der Zellen an Tag 1 für jede Region von Interesse oder die gesamte Fläche der Scheibe berechnet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen .

Abbildung 7. Färbung für Proliferation. Bild zeigt, wie Färbung (nach Befestigung der Scheibe in PFA) erfolgreich auf der Scheibe nach einer Woche in der Kultur durchgeführt werden. Bild zeigt DAPInuclear Färbung (blau), rot fluoreszierend markierten Maus Medulloblastom Zellen und grüne Kennzeichnung für den Einbau von Thymidin-Analogon in DNA als Marker für die Proliferation. EDU wurde in der Scheibe Kulturmedien (10 & mgr; M) für eine Woche enthalten (weiße Pfeile zeigt Zellen, die positiv für EDU und gelben Pfeile zeigen Zellen negativ für EDU) (Maßstab = 50 & mgr; m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen Abbildung.

Abbildung 8. Maus Medulloblas toma Zellen mit LDE225 behandelt. Diese Figur zeigt, medikamentöse Behandlung von Tumorzellen in der Scheibe Overlay-Assay-System. (A) Grafische Darstellung der Daten von einer Maus Medulloblastom Experiments gesammelt. DMSO war der Kontrollbedingung (CTL) und LDE225 (Sonidegib) (1 & mgr; M) (LDE) war der Behandlungsbedingung. Zunahme der Zellzahl auf der Scheibe fach mehr als einer Woche in Kultur wurde (am Tag 7 / Zellzahl an Tag 1 der Zellzahl) quantifiziert (n = 12 CTL, n = 13 LDE, Fehlerbalken = SEM). (B) Repräsentative Bilder der Fahrzeugkontrolle behandelten Scheiben an Tag 1 (oben) und Tag 7 (unten). (C) Repräsentative Bilder der LDE behandelten Scheiben an Tag 1 (oben) und Tag 7 (unten). Die Bilder wurden mit 4x Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 9. Menschen Medulloblastom Zellen in Brain Tumor / Organotypischen Co-Kultur. Menschlichen Medulloblastom-Zellen wurden von James M. Olson an der Universität von Washington erhalten, die für eine Woche in der Schnittkultur-Assay entwickelt. (A) Tag 1 Bild menschlichen Medulloblastom-Zellen auf der Maus Hirnschnitt gewachsen. (B) Ein Bild von der gleichen Maus Hirnschnitt mit menschlichen Medulloblastom-Zellen nach einer Woche in Kultur (Tag 7). Die Bilder wurden mit 4x Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt, wie Gehirntumorzellen können fluoreszenzmarkierte und auf einer sagittalen Hirnschnitt einer P6 Maus beschichtet werden und dann überwacht für eine Woche in der Kultur. Diese Hirntumor / organotypischen Kokultur Test kann verwendet werden, um die Wirkung der regionalen Mikroumgebung auf die Tumorzellzahl zu bestimmen, und kann auch als ein System zur Messung der Wirksamkeit von neuen Medikamenten auf die menschliche Tumorwachstum verwendet werden. Frühere Studien haben eine ähnliche Strategie verwendet werden, um die Rolle des Gehirns Mikroumgebung auf neurale Vorläufer Proliferation ^7,8 beurteilen.

Dieser Test, bei dem Gehirntumorzellen werden in einer organotypischen Kultur beimpft ⁹ stellt ein System zum Züchten von menschlichen Gehirntumorzellen, die nur schwer unter normalen Zellkulturbedingungen fortzupflanzen sind. Ein kritischer Aspekt dieses Verfahrens ist die Bedeutung der Aufrechterhaltung der Gesundheit des Slice und die Tumorzellen. Die Länge der Zeit, die die Scheiben in Puffer sitzen während der dissection und bei RT während der Bilderzeugung sollte begrenzt werden, um sicherzustellen, dass die Scheiben und die Zellen bleiben so gesund wie möglich. Wenn primären humanen Gehirntumorzellen werden in diesem Test verwendet wird, sollten die Zellen auf die Scheiben so schnell wie möglich nach Biopsie plattiert werden. Daher sollten die Scheiben vor der Operation vorbereitet werden. Jede Differentialwirkung Bildgebungszeit zwischen Scheiben zu verhindern, die Menge der Zeit aus dem Inkubator verbracht sollte kurz und konsequent für alle Schnittkulturen in einem Experiment. Die Mikrokügelchen-Kontrollen sind wichtig, da sie im Laufe der Zeit zur Verfügung stellen räumlich konsequente Mark. Darüber hinaus können Verzerrungen in der Schnittkultur durch Schrumpfung, Zerreißen oder Falten durch Abbildung der Mikrokugel-Perlen leicht ersichtlich.

Eine der Beschränkungen dieses Protokolls ist es, dass die Zellen nur in dieser Scheibe Kultursystem für ungefähr eine Woche vermehrt werden. Dennoch für einige Arten von Hirntumoren ist dies eine signifikante Verbesserung gegenüber dem derzeitigen Stand of Angelegenheiten. Eine zweite Einschränkung ist, dass die Blut-Hirn-Schranke wird eliminiert, was ein wichtiger Faktor bei der Beurteilung Medikamenten, zur Behandlung von Gehirntumoren verwendet werden kann, ist. Eine dritte Überlegung ist, dass dies eine niedrige Durchsatz-Assay, die nicht zum Testen einer Bibliothek von Verbindungen verwendet werden kann.

Dieser Assay ist vielseitig und leicht modifiziert werden, um verschiedene Arten von Tumorzellen und eine Vielzahl von Untersuchungsfragen zu studieren. Dieses Protokoll kann als quantitatives Assay verwendet, um die Wirkungen von neuartigen Therapien auf die Tumorzell Überleben und das Wachstum (persönliche Mitteilung Sun et al.,) Zu untersuchen. Ein Vergleich des fache Veränderung der Tumorzellzahl in verschiedenen Regionen des Gehirns stellt ein Verfahren zum Entschlüsseln der Wirkungen der Mikroumgebung auf das Tumorwachstum.

Diese Hirntumor / organotypischen Kokultur System bietet auch die Möglichkeit, das Verhältnis von Gehirntumorzellen und bestimmte Hirnmikroumgebungen zu untersuchen. Many Arten von Gehirntumoren zeigen eine deutliche Muster der Entwicklung in spezifischen Hirnregionen und Mikroumgebungen ^3,4. Durch Aufwachsen markierten menschlichen Tumorzellen zu einer sagittalen Maushirnschnitt können Zellen für regionale Präferenz, die im Einklang mit der in vivo-Wachstumsregion sein kann, überwacht werden. Eine weitere Untersuchung der Mikroumgebung, die die Tumorzellen bevorzugen könnte zur Identifizierung von potenziellen Faktoren, die das Tumorzellwachstum zu unterstützen führen. Dieser Assay kann bei der Verbesserung der in vitro-Zellkulturbedingungen zu unterstützen und kann auch ein System, um zu untersuchen, wie Tumorinitiation verhindert oder effektiv behandelt.

Es gibt bestimmte Arten von Gehirntumoren, die nicht in der normalen Zellkulturbedingungen oder durch Maus orthotope oder subkutane Xenotransplantate vermehrt werden können. Für diese Tumorarten ist es schwierig, neue Arzneimitteltherapien auf menschlichen Tumorzellen zu testen. Dieses Protokoll zeigt, dass menschlicher Gehirntumorzellen können in der Scheibe gehalten werdenKulturtest und medikamentöser Behandlung quantitativ bewertet werden. Nach der Arzneimittelbehandlung, Co-Färbung der Tumorzellen kann eine weitere Abschätzung der die Wirkung des Arzneimittels auf die Tumorzellproliferation und Pathway-Hemmung. Jüngste Studien haben gezeigt, dass es einen drastischen Unterschied zwischen einem Arzneimittel Wirkung auf Krebszellen in einem normalen Monolayer-Zellkultur im Vergleich zu einem 3D heterogenen Zellkulturumgebung ^{10 betragen.} Ähnlich normalen erwachsenen und Tumor-Epithelzellen, die eine kurze Lebensdauer in vitro haben, wurde gezeigt, dass bedingt auf einen proliferativen Zustand neu programmieren, wenn sie auf Fibroblasten-Feeder-Zellen mit einem Rho-Kinase-Inhibitor ¹¹ gewachsen in Kombination. Diese Studien unterstützen weiter die Bedeutung der Aufrechterhaltung Tumorzellen in einer organotypischen, 3D, klinisch relevanten Mikroumgebung und die Relevanz dieser Zellkultursystem zur aktuellen Krebsforschung. Daher ist dies ein wertvoller Test zum Testen von Arzneistoffen an menschlichen Tumorzellen in einer klinisch relevant Weise.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Invitrogen	17504044
Glucose	Invitrogen	17502048
Pennicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
HBSS	Life Technologies	14185-052
B-27	Life Technologies	17504-044
N2	Life Technologies	17502-048
Glutamax	Life Technologies	35050061
Neurobasal-A- Medium minus phenol red	Invitrogen	12349015
Low Melting Point Agarose	Promega	V2111
Slice Culture Inserts	Milipore	PICM0RG50
laminin	Invitrogen	23017015
Cm-DiI	Invitrogen	V22888
EDU (Labeling and Detection)	Life Technologies	c10337
Microspheres	Life Technologies	F-21010
Vibratome	Leica
Confocal Microscope	Nikon Eclipse Ni C2si
ImageJ software
5 mm Cover Glasses	Fisher Scientific	64-0700 (CS-5R)