Introduction
מחקר הסרטן אחרון הפך התקדמות משמעותית בזיהוי מוטציות גנטיות, שינויים מולקולריים וטיפולים אפשריים עבור מגוון רחב של גידולים במוח. למרות התקדמות זו, גידולים במוח נשארים אחד הגורמים העליונים של תמותה הקשורים לסרטן למבוגרים ולילדים. גורמים מגבילים במחקר גידול במוח כוללים את הזמינות המוגבלת של דגימות מטופל ראשוניות ושורות תאים וקושי בשכפול microenvironment המוח הייחודי והטרוגנית במערכות ניסיוניות נגישות. עבור רבים מוח גידולים התנאים הנדרשים כדי לשמור על תאים סרטניים לאורך הזמן עדיין לא ידועים. אפילו לגידולים במוח שניתן לגדל בהשעית תא כneurospheres, תנאי התרבות יכולים להשפיע על התאים הסרטניים 1,2. ואכן, התוספת של גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי או גורם גדילה באפידרמיס לעודד התפשטות ומעכבות בידול עשוי לשנות ביטוי גני 1. שיטות אחרות לתאים סרטניים גידול כזהכהתפשטות גידולים בעכברים באמצעות xenograft orthotopic או תת עורי של תאים סרטניים הם מבחני חשובים, אבל מוגבלים על ידי גורמים כמו זמן של התפתחות גידולים (בעיקר לגידולים בדרגה נמוכות), עלות, ומספר התאים הסרטניים שיכול להיות מוזרק ולמד . שיטות לפיכך הנוכחיות לגידול תאים סרטניים במוח אנושי אינן מספיקות לשמירה על סוגים מסוימים של גידול, ולעתים קרובות מספקות סביבות מלאכותיות שאינן הדוק סביבות גידול לחקות in vivo.
סוגים שונים של גידולים במוח בילדים לגדול במקומות מאוד מיוחדים בתוך המוח [3, 4] וזה עשוי לשקף דרישות microenvironmental מובהקות לצמיחת גידול [5]. פרוטוקול זה מתאר מערכת רומן שבו תאים שקשה להפיץ בתנאי תרבות נורמלים ניתן לגדל במייקרו-סביבת מוח organotypic שמחקה בתנאי גידול vivo. בassay כמותי זה, שכותרתו fluorescentlyתאי גידול במוח הם מצופים בפרוסות organotypic מוח עכבר לנוער ומעקב לאורך זמן. assay זה יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של מייקרו-סביבה בגידול, ולבחון טיפולים תרופתיים חדשים במייקרו-סביבת מוח רלוונטי מבחינה קלינית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת אתיקה: ההליך הבא הכרוכים בנושאי בעלי חיים נעשתה בהתאם למכונים הלאומי לבריאות הנחיות ואושרו על ידי ועדת בעלי החיים הסרטן המוסדית דנה-פרבר הטיפול ושימוש. כל העבודה בבני אדם נסקרה על ידי ועדות דירקטוריון הסקירה המוסדית של ריגהם ובית החולים לנשים ודנה-פרבר מכון הסרטן, ועל ידי אוניברסיטת סטנפורד לשימוש מתאים, כי הסכמה מהדעת התקבלה מכל הנושאים בעת הצורך, והוויתור המתאים של דרישות הסכמה הושג ללימודי סיכון מינימאליים.
ציר זמן של Slice תרבות פרוטוקול:
איור 1. ציר זמן של פרוטוקול גידול במוח / Organotypic Slice Co-תרבות. נתון זה מתאר את ציר הזמן של הליך התרבות הפרוסה המקיף את כל שמונת הימים oF הניסוי והשלבים עיקריים של ההליך. ציר הזמן הוא ביחס ליום 0 כאשר התאים הם מצופים על הפרוסה על מנת להדגיש את החשיבות של מתחיל ימים לפני הליך תאי ציפוי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
1. Dissection מאגר
- הכן 15 מ"מ HEPES (1 מ '), 6.5mg / גלוקוז מיליליטר, 1.3 מ"מ MgSO4 (1 מ'), 20 מ"מ KCl (2 מ ') ופניצילין% 1 / סטרפטומיצין ב1x HBSS.
- התאם ל- pH 7.4 עם NaOH.
- מסנן ולאחסן ב -20 ° C.
2. פורסים תרבות מדיה
- הכן 2% B-27, 1% תוספת N2, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 1% Glutamax, ו -1.5 מ"ג / מיליליטר גלוקוז בNeurobasal-פנול מינוס בינוני אדום.
- מסנן ולאחסן ב -20 ° C. להפשיר לפי צורך, וזורקים לאחר שבוע 1 ב 4 מעלות צלזיוס.
הערה: ההליך הבא יכול להיעשות עד ביום ה לפני תחילת הניתוח. - 3% נקודת התכה נמוכה agarose
הערה: ההליך הבא יכול להיעשות עד יום אחד לפני תחילת הניתוח. - מערבבים נקודת התכה נמוכה 0.9 גרם agarose ל~ 31 מיליליטר של חיץ לנתיחה, מיקרוגל לשניות 25 עם כובע רופף. מיקרוגל עד נמס ולוודא את התערובת אינה עולה על גדותיו.
- שמור על 55-65 ° C עד צורך.
הערה: ההליך הבא יכול להיעשות עד יום אחד לפני תחילת הניתוח.
4. מעיל Slice תרבות התוספות עם Laminin
הערה: ההליך הבא יכול להיעשות עד יום אחד לפני תחילת הניתוח.
- בשכונת תרביות רקמה, באמצעות מלקחיים סטריליים, מקום להכניס תרבות הפרוסה אחת בכל טוב של 6-גם צלחת (להתאים את מספר פרוסות אתה מתכוון להשיג, סביב 12 ניתן לאסוף מהליך אחד. ההליך הבא נכתב עבור שש פרוסות). מלא לא חרוטי 15 מיליליטר Ube עם 1x PBS (800 μl / הוספה) ולהוסיף laminin (10 מיקרוגרם / מיליליטר).
- להוסיף 800 μl של תערובת laminin לחלק העליון של כל להכניס תרבות הפרוסה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עד צורך.
5. הכנה לניתוח
- מלא היטב בכל צלחת 6-היטב עם 1,200 μl של תקשורת בתרבות הפרוסה. מלא כל בארות שאינן בשימוש עם 1,200 μl PBS ולמלא את חלל מרכז הצלחת עם 5 מיליליטר 1x PBS. אחסן צלחת זה על 37 מעלות צלזיוס.
- לעקר כלים לנתיחה באתנול 70%. נגב vibratome להב עם אצטון כדי להסיר שמן ולעקר לפני השימוש.
- הנח שלוש 35 מ"מ 2 מנות וחמש 10 סנטימטרים 2 מנות בתרבית רקמה בשכונה. מלא צלחת 10 סנטימטר 2 אחד עם חיץ לנתיחה ומניחים על קרח.
שים לב: תהליך גורים אחד בכל פעם.
6. Dissection
שים לב: תהליך גורים אחד בכל פעם.
es / ftp_upload / 53304 / 53304fig2.jpg "/>
איור 2. חתכים Dissection. תמונות אלו מראות חתכי נתיחת הצורך להסיר את הגולגולת מהמוח של עכבר P6. קיצוצים מוצגים כקווים מנוקדים. () חותכים 1 מוצג. קיצוצי 1 ו -2 עשויים מגזע המוח / האחורי בילטרלי חיבור לארובת העין בכל צד .. (ב) חתכים 3 ו -4 מוצגים. לחתוך 3 עשויים מארובת העין אחד לחתכי חיבור האחרים Cut 1 ו -2 4 מתחיל בקו האמצע של קיצוץ 3 וממשיך לכיוון קצה האף חלוקת הגולגולת בין נורות חוש הריח (בר = 4.4 מ"מ Scale). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- להרדים את עכבר P6 באמצעות חשיפת isoflurane (isoflurane 100%). לאחר כ 5 דקות כאשר נשימה מואטת או אין כל סימן של נשימה, לערוף מהירותעכבר עם מספריים חדים. לרסס את הראש עם 70% אתנול ומניחים בצלחת תרבית רקמה.
- מלקחיים בוטים גדולים באמצעות להחזיק את הראש יציב על ידי גרירה האף. בעזרת מספריים לנתיחה בגודל בינוניים, להסיר את העור עודף לחשוף גולגולת.
- לבצע חתכים 1 ו -2 על ידי חיתוך הגולגולת דו-צדדי, מאחורי של הגולגולת לכיוון החזית בכל צד, המחבר את החתך לארובת העין. שמור את הקצה של המספריים הקרובים לגולגולת ככל האפשר כדי למנוע נזק לרקמות.
- לקיצוץ 3, להשתמש במספרי אביב קטנים להתחבר קיצוצי 1 ו -2 ואז להשתמש במלקחיים בוטים הקטנים לקלף בעדינות את הגולגולת.
- שימוש במספריים באביב הקטנים, בעדינות לחתוך את הגולגולת שנותרה לאורך קו האמצע על גבי, כך שהגולגולת שנותרה הופכת 2 חצאים (איור 2, חתך מס '4). שימוש במלקחיים לקלף את הגולגולת כדי לחשוף שתי נורות חוש הריח.
- הכנס מרית שטוחה פנים (טבולה במאגר לנתיחה, כך רקמה לא לדבוק בה) בין בottom של המוח ובסיס גולגולת, בעדינות להסיר את המוח ואת המקום לתוך הצלחת המכילה מאגר לנתיחה על קרח.
- חזור על שלב 6 להשגת מוח שני לחיתוך
7. Embedding המוח בAgarose
- מניחים שני של 35 מ"מ 2 מנות פתוחות על הקרח ולנגב את זוג מלקחיים בוטים גדולים עם 70% אתנול.
- יוצקים 3% agarose התכה נמוכה נקודה (מוכן בשלב 3) לשתי מנות עד צורות כיפה על ראש. להגדיר טיימר 3 דקות. ב 3 דקות (מבחן על ידי נגיעה בשולי הכיפה מלאה agarose, אם פילמור של agarose ניתן לצפות, זה מוכן) להרים מוח אחד עם מלקחיים ומקום בוטים לצד השני של צלחת 35 מ"מ מלא agarose, אז מהלך אותו למרכז הצלחת (זה מסיר חיץ נתיחה עודף סביב המוח ולכן mounts טוב יותר).
- חזור למוח 2 nd. התחל טיימר ל -10 דקות.
- לאחר 10 דקות, להכניס מרית שטוחה למרחב שביןagarose ומנה לקופצים החוצה agarose polymerized המכיל את מוח P6.
- השתמש בסכין גילוח שטוח לקצץ agarose לתוך קובייה סביב המוח, ולוודא כי הקצוות ישרים ככל האפשר.
- הנח דבק מגע על צלחת vibratome בשתי רצועות. לאחר מכן, להרים את מוח agarose רכוב ועדינות שחרר אותו על הדבק, ממוקם לפרוסות sagittal. לעשות את אותו הדבר למוח האחר. ודא שני המוחות הם נעמדו אחד עם השני.
- בואו דבק היבש ב RT במשך 5-8 דקות. במהלך תקופה זו, למלא את אזור בעל הקרח של vibratome עם קרח כתוש ומים.
8. פורס אותו בVibratome
- מניחים את מאגר החיתוך לאזור בעל קרח, נע על הכרטיסייה בצד הימין כדי לנעול אותו למקומו.
- באמצעות מברג הראש העגול, להרים את צלחת vibratome העגולה עם המוח מודבק עליו, ולהתאים אותו למאגר. הסר את מברג ולהבטיח את הצלחת במקום עם הנהג בורג ראש המשושה דואר. ודא הצלחת ומאגר החיתוך הם במקומו.
- שימוש במלקחיים, טנדר הלהב vibratome, להתאים אותו לראש החיתוך, מנעול במקום עם מברג משושה. לאחר מכן, לאבטח את ראש החיתוך עם הלהב המצורף על vibratome באמצעות הבורג העגול.
- להביא את עמדתו של התער לקרוב למוח-מוטבע agarose ככל האפשר, תוך הקפדת התער הוא באותו הגובה (או מעל) המוח. מלא קאמרי עם חיץ לנתח קר מספיק כדי לכסות את הלהב.
- לחץ ↕ הלחצן פעם אחת (אתה צריך לראות את זה למצמץ, לחצן זה מגדיר את הגבולות כאשר הלהב ילך הלוך ושוב), ואז ללחוץ ולהחזיק "קדימה" לחתוך באופן ידני את המוח המוטבע, שחרור עד לגילוח מנקה את בלוק agarose. לחץ מייד ↕ כפתור שוב, זה יהיה להגדיר את סוף הטווח לחיתוך אוטומטי.
- לחץ על הכפתור "Single / CONT" פעם אחת וlight ידי CONT צריך ללכת על. הגדר את עובי החיתוך ל400-450 מיקרומטר, רוטט בתדר 5.5-6 ל, ומהירות ל4. זה יהיה הגדרת זמירה.
- לחץ על הכפתור "התחל / stop" פעם אחת, וחיתוך אוטומטי צריך להתחיל. "שתיקה" לחץ כדי לאסוף רקמות באמצעות הכף עם חורים, בהתאם לצורך. זה צריך לקחת כ 5-10 דקות, כדי להגיע קרוב יותר לקו אמצע. בשלב זה, לחץ על "להשהות" ולשנות את המהירות עד 3 ולשנות את העובי 200 מיקרומטר. אל תאסוף את הפרוסה הראשונה שהופקה לאחר ביצוע שינוי זה.
- פרוסות הרצויות של 200 מיקרומטר עובי תהיה הנורה חוש הריח דרך המוח הקטן יפה מוגדרות. העבר את כל פרוסה רצויה כפי שהם חתוכים ל6-גם צלחות מלאות במאגר לנתיחה על קרח. עושה זאת על ידי הזזת החיץ בתא החיתוך סביב הרקמה לצוף פרוסה, לגעת בו מעט ככל האפשר, להרים אותו מתוך המאגר כאשר הוא ישר מעל הכף מחוררת. בדרך כלל סביב 12 פרוסות עם המבנים המבוקשים יכולות להיות שנאספו. ניתן להשאיר את הפרוסות בלנתח חיץ על קרח עד 20 דקות.
- בעוד פרוסות הן על קרח, להוציא את צלחת 6-היטב עם מוסיף שמצופה מlaminin 37 ° C חממה. בשכונה הנתיחה להשליך את טיפול לקיחת laminin לא לפגוע במוסיף. להוסיף 3.5 מיליליטר של תקשורת בתרבות הפרוסה לחלק העליון של כל הוספה. חלקיו העליונים של התקשורת יהווה כיפת צורה מבלי לשפוך החוצה אל הבארות.
9. ציפוי פרוסות על התוספות
- שימוש בכלי הכף מחוררת, מניח פרוסת מוח לתקשורת בכנס, בעדינות דוחף את הפרוסה להיות שקועה באופן מלא. חזור על פעולה עבור כל הפרוסות.
- להשתמש p1000 לצייר את 1 מיליליטר של תקשורת בתרבות פרוסה מהחלק העליון של ההוספה ומוציא אותו לתחתית הבאר. להסיר ולסלק תקשורת העודפת עד לקצוות של agarose סביב המוח slicebecome גלויים. האם זה עבור הפרוסות הנותרות.
- להרים tהוא הכניס על ידי השפה עם מלקחיים, הטיה ולהסיר תקשורת עודפת. לאחר מכן, להעביר במהירות את התוסף למנה 35 מ"מ 2 המכילה 1 מיליליטר של תקשורת בתרבות הפרוסה. השתמש 2 זוגות מלקחיים חדים כדי להסיר את agarose סביב הרקמה, נזהר שלא למתוח / פרוסת נזק או לתקוע חור בקרום (קל אם אתה עושה דמעה בקצה מאוד של agarose, אז לפרק את agarose מ כל אחד מהצדדים). לאחר מכן להעביר את הכנס חזרה לצלחת 6-היטב ולחזור לפרוסות שנותרו.
- בברדס בתרבית רקמה עם המפוח מ( כדי למנוע פרוסות מהתייבשות) להסיר שברי agarose מכל קרום.
- העבר את הפרוסות לצלחת 6-גם מוכנה בשלב 5.1 ולאחסן את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס. דגירה פרוסות 24-48 שעות.
10. שינוי Slice תרבות מדיה
- חזור על שלב 5.1 עם 6-גם צלחת טרי.
- בברדס בתרבית רקמה עם המפוח מ, להעביר מוסיף ל6-גם צלחות חדשות המשךaining תקשורת פרוסה טריות.
11. תאים סרטניים ציפוי על הפרוסה
- Sonicate צבע CM-DiI וספין במהירות בינונית במשך 2 דקות.
- ספין למטה תאי גידול בשימוש לכיסוי ב 201 XG במשך 5 דקות. אז resuspend ב 2 מיליליטר של תקשורת בתרבות הפרוסה.
- להוסיף 7 μl של CM-DiI ל2 מיליליטר של תאים ותקשורת ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- ספין למטה תאים ב 201 XG עבור 5min וגלול ב200 μl של תקשורת חותכת. Triturate בעדינות כדי לנתק את התאים (10-20 פעמים או עד גלולה היא נעלמה) ולאחר מכן להוסיף 800 μl חיתוך תקשורת לעשות 1,000 μl נפח כולל.
- ספירת תאים סרטני קיימא באמצעות Trypan כחול. להוסיף microspheres ניאון הירוק לתאים סרטניים, באותו הריכוז כמו תאים. microspheres אינרטי אלה ישמש כביקורת. ספין למטה תערובת התא / microsphere ב 201 XG דקות 5 ו resuspend בכמות רצויה של תקשורת ותרבות הפרוסה. תאי פלייט בצפיפות של 6,000 תאים / slקרח בנפח 65 μl. מספר התאים מצופים לכל פרוסה ניתן להגדיל בהתאם להעדפותיהם וזמינותם.
- בשכונה תרביות רקמת תאים לוותר בμl 65 של תקשורת / הפרוסה על המרכז של הפרוסה.
12. הדמיה ותיקון
הערה: Nikon Eclipse Ni C2si זקוף confocal שימש לקחת סריקת תמונה גדולה של כל פרוסה sagittal ב4X עם ערוצי ניאון אדומים וירוקים. אם תכונת סריקה אינה זמינה, לקחת ברצף תמונות מרובות על פני הפרוסה ולאחר מכן לתפור את התמונות ביחד בפוטושופ (באמצעות המיקום של microspheres והקצה של הפרוסה לניווט).
- למחרת (יום 1 הדמיה), להעביר לשש פרוסות 35 מ"מ 2 מנות עם תקשורת והתרבות פרוסה 1 מיליליטר. תמונה כל פרוסה אחת בכל פעם במיקרוסקופ הזקוף הניאון. קח סריקת תמונה גדולה של כל פרוסה sagittal ב4X עם ערוצי ניאון אדומים וירוקים. שמור לייזרורווח הגדרות זהה לכל פרוסה. בסופו של הדמיה, להעביר את כל הפרוסות בחזרה לצלחת 6-המכילה גם תקשורת פרוסה טריות.
- אם תוספת של EDU, סמן התפשטות אחר או מצב תרופה רצויה, ליצור מלאי של תקשורת פרוסה עם התרופה שתשמש לשינויי התקשורת יומית למצב הטיפול. מצב הטיפול צריך להיות הציג בצעד 12.1 (מייד לאחר ההדמיה יום 1). כל סמן EDU או התפשטות יש להוסיף לתקשורת גם מתחילה ב12.1 ורענון יומי (להשתמש בEDU 10 מיקרומטר).
- תמונה שוב ביום 7 באמצעות אותן ההגדרות כמו היום 1 תמונות.
- לאחר יום 7 הדמיה תושלם, לעבור כל פרוסה לצלחת 6-היטב עם כל 1.2 מיליליטר המכיל גם של Paraformaldehyde 4% (PFA). לאט ובזהירות שחרר 1 מיליליטר נוסף של PFA על גבי כל פרוסה. השאר ב RT עבור שעה 1.
- הסר PFA מכל טוב ומהחלק העליון של כל פרוסה. לשטוף היטב 3x כל עם PBS. אחסן את הפרוסות בPBS ב4 ° C למכתים או הרכבה בשקופיות.
הערה: הגדרות ImageJ ייתכן שתצטרכנה להיות מותאמות ומותאמת לדין וחשבון על תמונה ואיכות מיקרוסקופ, כמו גם גודל תאים סרטניים.
13. כימות תמונות (באמצעות ImageJ)
הערה: הגדרות ImageJ ייתכן שתצטרכנה להיות מותאמות ומותאמת לדין וחשבון על תמונה ואיכות מיקרוסקופ, כמו גם גודל תאים סרטניים.
- ב ImageJ, להשתמש בכלי המצולע להתוות את כל פרוסה או האזור שאתה רוצה לכמת. להוסיף בחירה זו למנהל את ההחזר על ההשקעה שבו אתה יכול לשנות את זה ולשמור אותו.
- לחץ לחיצה ימנית על האזור הנבחר ולבחור לשכפל. תן שם לתמונה כפולה הזה עם האזור, פרוסה, היום. לחץ על Shift + CTL + E כדי להראות את קווי המתאר, ואז תהליך בחירה - לחסר רקע - גלגול כדור רדיוס = 4.
- לאחר חיסור רקע, בחר "להתאים סף" בתפריט "התמונה" הנפתח. בדוק רקע כהה -; מסתכל על התמונה המוגדלת ובלקבוע את הסף. כפי שאתה מגדיר את הסף על ידי הזזת סרגל הסף, להבטיח את כל התאים כלולים / מודגשים אבל נקודות קטנות מאוד, כי הם פסולת (או קטנה יותר מתא) אינה כלולות. השתמש באותו סף לכל התמונות. הזז את חלון הסף לצד.
- בחר "תהליך" - "מצא את המקסימה" ולהגדיר את סובלנות הרעש בין 5 ל 10 ובדוק את הדברים הבאים: בחירת נקודה מקדימה, סוג פלט חלקיקים מפולחים, להוציא מקסימום קצה, מעל לסף נמוך יותר. אז לבחור מחדש את האזור של עניין על ידי לחיצה על Shift + CTL + E.
- בחר "נתח חלקיקים" מניתוח התפריט הנפתח. הגדר את גודל פיקסל ל4-40 ומעגלי ל.00-1.00. גם לחץ על "קווי המתאר תכנית כיסוי" "תוצאות תצוגה" ו- "לסכם", ולאחר מכן לחץ על OK.
- להקליט את כל הנתונים גולמיים והסיכום במסמך של Microsoft Office. "רוזן" לכל i אזורשעות דרושות כדי לחשב שינוי הקיפול במהלך השבוע בתרבות.
- חזור על תהליך זה עבור כל התמונות ותחומי העניין, ולוודא כי הסף והגדרות אחרות יישארו עקביים.
- לחשב את השינוי במספר תאי קיפול על הפרוסה במהלך השבוע בתרבות על ידי חלוקת מספר התאים סרטניים על הפרוסה ביום 7 במספר התאים על הפרוסה ביום 1. כמו כן, לקפל שינוי במספר תאים בכל אזור מחושב על ידי חלוקת מספר התאים באזור זה ביום 7 במספר התאים באזור זה ביום 1.
- בצע צעד 13.8 לmicrospheres גם כן. מספר microsphere על הפרוסה צריך להיות זהה ביום 7 כמו ביום 1 (מקפלים שינוי = 1). כמו כן, מספר microsphere בתוך כל אזור צריך להיות זהה ביום 7 כמו ביום 1 (מקפלים שינוי = 1). אם שינוי פולד שונה מ1, זה מצביע על שינויים בטופוגרפיה פרוסה לאורך זמן.
14. מכתים
- קלטת פיסת parafilm על הספסל דואר מעבדה ולצייר שישה עיגולים עם עט נוזלי פאפ החוסם (אחד לכל פרוסה, רק גדול יותר מהגודל של הפרוסה). הנח μl -400 של PBS בנקודה באמצע כל עיגול. מספר או תווית החוגים לזהות כל פרוסה.
- ב 1 מיליליטר של PBS, להשתמש בסכין גילוח לחתוך ריבוע סביב פרוסה, והותיר חלק מהשטח של קרום סביב הפרוסה. בעזרת מלקחיים להעביר את הפרוסה לגזור למעגל הראשון ובזהירות להניח את הפרוסה על גבי הבועה של PBS. זה חיוני כדי לוודא שהפרוסה לא לקפל מעל בעצמו או לקבל התהפך במהופך במהלך תהליך זה. לאחר מכן, להסיר את PBS מתחת לפרוסה ולשים אותו על גבי הפרוסה ולהוסיף עוד PBS במידת הצורך כדי לוודא שהוא נשאר שקוע. חזור על שלב זה עבור כל פרוסה.
- לעשות 10 מיליליטר של BSA 3% ב- PBS. קח את 2 מיליליטר, ולהוסיף 100 של digitonin μl לזה. לערבב ולהוסיף לפרוסות לחסום וpermeabilize, 30 דקות ב RT.
הערה: שימוש בסוכני permeabilization אחרים כגון Triטון X-100 יגרמו לאובדן של תיוג CM-DiI. - הסר permeabilization / פתרון חסימה ולשטוף 3x עם PBS במשך 10 דקות.
- אם מכתים לEDU, בצע את ההוראות הניתנות על ידי הערכה להרכיב את התערובת. החלת את התערובת במשך 45 דקות. אם צביעה עם נוגדנים אחרים, הפרוטוקול חייב להיות מותאם לריכוז של נוגדנים ראשוניים ומשניים (~ RT שעה 1 לראשי ומשניים). לשטוף 3x עם PBS במשך 10 דקות.
- כתם עם 1 DAPI: 1,000 ב PBS במשך 5 דקות RT. יש לשטוף 2x עם PBS.
15. הרכבה Slices
- להעביר את הפרוסה לשקופית מיקרוסקופ. ודא שהצד של הקרום עם הפרוסה נשאר פונה כלפי מעלה, ולא לקפל מעל בעצמו. צייר גבול מסביב לפרוסה עם עט פאפ החוסם נוזלי.
- מניחים coverslip זכוכית קטן (5 מ"מ) בכל צד של הפרוסה (כדי לשמור על פרוסה מפני ניזק). זרוק שתיים או שלוש טיפות של Fluoromount-G (לimmunofluorescence) על גביהפרוסה רק בקושי לכסות אותו. ואז לכסות את coverslip פרוסה הארוך (24 x 50 מ"מ).
- חזור על פעולה עבור כל פרוסה. לאטום את הקצוות של שקופיות עם לק ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. האם הדמיה confocal של מכתים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סעיף זה מדגים את סוג התוצאות צפוי מניצול הגידול במוח / שיתוף התרבות הפרוסה organotypic לחקור העדפת מייקרו-סביבה אזורית, כמו גם לבחון טיפולים חדשים. אנו מראים כי assay נועד לשכפל את המיקרו-הסביבה לגידולים במוח, כארגון רקמות ומדינת שגשוג של הפרוסה נשמר (איור 3). אנחנו גם מדגימים כי עלייה במספר של תאים סרטניים על הפרוסה לאורך הזמן עשויה להיות באופן חלקי בשל ההגירה של תאים על גבי מייקרו-סביבת פרוסת המוח (איור 4). יש לנו גם הראה כי שיתוף תרבות זו יכולה לשמש כassay כמותית על ידי חישוב השינוי במספר תאי הקיפול במהלך השבוע בתרבות לאזורים ספציפיים של הפרוסה, או לכל פרוסת המוח (איור 6) תוצאות ראשוניות ממספר רב של סוגי תאי גידול הראו כי מספר תאי גידול ניתן לכמת על ידי ההדמיה confocal שלפרוסה 200 מיקרומטר העבה בשל העובדה כי התאים נודדים רק לעומק של 20-50 מיקרומטר לפרוסה.
מצאנו כי microspheres ניאון הירוק הוא שליטה אפקטיבית לשינויים בטופוגרפיה הפרוסה כי הם לא מראים תנועה או שינוי במספר בכל הזמן בתרבות (איור 5). לאחר תיקון התרבות המשותפת, מכתים ניתן לעשות כדי לבדוק תאים סרטניים במייקרו-סביבת מוח וההשפעות של תרופות על התפשטות תאים סרטניים, מוות של תאים, או שינויים בביטוי חלבון (איור 7). אנחנו הוכחנו שassay זה יכול לשמש כדי לבדוק טיפולים תרופתיים באמצעות השוואה של תאי מדולובלסטומה עכבר שטופלו בLDE225 אנטגוניסט SMO (החליק) (Sonidegib) או עם שליטה ברכב. מקפלים עלייה במספר תאים על הפרוסה על פני שבוע אחד בתרבות היה לכמת ומיוצג בצורה גרפית (מספר תאים ביום מספר 7 / תא ביום 1) נתונים אלה מצביעים על כך שLDE225 מאוד דהמספר קמטי גידול תא בהשוואה לשליטה 6. השפעה זו ניתן לראות גם בתמונות הנציג כלול (איור 8). אנחנו גם להציג תמונות של תאי מדולובלסטומה אדם גדלו בassay התרבות הפרוסה (איור 9).
איור 3. גידול במוח / Organotypic Slice משותף תרבות Assay עיצוב. () פרוסת מוח sagittal Organotypic מעכבר P6 ממוקם ישירות על קרום חצי נקבובי ובינוני מתווסף לתחתית צלחת התרבות. התרבות היא שקועה במדיום בצד אחד ונגיש לחמצן מהצד השני. תאים סרטניים שכותרתו הם כיסו על מספר פרוסה ותא ניתן בעקבות לאורך זמן. (ב) בתרבות, הפרוסה שומרת ארגון רקמה שדומה מאוד זה שנצפה בvivo. Preservation של מייקרו-סביבת המוח בא לידי הביטוי בתיוג edu של מבשרי נוירון גרגיר שגשוג בשכבה החיצונית גרגיר (EGL) של המוח הקטן בתוך התרבות הפרוסה. בתרבות הפרוסה, תאים אלה מבשרים לשלב אנלוגי תימידין edu, כפי שניתן היה לצפות בvivo בשלב זה התפתחותית (P6) (חץ לבן מציין EGL). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. תאי אסטרוציטומה האדם בגידול במוח / Organotypic Slice משותף התרבות Assay. עלייה בתאי גידול במוח אנושי על הפרוסה עשויה לשקף relocalization של תאים סרטניים מהקרום לתרבות הפרוסה. () אזור על קצה פרוסה ביום 1 (למעלה) ויום 7 (למטה) שבו תאים עשויים מ ' igrate מן הקרום על גבי פרוסת המוח. (ב) דוגמא שנייה של נדידת תאים אפשרית על המוח בקצה של הפרוסה. יום 1 (למעלה) ויום 7 (תחתון). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. בקרת חרוזים Microsphere. יום 1 (אדום) ויום 7 תמונות שליטה (ירוקה) של microspheres הניאון הם כיסו (צהובים) כדי לחשוף שום תנועה של microspheres יותר משבוע בתרבות. יום 1 ויום 7 תמונות צולמו באותו המיקום בתוך פרוסה (בר = 45 מיקרומטר Scale). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. כימות בImageJ. (א) התמונה של הפרוסה נפתחה בImageJ וכל פרוסה ו / או אזורים מפורטים לכימות. (ב) באזור של העניין נבחר ותמונה כפולה הוא עשתה. (C ) הקרינה הרקע מופחת מהתמונה. (ד) הסף מוגדר לגודל תא וצורה, הקביעה מה ייחשב. (E) לנתח חלקיקים לספור את מספר התאים בתוך האזור של עניין. שינוי קיפול במספר תא אז יכול להיות מחושב על ידי חלוקת מספר התאים ביום 7 במספר התאים ביום 1 לכל אזור של עניין או כל השטח של הפרוסה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .
ogether.within עמודים = "תמיד"> 
איור 7. מכתים למניעת הפצת נשק. תמונה מדגימה כיצד צביעה (לאחר תיקון הפרוסה בPFA) יכולה להיעשות בהצלחה על הפרוסה אחרי שבוע אחד בתרבות. תמונה מראה כתמי DAPInuclear (כחול), תאי מדולובלסטומה העכבר שכותרתו fluorescently אדומים, ותיוג ירוק לשילוב של אנלוגי תימידין לתוך ה- DNA כסמן לשגשוג. EDU נכלל בתקשורת התרבות הפרוסה (10 מיקרומטר) למשך שבוע (חיצים לבנים מצביעים על תאים חיוביים לEDU וחצים צהובים מצביעים על תאים שליליים לEDU) (בר = 50 מיקרומטר Scale). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.
איור 8. Medulloblas העכבר תאי תומא מטופלים עם LDE225. נתון זה מדגים טיפול תרופתי של תאים סרטניים במערכת assay הכיסוי הפרוסה. (א) ייצוג גרפי של נתונים שנאספו מניסוי מדולובלסטומה עכבר. DMSO היה מצב השליטה (CTL) וLDE225 (Sonidegib) (1 מיקרומטר) (LDE) היה מצב הטיפול. מקפלים עלייה במספר תאים על הפרוסה על פני שבוע אחד בתרבות היה לכמת (מספר תא ב -7 במספר / תא היום ביום 1), (n = 12 = CTL, n = 13 LDE, ברים שגיאת SEM) נציג. (ב) תמונות של פרוסות טופלו שליטה ברכב ביום 1 (למעלה) ויום 7 (תחתון). (ג) נציג תמונות של LDE טופלו פרוסות ביום 1 (למעלה) ויום 7 (תחתון). תמונות צולמו בהגדלה 4X. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
9 "src =" / קבצים / ftp_upload / 53304 / 53304fig9.jpg "/>
איור 9. תאי מדולובלסטומה האדם בגידול במוח / Organotypic Slice Co-התרבות. תאי מדולובלסטומה אנושיים התקבלו מג'יימס מ אולסון באוניברסיטת וושינגטון, וגדלו במשך שבוע אחד בassay התרבות הפרוסה. יום (א) תמונה 1 של תאים אנושיים מדולובלסטומה גדלו על פרוסת מוח עכבר. (ב) תמונה של אותו פרוסת מוח עכבר עם תאי מדולובלסטומה אדם אחרי שבוע אחד בתרבות (יום 7). תמונות צולמו בהגדלה 4X. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר כיצד יכול להיות מתויג תאי גידול במוח fluorescently ומצופים בסעיף מוח sagittal של עכבר P6 ולאחר מכן במעקב במשך שבוע אחד בתרבות. גידול במוח / assay שיתוף התרבות הפרוסה organotypic זה יכול לשמש כדי לקבוע את ההשפעה של מייקרו-סביבה האזורית על מספר תאים סרטניים ועשוי לשמש גם כמערכת למדידת היעילות של טיפולים תרופתיים חדשים על גידול אנושי. מחקרים קודמים השתמשו באסטרטגיה דומה ללהעריך את התפקיד של מיקרו-סביבת מוח על 7,8 התפשטות מבשר עצבית.
assay זה שבו תאי גידול במוח הם זורעים בתרבות הפרוסה organotypic 9 מספק מערכת לגידול תאים סרטניים במוח אנושיים שקשה להפיץ בתנאי תרבית תאים נורמלים. היבט קריטי אחד של הליך זה הוא את החשיבות של שמירה על הבריאות של הפרוסה והתאים הסרטניים. משך זמן שהפרוסות לשבת במאגר בדissection ועל RT במהלך הדמיה צריכה להיות מוגבל, על מנת להבטיח כי את הפרוסות והתאים נשארים בריאים ככל האפשר. אם תאי גידול במוח אנושיים עיקריים נמצאים בשימוש בassay זה, צריכים להיות מצופה התאים על פרוסות בהקדם האפשרי לאחר ביופסיה. לכן צריכים להיות מוכנות פרוסות לפני הניתוח. כדי למנוע כל השפעת ההפרש של זמן הדמיה בין פרוסות, את משך הזמן שבילה מחוץ לחממה צריכה להיות קצר ועקביים לכל התרבויות הפרוסה בניסוי. בקרות microsphere חשובות כפי שהם מספקים סימנים מרחבית עקביים לאורך זמן. בנוסף, עיוותים בתרבות הפרוסה בשל הצטמקות, קריעה, או מתקפל ניכרות בקלות על ידי הדמיה חרוזים microsphere.
אחת המגבלות של פרוטוקול זה הוא שיכול להיות מופץ התאים רק במערכת התרבות הפרוסה זה כשבוע. עם זאת, עבור סוגים מסוימים של גידולים במוח זה הוא שיפור משמעותי לעומת המצב הנוכחי oענייני F. מגבלה שנייה היא שהדם-המוח-המחסום מסולק, שהוא שיקול חשוב בהערכת תרופות שעשויות לשמש לטיפול בגידולים במוח. שיקול שלישי הוא שזה assay תפוקה נמוך שלא ניתן להשתמש בם לבדיקת ספרייה של תרכובות.
assay זה הוא תכליתי ולשנות בקלות ללמוד סוגים שונים של תאים סרטניים ועוד מגוון של שאלות חוקרת. פרוטוקול זה יכול לשמש כassay כמותי לבחון את ההשפעות של טיפולים חדשניים בהישרדות תאי גידול וצמיחה (תקשורת אישית שמש et al.,). השוואה של השינוי במספר של פי תאים סרטניים באזורים שונים של המוח מספקת שיטה לפענוח ההשפעות של מייקרו-סביבה על גידול.
גידול במוח / מערכת שיתוף תרבות זו organotypic הפרוסה מספקת גם את האפשרות לחקור את הקשר בין תאי גידול במוח ומייקרו-סביבות מסוימות במוח. מאסוגי ניו יורק של גידולים במוח להראות דפוס מובהק של פיתוח באזורים ספציפיים במוח ומייקרו-סביבות 3,4. על ידי גידול תאים סרטניים אנושיים שכותרתו על פרוסת מוח עכבר sagittal, ניתן לנטר תאים להעדפה אזורית אשר עשוי להיות בקנה אחד עם אזור vivo של צמיחה. בדיקה נוספת של מייקרו-הסביבה שהתאים הסרטניים מעדיפים עלולה להוביל לזיהוי של גורמים פוטנציאליים התומכים בצמיחת תאים סרטניים. assay זה עשוי לסייע בשיפור בתנאי תרבית תאים במבחנה ועשוי גם לספק מערכת ללמוד איך ייזום גידול ניתן למנוע או לטפל בצורה יעילה יותר.
ישנם סוגים מסוימים של גידולים במוח שלא יכול להיות מופצת בתנאי תרבית תאים נורמלים או על ידי עכבר orthotopic או xenografts תת עורי. עבור אלו סוגי גידולים שקשה לבדוק טיפולים תרופתיים חדשים על תאים סרטניים אנושיים. פרוטוקול זה מוכיח כי ניתן לגדל תאי גידול במוח אנושיים בפרוסהassay התרבות וטיפולים תרופתיים ניתן להעריך כמותית. טיפול תרופתי הבא, שיתוף צביעת התאים הסרטניים יכול לספק הערכה נוספת של ההשפעה של התרופה על התפשטות תאי גידול ועיכוב מסלול. מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי ייתכן שיש הבדל דרסטי בין השפעת תרופות על תאי סרטן בתרבית תאי monolayer נורמלי לעומת סביבת תרבית תאים הטרוגנית 3D 10. תאים דומה למבוגרים נורמלים וסרטניים אפיתל, שיש תוחלת חיים קצרות במבחנה, הוכחו לתכנת מחדש על תנאי לשגשוג מדינה כאשר גדלו בתאים מזינים פיברובלסטים בשילוב עם kinase מעכבי Rho 11. מחקרים אלה תומכים עוד יותר את החשיבות של שמירה על תאים סרטניים בorganotypic, 3D, מייקרו-סביבה רלוונטית מבחינה קלינית, ואת הרלוונטיות של מערכת תרבית תאים זה לחקר הסרטן הנוכחי. לכן, זה assay ערך לבדיקת תרופות על תאים סרטניים אנושיים בrelevan קליניאופן לא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Invitrogen | 17504044 | |
| Glucose | Invitrogen | 17502048 | |
| Pennicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Neurobasal-A- Medium minus phenol red | Invitrogen | 12349015 | |
| Low Melting Point Agarose | Promega | V2111 | |
| Slice Culture Inserts | Milipore | PICM0RG50 | |
| laminin | Invitrogen | 23017015 | |
| Cm-DiI | Invitrogen | V22888 | |
| EDU (Labeling and Detection) | Life Technologies | c10337 | |
| Microspheres | Life Technologies | F-21010 | |
| Vibratome | Leica | ||
| Confocal Microscope | Nikon Eclipse Ni C2si | ||
| ImageJ software | |||
| 5 mm Cover Glasses | Fisher Scientific | 64-0700 (CS-5R) |
References
- Heddleston, J. M., et al. Glioma stem cell maintenance: the role of the microenvironment. Curr Pharm Des. 17 (23), 2386-2401 (2013).
- Sasai, K. Shh pathway activity is down-regulated in cultured medulloblastoma cells: implications for preclinical studies. Cancer Res. 66 (8), 4215-4222 (2006).
- Louis, D. N., et al. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system. Acta Neuropathol. 114 (2), 97-109 (2007).
- Duffau, H., Capelle, L. Preferential brain locations of low-grade gliomas. Cancer. 100 (12), 2622-2626 (2004).
- Chourmouzi, D., et al. Manifestations of pilocytic astrocytoma: a pictorial review. Insights Imaging. 5 (3), 387-402 (2014).
- Buonamici, S., et al. Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma. Sci Transl Med. 2 (51), 51ra70 (2010).
- Choi, Y., Borghesani, P. R., Chan, J. A., Segal, R. A. Migration from a mitogenic niche promotes cell-cycle exit. J Neurosci. 25 (45), 10437-10445 (2005).
- Chan, J. A., et al. Proteoglycan interactions with Sonic Hedgehog specify mitogenic responses. Nat Neurosci. 12 (4), 409-417 (2009).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three- dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nat Commun. 6, 6220 (2015).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
