Introduction
Recenti ricerche cancro ha fatto progressi significativi nell'identificazione mutazioni genetiche, modifiche molecolari e possibili trattamenti per una varietà di tumori cerebrali. Nonostante questi progressi, tumori cerebrali rimangono una delle principali cause di mortalità cancro-correlata per adulti e bambini. Fattori limitanti nella ricerca tumore cerebrale includono la disponibilità limitata di campioni primarie e linee cellulari e la difficoltà di replicare microambiente cerebrale unico ed eterogenei in sistemi sperimentali accessibili. Per molti tumori cerebrali le condizioni necessarie per mantenere le cellule tumorali nel tempo non sono ancora noti. Anche per i tumori cerebrali che possono essere coltivate in sospensione cellulare come neurosfere, condizioni di coltura possono influenzare le cellule tumorali 1,2. Infatti, l'aggiunta di fattore di crescita basico dei fibroblasti o fattore di crescita epidermico incoraggiare la proliferazione e differenziazione inibiscono possono alterare l'espressione genica 1. Altri metodi per la crescita delle cellule tumorali, qualicome propagazione del tumore nei topi mediante xenotrapianto ortotopico o sottocutanea di cellule tumorali sono saggi preziosi, ma sono limitati da fattori come il tempo di sviluppo di tumori (in particolare per i tumori di basso grado), il costo e il numero di cellule tumorali che può essere iniettato e studiata . Così i metodi attuali per la coltivazione di cellule tumorali del cervello umani sono inadeguati per il mantenimento di alcuni tipi di tumore, e spesso forniscono ambienti artificiali che non lo fanno da vicino gli ambienti tumorali imitare in vivo.
Diversi tipi di tumori cerebrali pediatrici crescono in luoghi altamente specializzate all'interno del cervello [3, 4] e questo riflette probabilmente requisiti microambientali distinti per la crescita del tumore [5]. Questo protocollo descrive un nuovo sistema in cui le cellule che sono difficili da diffondere nelle normali condizioni di coltura può essere coltivata in un microambiente del cervello organotipica che imita in condizioni di crescita tumorale in vivo. In questo saggio quantitativo, fluorescentele cellule tumorali del cervello sono placcati su minorenni fettine organotipiche cervello di topo e monitorati nel tempo. Questo test può essere utilizzato per indagare l'effetto del microambiente sulla crescita tumorale, e di testare nuove terapie farmacologiche in un microambiente cerebrale clinicamente rilevante.
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Protocol
Etica Dichiarazione: La seguente procedura che coinvolge soggetti animali sono stati fatti in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute e sono stati approvati dal Cancer istituzionale cura e l'uso degli animali Comitato Dana-Farber. Tutti i soggetti umani lavoro è stata valutata da i Institutional Review Comitati del Brigham and Women Hospital e Dana-Farber Cancer Institute, e di Stanford per un uso appropriato, che il consenso informato è stato ottenuto da tutti i soggetti quando necessario e le opportune misure rinuncia obblighi previsti è stato ottenuto per gli studi il minimo rischio.
Timeline di Fetta Cultura Protocollo:
Figura 1. Cronologia della Brain Tumor / organotipica fetta Co-coltura protocollo. Questa cifra rappresenta la linea temporale della procedura di coltura fetta che comprende tutti gli otto giorni of dell'esperimento e principali fasi del procedimento. La timeline è relativo al Giorno 0 quando le cellule sono placcati sulla fetta al fine di evidenziare l'importanza di iniziare le giornate di procedura prima della placcatura cellule. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
1. Dissection Buffer
- Preparare 15 HEPES mM (1 M), 6.5mg / ml di glucosio, MgSO4 mM 1.3 (1 M), 20 mM KCl (2 M) e 1% di penicillina / streptomicina in 1x HBSS.
- Regolare il pH a 7,4 con NaOH.
- Filtro e conservare a -20 ° C.
2. Fetta di coltura
- Preparare 2% B-27, 1% supplemento N2, 1% di penicillina / streptomicina, 1% Glutamax, e 1,5 mg / ml glucosio in Neurobasal-A fenolo medio meno rossa.
- Filtro e conservare a -20 ° C. Scongelare, se necessario, e gettare dopo 1 settimana a 4 ° C.
Nota: La seguente procedura può essere eseguita fino a sullae giorno prima di iniziare la dissezione. - 3% a basso punto di fusione agarosio
Nota: La seguente procedura può essere eseguita fino a un giorno prima di iniziare la dissezione. - Miscelare 0,9 g basso punto di fusione agarosio in ~ 31 ml di tampone dissezione, forno a microonde per 25 secondi con tappo allentato. Forno a microonde fino a fuso e assicurarsi che la miscela non trabocchi.
- Conservare a 55-65 ° C fino al momento dell'uso.
Nota: La seguente procedura può essere eseguita fino a un giorno prima di iniziare la dissezione.
4. Rivestire la Fetta Cultura inserti con Laminina
Nota: La seguente procedura può essere eseguita fino a un giorno prima di iniziare la dissezione.
- In una cappa coltura di tessuti, con pinza sterile, posizionare una fetta inserto cultura in ogni pozzetto di un 6-pozzetti (corrisponde al numero di fette che si intende ottenere, circa 12 possono essere raccolti da una procedura. La procedura che segue è stato scritto per sei fette). Riempire un 15 ml conica t ube con PBS 1x (800 ml / inserimento) e aggiungere laminina (10 mg / ml).
- Aggiungere 800 microlitri della miscela laminina all'inizio ciascun inserto culture fetta. Incubare a 37 ° C fino al momento dell'uso.
5. Preparazione per dissezione
- Riempire ogni pozzetto di un 6-pozzetti con 1.200 ml di cultura fetta dei media. Riempire i pozzetti non utilizzati con 1.200 l di PBS e riempire lo spazio centro del piatto con 5 ml di PBS 1X. Conservare questa piastra a 37 ° C.
- Sterilizzare strumenti di dissezione in etanolo al 70%. Pulire vibratome lama con acetone per rimuovere l'olio e sterilizzare prima dell'uso.
- Inserire tre 35 millimetri 2 piatti e cinque 10 centimetri 2 piatti di coltura tissutale nella cappa. Riempire un piatto 10 centimetri 2 con tampone dissezione e posto sul ghiaccio.
Nota: Processo cucciolo uno alla volta.
6. Dissection
Nota: Processo cucciolo uno alla volta.
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Figura 2. Tagli dissezione. Queste immagini mostrano i tagli dissezione necessari per rimuovere il cranio dal cervello di un topo P6. I tagli sono mostrati come linee tratteggiate. (A) Cut 1 è indicata. Tagli 1 e 2 sono costituiti dal tronco / posteriore bilateralmente collegamento alla presa occhio su ciascun lato .. (B) taglia 3 e 4 sono mostrati. Cut 3 è costituito da una presa occhio agli altri tagli di collegamento 1 e 2. Tagliare 4 inizia sulla linea mediana di taglio 3 e prosegue verso la punta del naso che divide il cranio tra i bulbi olfattivi (Scala bar = 4,4 millimetri). Si prega di clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Anestetizzare il mouse P6 con esposizione isoflurano (100% isoflurano). Dopo circa 5 minuti Quando la respirazione è rallentata o non vi è alcun segno di respirazione, decapitarlo rapidamente ilmouse con forbici affilate. Spruzzare la testa con il 70% di etanolo e posto in un piatto di coltura di tessuti.
- Utilizzo di grandi pinze smussato tenere testa ferma afferrando il naso. Utilizzando le forbici dissezione di medie dimensioni, rimuovere l'eccesso di pelle per rivelare cranio.
- Effettuare tagli 1 e 2 tagliando cranio bilateralmente, dal posteriore del cranio verso la parte anteriore per lato, che collega il taglio alla cavità oculare. Mantenere la punta delle forbici il più vicino al cranio possibile per evitare danni ai tessuti.
- Per il taglio 3, l'uso di piccole forbici a molla per collegare i tagli 1 e 2. Quindi utilizzare i piccoli forcipe smussato a buccia delicatamente il cranio.
- Utilizzando piccole forbici primavera, delicatamente tagliare il cranio rimanente lungo la linea mediana sopra, tale che il cranio rimanente diventa 2 metà (Figura 2, tagliare # 4). Uso pinze staccare il cranio per rivelare i due bulbi olfattivi.
- Inserire una spatola piatta faccia (inumidito con tampone dissezione, quindi il tessuto non si attacca ad esso) tra bottom del cervello e base del cranio, togliere delicatamente il cervello e mettere nel piatto contenente tampone dissezione sul ghiaccio.
- Ripetere il passaggio 6 per ottenere un secondo cervello per affettare
7. Incorporare i cervelli in Agarose
- Mettere due dei 35 mm 2 piatti aperte sul ghiaccio e pulire un paio di grandi pinze smussato con il 70% di etanolo.
- Versare 3% a basso punto di fusione agarosio (preparata al punto 3) nei due piatti fino a quando si forma una cupola in cima. Impostare il timer per 3 min. A 3 minuti (prova toccando il bordo della cupola agarosio pieno, se si osserva la polimerizzazione di agarosio, è pronto) prendere un cervello con una pinza smussato e posto sul fianco di una piastra da 35 mm agarosio pieno, quindi mossa al centro del piatto (questo rimuove tampone dissezione eccesso intorno al cervello quindi monta meglio).
- Ripetere l'operazione per il cervello 2 °. Avviare un timer per 10 minuti.
- Dopo 10 min, inserire una spatola piatta nello spazio traagarosio e piatto al pop fuori l'agarosio polimerizzato contenente il cervello P6.
- Utilizzare una lama di rasoio per tagliare la piatta agarosio in un cubo intorno al cervello, assicurandosi che i bordi sono più diritta possibile.
- Posizionare supercolla sul piatto vibratome in due strisce. Poi, prendere il cervello agarosio montata e delicatamente cadere giù sopra la colla, posizionato per fette sagittali. Fare lo stesso per l'altro cervello. Assicurarsi che entrambi i cervelli sono allineati tra loro.
- Lasciate asciugare la colla a temperatura ambiente per 5-8 minuti. Durante questo tempo, riempire l'area titolare ghiaccio vibratome con ghiaccio tritato e acqua.
8. Affettare con il Vibratome
- Posizionare il serbatoio di taglio nella zona titolare ghiaccio, spostando la linguetta verso destra per bloccarlo in posizione.
- Utilizzando il cacciavite a testa circolare, sollevare il piatto vibratome circolare con i cervelli incollati su di esso, e inserirlo nel serbatoio. Rimuovere il cacciavite e fissare la piastra in posizione con The cacciavite a testa esagonale. Assicurarsi che la piastra e il serbatoio di taglio sono saldamente in posizione.
- Uso pinze, pick-up la lama vibratome, inserirla nella testa di taglio, di blocco in posizione con un cacciavite esagonale. Quindi, fissare la testa di taglio con la lama attaccata sul vibratome con la vite turno.
- Portare la posizione del rasoio per il più vicino al cervello agarosio-embedded possibili, assicurandosi il rasoio è alla stessa altezza (o appena sopra) il cervello. Riempire camera con abbastanza tampone dissezione a freddo per coprire la lama.
- Premere il pulsante una volta ↕ (si dovrebbe vedere lampeggiare, questo pulsante definisce i confini quando la lama andrà avanti e indietro), quindi premere e tenere premuto "Avanti" per tagliare manualmente il cervello incorporato, stampa fino a quando il rasoio cancella il blocco di agarosio. Premere immediatamente ↕ tasto di nuovo, questa definirà la fine della gamma per il taglio automatico.
- Premere il pulsante "SINGLE / CONT" una volta e il light da CONT dovrebbe andare avanti. Impostare lo spessore di taglio di 400-450 micron, vibranti di frequenza a 5,5-6, e la velocità a 4. Questa sarà l'impostazione di ritaglio.
- Premere il tasto "start / stop" una volta, e il taglio automatico dovrebbe iniziare. Premere il tasto "pausa" per raccogliere il tessuto con il cucchiaio con fori, a seconda delle necessità. Si dovrebbero prendere circa 5-10 minuti, per arrivare più vicino alla linea mediana. A questo punto, premere il tasto "pausa" e cambiare la velocità a 3 e cambiare lo spessore di 200 micron. Non raccogliere la prima fetta prodotto dopo aver effettuato questa modifica.
- Le fette desiderati di 200 micron di spessore avranno il bulbo olfattivo attraverso il cervelletto ben definito. Trasferire ogni fetta desiderata in quanto sono tagliati in 6 pozzetti riempiti con tampone dissezione su ghiaccio. Fare questo spostando il tampone nella camera di affettatura intorno al tessuto di galleggiare la fetta, toccarlo il meno possibile, sollevarlo dal buffer quando è esattamente il schiumarola. In genere circa 12 fette con le strutture desiderati possono essere raccolti. Le fette possono essere lasciati in dissezione tampone su ghiaccio fino a 20 min.
- Mentre fette sono sul ghiaccio, togliere 6 pozzetti con inserti di essere rivestiti con laminina da 37 ° C incubatore. Nel cofano dissezione scartare la laminina facendo attenzione a non danneggiare gli inserti. Aggiungere 3,5 ml di coltura fetta all'inizio di ogni inserto. La parte superiore del supporto formerà una forma a cupola senza fuoriuscita nei pozzetti.
9. placcatura le fette sui Inserti
- Utilizzando lo strumento mestolo forato, inserire una sezione del cervello nei media sull'inserto, spingendo delicatamente la fetta deve essere completamente sommerso. Ripetere l'operazione per tutte le sezioni.
- Utilizzare una p1000 per estrarre 1 ml di coltura fetta dalla parte superiore dell'inserto e dispensare nella parte inferiore del pozzo. Rimuovere e gettare i supporti in eccesso fino a quando i bordi della agarosio intorno al cervello slicebecome visibile. Fate questo per le fette rimanenti.
- Pick up tegli inserire il bordo con una pinza, inclinazione e rimuovere il supporto in eccesso. Poi, trasferire rapidamente l'inserto in 35 mm 2 piatto contenente 1 ml di coltura fetta media. Usare 2 paia di pinze taglienti per rimuovere l'agarosio intorno al tessuto, facendo attenzione a non allungare / fetta danni o fare un buco nella membrana (più facile se si effettua una lacrima al limite del agarosio, quindi separare l'agarosio da entrambi i lati). Quindi spostare l'inserto posteriore al 6 pozzetti e ripetere per le fette rimanenti.
- In una cappa di coltura di tessuti con il ventilatore spento (per evitare fette l'essiccazione) rimuovere frammenti agarosio da ciascuna membrana.
- Trasferire le fettine alla piastra da 6 pozzetti preparato al punto 5.1 e conservare la piastra a 37 ° C. Incubare fette per 24-48.
10. Cambiare la Fetta Media Cultura
- Ripetere il punto 5.1 con un 6-ben fresco.
- In una cappa di coltura di tessuti con il ventilatore spento, trasferire gli inserti a nuovi 6 pozzetti CONTaining supporti fresca fetta.
11. placcatura cellule tumorali sulla fetta
- Sonicare il colorante Cm-DII e rotazione a media velocità per 2 min.
- Spin le cellule tumorali utilizzati per la sovrapposizione a 201 xg per 5 min. Poi risospendere in 2 ml di coltura fetta dei media.
- Aggiungere 7 ml di Cm-DII nei 2 ml di cellule e media e incubare a 37 ° C per 20 min.
- Spin le cellule a 201 xg per 5 minuti e risospendere in 200 ml di mezzi affettare. Triturare delicatamente per dissociare le cellule (10-20 volte o fino a pellet è andato) e poi aggiungere 800 microlitri affettare media per fare 1.000 microlitri di volume totale.
- Contare le cellule tumorali vitali utilizzando Trypan blu. Aggiungere microsfere fluorescenti verdi alle cellule tumorali, alla stessa concentrazione di cellule. Tali microsfere inerti serviranno come controllo. Spin giù la miscela di cellule / microsfere a 201 xg per 5 minuti e risospendere in quantità desiderata di cultura fetta dei media. Cellule piastra a una densità di 6.000 cellule / slghiaccio in 65 volumi microlitri. Il numero di cellule placcato per fetta può essere aumentato a seconda delle preferenze e disponibilità.
- Nella cappa coltura tissutale dispensare cellule in 65 ml di media / slice sul centro della fetta.
12. Imaging e fissaggio
Nota: una Nikon Eclipse Ni C2si verticale confocale è stato utilizzato per prendere un grande scansione immagine di tutta la fetta sagittale a 4X con canali fluorescenti rossi e verdi. Se la funzione di scansione non è disponibile, una serie di immagini in sequenza attraverso la fetta e poi unire le immagini in Photoshop (utilizzando la posizione di microsfere e il bordo della fetta per navigare).
- Il giorno successivo (1 ° giorno di imaging), trasferire le fette in sei 35 millimetri 2 piatti con 1 ml di fetta di coltura. Immagine ogni fetta uno alla volta sul microscopio verticale fluorescente. Prendete una grande scansione immagine di tutta la fetta sagittale a 4X con canali fluorescenti rossi e verdi. Mantenere lasere guadagno impostazioni lo stesso per ogni sezione. Al termine dell'imaging, trasferire tutte le fette di nuovo ad una piastra da 6 pozzetti contenenti supporti fresca fetta.
- Se si desidera aggiunta di EDU, altri marker di proliferazione o condizione di droga, creare un archivio di supporti fetta con il farmaco che verrà utilizzato del materiale varia giornalmente per la condizione di trattamento. La condizione di trattamento deve essere iniziato alla fase 12.1 (direttamente dopo il Day 1 di imaging). Qualsiasi EDU o la proliferazione marcatore deve essere aggiunto il supporto anche con inizio alle 12.1 e aggiornata quotidianamente (utilizzare EDU a 10 micron).
- Immagine di nuovo il giorno 7 utilizzando le stesse impostazioni come il giorno 1 immagini.
- Dopo 7 ° giorno di imaging è completa, spostare ogni fetta in un 6-pozzetti con ogni ben contenente 1,2 ml di 4% paraformaldeide (PFA). Attenzione e lentamente cadere un ulteriore 1 ml di PFA in cima ad ogni fetta. Lasciare a temperatura ambiente per 1 ora.
- Rimuovere PFA da ogni pozzetto e dalla parte superiore di ogni fetta. Lavare i pozzetti 3 volte con PBS. Conservare le fette in PBS a4 ° C per la colorazione o montare su slitte.
Nota: Le impostazioni di ImageJ può essere necessario modificare e ottimizzato per tenere conto per l'immagine e la qualità del microscopio, così come le dimensioni delle cellule tumorali.
13. Quantificazione delle immagini (utilizzando ImageJ)
Nota: Le impostazioni di ImageJ può essere necessario modificare e ottimizzato per tenere conto per l'immagine e la qualità del microscopio, così come le dimensioni delle cellule tumorali.
- In ImageJ, utilizzare lo strumento Poligono per delineare l'intera porzione o la regione che si desidera quantificare. Aggiungi questa selezione al gestore ROI dove è possibile rinominarla e salvarla.
- Fare clic destro sull'area selezionata e scegliere duplicare. Nome questa immagine duplicato con la regione, fetta, giorno. Premere CTL + Maiusc + E per mostrare il contorno, quindi selezionare Processo - sottrarre sfondo - Rolling ball Raggio = 4.
- Dopo sottrazione del background, selezionare "regolare soglia" in "Immagine" menu a discesa. Controllare sfondo scuro -; guardare l'immagine ingrandita e impostare la soglia. Come si imposta la soglia spostando la barra di soglia, garantire tutte le cellule sono incluse / evidenziate ma estremamente piccoli punti che sono detriti (o più piccolo di un cellulare) non sono inclusi. Utilizzare la stessa soglia per tutte le immagini. Spostare la finestra di soglia al lato.
- Selezionare "Processo" - "Trova Maxima" e impostare la tolleranza al rumore tra 5 e 10 e verificare quanto segue: selezione point anteprima, il tipo di output come particelle segmentati, escludere maxima bordo, sopra soglia più bassa. Poi selezionare nuovamente la regione di interesse premendo Ctl + Maiusc + E.
- Selezionare "Analyze particelle" dal menu Analizza discesa. Impostare la dimensione dei pixel per 4-40 e la circolarità di 0,00-1,00. Fare clic anche "mostra contorni overlay" "risultati visualizzazione" e "sintesi", quindi premere OK.
- Registrare tutti i dati grezzi e la sintesi in un documento Microsoft Office. Il "Conte" per ogni regione is necessari per il calcolo cambiamento volte nel corso della settimana della cultura.
- Ripetere questa procedura per tutte le immagini e le aree di interesse, facendo in modo che la soglia e le altre impostazioni rimangono costanti.
- Calcolare la variazione del numero di cellule piega sulla fetta nella settimana in coltura dividendo il numero di cellule tumorali sulla fetta di giorno 7 per il numero di cellule sulla fetta Giorno 1. Analogamente, piegare il cambiamento del numero di cellule all'interno di ciascuna regione è calcolato dividendo il numero di celle in quella regione il giorno 7 per il numero di cellule in quella regione il giorno 1.
- Eseguire il passaggio 13.8 per microsfere pure. Il numero di microsfere sulla fetta dovrebbe essere la stessa il giorno 7 come il Giorno 1 (Piegare cambio = 1). Allo stesso modo, il numero di microsfere all'interno di ogni regione dovrebbe essere la stessa il giorno 7 come il Giorno 1 (Piegare cambio = 1). Se il cambiamento Fold differisce da 1, questo indica cambiamenti nella fetta topografia nel corso del tempo.
14. Colorazione
- Nastro un pezzo di parafilm su The banco di laboratorio e disegnare sei cerchi con una penna bloccante pap liquido (uno per ogni fetta, appena più grande della dimensione di una fetta). Mettere circa 400 ml di PBS in un punto al centro di ogni cerchio. Numero o etichetta i cerchi per identificare ogni fetta.
- In 1 ml di PBS, utilizzare una lama di rasoio per tagliare un quadrato intorno la fetta, lasciando spazio della membrana intorno fetta. Utilizzando pinze spostare la fetta tagliata nel primo cerchio e adagiare la fetta sopra della bolla di PBS. È essenziale fare in modo che la fetta non si piega su se stesso o ottenere capovolto capovolto durante questo processo. Quindi, rimuovere il PBS da sotto la fetta e metterlo in cima della fetta e aggiungere PBS, se necessario, per assicurarsi che rimanga sommersa. Ripetere questo passaggio per ogni fetta.
- Effettuare 10 ml di 3% BSA in PBS. Estrarre 2 ml e aggiungere 100 ml di digitonina ad esso. Mescolare e aggiungere le fette di bloccare e permeabilize, 30 minuti a temperatura ambiente.
Nota: L'uso di altri agenti permeabilizzazione quali Triton X-100 si tradurrà in perdita di etichettatura CM-DII. - Rimuovere permeabilizzazione / soluzione di blocco e lavare 3x con PBS per 10 min.
- Se la colorazione per EDU, seguire le istruzioni fornite dal kit per assemblare la miscela. Applicare la miscela per 45 min. Se colorazione con altri anticorpi, il protocollo deve essere ottimizzato per la concentrazione di anticorpi primari e secondari (~ 1 ora RT per primario e secondario). Sciacquare 3x con PBS per 10 min.
- Macchia con DAPI 1: 1000 in PBS per 5 min RT. Risciacquare 2x con PBS.
15. Montaggio del Slices
- Trasferire la fetta di un vetrino da microscopio. Assicurarsi che il lato della membrana con la fetta rimane rivolta verso l'alto, e non si piega su se stesso. Disegna un bordo intorno la fetta con una penna bloccante pap liquido.
- Inserire un piccolo vetrino di vetro (5 mm) su ogni lato della fetta (per mantenere la fetta venga danneggiato). Eliminare due o tre gocce di Fluoromount-G (per immunofluorescenza) sulla parte superiore delfetta di appena coprirlo. Poi coprire il vetrino lunga fetta (24 x 50 mm).
- Ripetere l'operazione per ogni sezione. Sigillare i bordi delle diapositive con smalto e conservare a 4 ° C. Fare l'imaging confocale di colorazione.
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Representative Results
Questa sezione esemplifica il tipo di risultati da aspettarsi dalla utilizzando il tumore cerebrale / organotipica fetta co-coltura per indagare preferenza microambiente regionale e per testare nuove terapie. Abbiamo dimostrato che il saggio è progettato per replicare il microambiente per i tumori cerebrali, come l'organizzazione dei tessuti e proliferative della fetta viene mantenuta (Figura 3). Abbiamo anche dimostrato che un aumento del numero di cellule tumorali sulla fetta nel tempo può in parte essere dovuto alla migrazione delle cellule sul microambiente fetta cerebrale (Figura 4). Abbiamo anche dimostrato che questo co-coltura può essere usato come un dosaggio quantitativo calcolando la variazione piega del numero di cellule durante la settimana in coltura per regioni specifiche della fetta, o per l'intera fetta cerebrale (figura 6) I risultati preliminari multipla tipi di cellule tumorali hanno dimostrato che il numero di cellule tumorali può essere quantificata mediante imaging confocalela fetta spessa 200 micron per il fatto che le cellule migrano ad una profondità di 20-50 micron in fetta.
Abbiamo trovato che microsfere fluorescenti verdi sono un controllo efficace per i cambiamenti nella fetta topografia perché mostrano alcun movimento o il cambiamento di numero per tutto il tempo in coltura (Figura 5). Dopo aver fissato la co-coltura, colorazione può essere fatto per esaminare le cellule tumorali in un microambiente del cervello e gli effetti dei farmaci sulla proliferazione delle cellule tumorali, la morte cellulare, o cambiamenti di espressione della proteina (Figura 7). Abbiamo dimostrato che questo saggio può essere utilizzato per testare terapie farmacologiche attraverso il confronto di cellule di medulloblastoma topo trattato con un Smo (Smoothened) antagonista LDE225 (Sonidegib) o con un controllo del veicolo. Piegare aumento del numero di cellule sulla fetta più di una settimana di cultura è stata quantificata e rappresentata graficamente (numero di cellule il giorno numero 7 / cella il giorno 1) Questi dati indicano che LDE225 notevolmente depieghe numero delle cellule tumorali in confronto al controllo 6. Questo effetto può anche essere visto nelle immagini rappresentative inclusa (Figura 8). Mostriamo anche le immagini di cellule di medulloblastoma umane coltivate nel test cultura fetta (Figura 9).
Figura 3. Brain Tumor / Organotipica Fetta Co-coltura Assay disegno. (A) fetta cervello sagittale Organotipica da un mouse P6 è posizionato direttamente su una membrana semi-porosa e media viene aggiunto al fondo del piatto di coltura. La cultura è immerso nel fluido da una parte e accessibile all'ossigeno dall'altro lato. Cellule tumorali marcate sono sovrapposti sul numero di slice e cellulare può essere seguita nel tempo. (B) Nella cultura, la fetta mantiene una organizzazione tessuto che ricorda da vicino quella osservata in vivo. Preservation del microambiente del cervello è dimostrata mediante l'etichettatura EdU di proliferative precursori neuronali dei granuli nello strato esterno dei granuli (EGL) del cervelletto nella cultura fetta. Nella cultura fetta, queste cellule precursori incorporano l'analogo della timidina EdU, come sarebbe osservate in vivo, in questa fase dello sviluppo (P6) (freccia bianca indica EGL). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. astrocitoma umano Cellule in Brain Tumor / organotipica fetta Co-cultura Assay. Un aumento nelle cellule tumorali del cervello umano sulla fetta potrebbero rispecchiare rilocalizzazione delle cellule tumorali dalla membrana alla cultura fetta. (A) Una zona sul bordo di una fetta al giorno 1 (in alto) e 7 ° giorno (in basso) in cui le cellule possono m igrate dalla membrana sulla fetta cervello. (B) Un secondo esempio di possibile migrazione cellulare sul cervello al bordo della fetta. Giorno 1 (in alto) e 7 ° giorno (in basso). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Le sfere di controllo microsfera. Giorno 1 (rosso) e il giorno 7 immagini di controllo (verde) di microsfere fluorescenti sono sovrapposti (giallo) per rivelare nessun movimento delle microsfere più di una settimana nella cultura. Giorno 1 e Giorno 7 immagini sono state scattate nella stessa posizione all'interno della fetta (Scala bar = 45 micron). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Quantificazione a ImageJ. (A) L'immagine di una fetta è aperto in ImageJ e tutta la fetta e / o delle regioni sono illustrate per la quantificazione. (B) viene selezionata La regione di interesse e un'immagine duplicato è fatta. (C ) La fluorescenza di fondo viene sottratta dalla dell'immagine. (D) La soglia è impostata per la dimensione e la forma delle cellule, determinare quale sarà contato. (e) analizzare particelle per contare il numero di cellule nella regione di interesse. Fold change del numero di cellule può essere calcolato dividendo il numero di cellule nel giorno 7 per il numero di cellule al giorno 1 per ogni regione di interesse o l'intera area della fetta. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura .
Figura 7. colorazione per la proliferazione. Immagine esemplifica come colorazione (dopo aver fissato la fetta in PFA) può essere fatto con successo sulla fetta dopo una settimana di cultura. L'immagine mostra DAPInuclear colorazione (blu), le cellule del mouse medulloblastoma fluorescente rosso, verde e l'etichettatura per l'incorporazione di un analogo della timidina nel DNA come marker per la proliferazione. EDU è stata inclusa nei mezzi di coltura fetta (10 micron) per una settimana (frecce bianche indicano cellule positive per EDU e frecce gialle indicano cellule negative per EDU) (scala bar = 50 micron). Clicca qui per vedere una versione più grande di questo figura.
Figura 8. mouse Medulloblas Le cellule toma TRATTATI CON LDE225. La figura dimostra il trattamento farmacologico delle cellule tumorali del sistema fetta test overlay. (A) Rappresentazione grafica dei dati raccolti da un esperimento del mouse medulloblastoma. DMSO è stata la condizione di controllo (CTL) e LDE225 (Sonidegib) (1 micron) (LDE) era la condizione di trattamento. Piegare aumento del numero di cellule sulla fetta più di una settimana di cultura è stato quantificato (numero di cellule il giorno 7 Numero / cella il giorno 1), (n = 12 CTL, n = 13 LDE, barre di errore = SEM). (B) Rappresentante immagini di controllo del veicolo fette trattati al giorno 1 (in alto) e 7 ° giorno (in basso). (C) Immagini rappresentative della LDE trattati fette il Giorno 1 (in alto) e 7 ° giorno (in basso). Le immagini sono state prese a 4X. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 9. medulloblastoma Le cellule in Brain Tumor / organotipica fetta Co-cultura. Cellule di medulloblastoma umani sono stati ottenuti da James M. Olson presso l'Università di Washington, e sono state coltivate per una settimana nel test cultura fetta. (A) 1 ° giorno di immagine cellule umane coltivate medulloblastoma sulla fetta di cervello di topo. (B) Un'immagine della stessa porzione cervello di topo con cellule di medulloblastoma umano dopo una settimana di cultura (7 ° giorno). Le immagini sono state prese a 4X. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive come le cellule tumorali cerebrali possono essere fluorescente e piastrate su una sezione sagittale del cervello di un topo P6 e poi monitorati per una settimana in coltura. Questo tumore cerebrale / organotipica assay fetta co-coltura può essere utilizzato per determinare l'effetto del microambiente regionale sul numero delle cellule tumorali e può essere utilizzato anche come un sistema per misurare l'efficacia di nuovi farmaci sulla crescita tumorale umano. Precedenti studi hanno utilizzato una strategia simile per valutare il ruolo di cervello, micro-ambiente sul neurale precursore proliferazione 7,8.
Questo test in cui le cellule tumorali cervello sono seminate in una cultura fetta organotipica 9 fornisce un sistema per la coltivazione di cellule tumorali umane cervello che sono difficili da propagare in normali condizioni di coltura cellulare. Un aspetto critico di questa procedura è l'importanza di mantenere la salute della fetta e le cellule tumorali. Il periodo di tempo che le fette siedono in tampone durante la dissection ea RT durante l'imaging devono essere limitate, per garantire che le sezioni e cellule rimangono sano come possibile. Se le cellule primarie tumorali cervello umano vengono utilizzati in questo test, le cellule devono essere placcato sulle fette appena possibile dopo la biopsia. Pertanto le fette devono essere preparati prima della chirurgia. Per evitare qualsiasi effetto differenziale di tempo di imaging tra fette, la quantità di tempo trascorso dal incubatore dovrebbe essere breve e coerente per tutti culture fetta in un esperimento. I controlli microsfere sono importanti in quanto forniscono segni spazialmente coerenti nel tempo. Inoltre, le distorsioni nella cultura fetta a causa di ritiro, lacrimazione, o pieghevoli sono evidenti da formazione immagine perline microsfere.
Uno dei limiti di questo protocollo è che le cellule possono essere propagate solo in questo sistema di coltura fetta per circa una settimana. Tuttavia, per alcuni tipi di tumori cerebrali questo è un miglioramento significativo rispetto alla corrente o Statoaffari f. Una seconda limitazione è che il ematoencefalica barriera viene eliminata, che è una considerazione importante per valutare farmaci che possono essere utilizzati per il trattamento di tumori cerebrali. Una terza considerazione è che questo è un basso dosaggio di throughput che non può essere utilizzato per testare una libreria di composti.
Questo test è versatile e facilmente modificati per studiare diversi tipi di cellule tumorali e una serie di domande di indagine. Questo protocollo può essere utilizzato come un saggio quantitativo per esaminare gli effetti delle nuove terapie sulla sopravvivenza e la crescita delle cellule tumorali (Sun et al., Comunicazione personale). Un confronto della variazione piega del numero di cellule tumorali in regioni distinte del cervello fornisce un metodo per decifrare gli effetti del microambiente sulla crescita tumorale.
Questo / fetta sistema di co-coltura organotipica tumore al cervello fornisce anche la possibilità di indagare il rapporto tra le cellule tumorali del cervello e specifici microambienti cerebrali. Mammany tipi di tumori cerebrali mostrano un modello distinto di sviluppare in specifiche regioni del cervello e microambienti 3,4. Coltivando cellule tumorali umane marcate su una fetta cervello di topo sagittale, le cellule possono essere monitorati per la preferenza regionale che può essere coerente con la regione in vivo della crescita. Ulteriore esame del microambiente che le cellule tumorali preferiscono potrebbe portare alla identificazione di potenziali fattori che favoriscono la crescita delle cellule tumorali. Il test può aiutare a migliorare in condizioni di coltura cellulare in vitro e può anche fornire un sistema per studiare come tumore iniziazione può essere prevenuta o più trattata efficacemente.
Ci sono tipi specifici di tumori cerebrali che non possono essere propagati nelle normali condizioni di coltura cellulare o con il mouse ortotopico o xenotrapianti sottocutaneo. Per questi tipi di tumore è difficile per testare nuove terapie farmacologiche sulle cellule tumorali umane. Questo protocollo dimostra che le cellule tumorali cerebrali umane possono essere coltivate nella fettacultura test e trattamenti farmacologici possono essere valutate quantitativamente. Dopo trattamento farmacologico, co-colorazione delle cellule tumorali può fornire un'ulteriore valutazione dell'effetto del farmaco sulla proliferazione delle cellule tumorali e di inibizione pathway. Recenti studi hanno dimostrato che ci può essere una differenza drastica tra un effetto farmaci sulle cellule tumorali in coltura monostrato normale contro una cella eterogenea 3D cultura ambiente 10. Cellule epiteliali Analogamente adulti normali e tumorali, che hanno una vita breve in vitro, hanno dimostrato di riprogrammare condizionatamente ad uno stato proliferativo quando coltivate su cellule feeder fibroblasti in combinazione con un inibitore di chinasi Rho 11. Questi studi confermano ulteriormente l'importanza di mantenere le cellule tumorali in un organotipica, 3D, microambiente clinicamente rilevante, e la rilevanza di questo sistema di coltura cellulare per la ricerca sul cancro in corso. Pertanto, questo è un test utile per testare farmaci su cellule tumorali umane in un relevan clinicamentet modo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Invitrogen | 17504044 | |
| Glucose | Invitrogen | 17502048 | |
| Pennicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Neurobasal-A- Medium minus phenol red | Invitrogen | 12349015 | |
| Low Melting Point Agarose | Promega | V2111 | |
| Slice Culture Inserts | Milipore | PICM0RG50 | |
| laminin | Invitrogen | 23017015 | |
| Cm-DiI | Invitrogen | V22888 | |
| EDU (Labeling and Detection) | Life Technologies | c10337 | |
| Microspheres | Life Technologies | F-21010 | |
| Vibratome | Leica | ||
| Confocal Microscope | Nikon Eclipse Ni C2si | ||
| ImageJ software | |||
| 5 mm Cover Glasses | Fisher Scientific | 64-0700 (CS-5R) |
References
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