Introduction
Последние исследования рака добилась значительных достижений в выявлении генетических мутаций, молекулярных изменений и возможные процедуры для различных опухолей головного мозга. Несмотря на этот прогресс, опухоли головного мозга остаются одной из ведущих причин рака, связанных с смертности взрослых и детей. Лимитирующие факторы в исследовании опухолей головного мозга включают ограниченное наличие образцов первичных пациентов и клеточных линий и трудности в репликации уникальный и гетерогенную микросреду головного мозга в доступных экспериментальных систем. Для многих опухолей головного мозга условия, необходимые для поддержания опухолевых клеток с течением времени, пока не известно. Даже для опухолей головного мозга, которые могут быть выращены в клеточной суспензии в нейросферах, условия культивирования могут влиять на опухолевые клетки 1,2. Действительно, добавление основного фактора роста фибробластов или эпидермальный фактор роста стимулировать пролиферацию чтобы ингибировать дифференцировку и может изменить экспрессию гена 1. Другие способы роста опухолевых клеток такимкак распространение опухоли у мышей через ортотопической или подкожной ксенотрансплантата опухолевых клеток являются ценными анализы, но ограничиваются такими факторами, как время развития опухоли (особенно опухолей низкосортных), стоимости и количества опухолевых клеток, которые могут быть впрыскиваемого и изучены , Таким образом, современные методы выращивания человеческих клеток опухоли головного мозга являются недостаточными для поддержания определенных типов опухолей, и часто предоставляют искусственные среды, не находятся в тесном мимические среды опухолевые в естественных условиях.
Различные виды опухолей головного мозга у детей растут в узкоспециализированных местах в головном мозге [3, 4], и это, вероятно, отражает разные требования микросреды для роста опухоли [5]. Этот протокол описывает новую систему, где клетки, которые трудно распространяться в нормальных условиях культивирования могут быть выращены в органотипической микроокружение головного мозга, которые имитируют в естественных условиях роста опухоли. В этом количественного анализа, флуоресцентно меченныхопухоли головного мозга клетки высевают на несовершеннолетних мозга мыши ломтиками органотипических и контролируется в течение долгого времени. Этот анализ может быть использован для изучения влияния микросреды на рост опухоли, и, чтобы проверить новые методы лечения наркотиков в клинически значимых микросреды мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
О себе этика: Следующая процедура с участием животных предметы были сделаны в соответствии с Национальными Институтами Здоровья и руководящих принципов были утверждены Рак институциональной Комитета по уходу и использованию Дана Фарбер животного. Все человеческие субъекты работа была рассмотрена Советом комитетов организационного обзора Бригама и Женской больницы и Дана-Фарбер институт рака, и Стэнфордского университета надлежащего использования, что информированное согласие было получено от всех субъектов, при необходимости, и соответствующего отказа от требований согласия было получено для минимальных исследований риска.
Хронология Slice культуры Протокола:
Рисунок 1. Хронология протокола Опухоль головного мозга / Органотипической фрагмент Со-культуры. Эта цифра показывает график процедуры кусочек культуры, охватывающий все восемь дней уплотнительныее эксперимента и основных этапов процедуры. График относительно Дню 0, когда клетки высевают на срез того, чтобы подчеркнуть важность начала процедуры дней до посева клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
1. Вскрытие буфера
- Готовят 15 мМ HEPES (1 М), 6.5mg / мл глюкозы, 1,3 мМ MgSO4 (1 М), 20 мМ KCl (2 м) и 1% пенициллина / стрептомицина в 1X HBSS.
- Доведения рН до 7,4 с помощью NaOH.
- Фильтр и хранить при -20 ° С.
2. Кусочек Культура Медиа
- Приготовьте 2% B-27, 1% N 2 добавка, 1% пенициллина / стрептомицина, 1% Glutamax и 1,5 мг / мл глюкозы в Neurobasal-A Средняя минус фенолового красного.
- Фильтр и хранить при -20 ° С. Разморозить при необходимости, и отбросить после 1 недели при 4 ° С.
Примечание: Следующая процедура может быть сделано до нае день перед началом вскрытия. - 3% легкоплавкой агарозе
Примечание: Следующая процедура может быть сделано до одного дня перед началом вскрытия. - Смешайте 0,9 г точку плавления агарозы низкого в ~ 31 мл рассечение буфера, микроволновой печи в течение 25 сек с крышкой рыхлой. Микроволновая печь, пока не растаял и убедитесь, что смесь не переполнить.
- Хранить при 55-65 ° C до тех пор, пока это необходимо.
Примечание: Следующая процедура может быть сделано до одного дня перед началом вскрытия.
4. Смазать фрагмент Культура Вставки ламинином
Примечание: Следующая процедура может быть сделано до одного дня перед началом вскрытия.
- В капюшоне культуры ткани, используя стерильные щипцы, поместите один ломтик культуры вставку в каждой лунке 6-луночного планшета (совпадает с числом срезов вы намерены получить около 12 могут быть собраны из одной процедуры. Следующая процедура написана для шесть ломтиков). Заполните 15 мл коническую т Ube 1х PBS (800 мкл / вставка) и добавить ламинин (10 мкг / мл).
- Добавить 800 мкл ламинин смеси в верхней части каждого среза культуры вставки. Инкубируют при 37 ° С до использования.
5. Подготовка к Dissection
- Заполните каждую лунку 6-луночного планшета с 1200 мкл кусочек культуральной среды. Заполните все неиспользуемые скважины с 1200 мкл PBS и заполнить пространство в центре пластины с 5 мл 1x PBS. Хранить эту пластину при 37 ° C.
- Стерилизовать рассечение инструменты в 70% этанола. Протрите vibratome лезвие с помощью ацетона, чтобы удалить масло и стерилизовать перед использованием.
- Поместите три 35 мм 2 блюда и пять 10 см 2 ткани культуры блюда в капюшоне. Наполните одну 10 см 2 блюдо с буфером рассечение и место на льду.
Примечание: Процесс щенков по одному.
6. Вскрытие
Примечание: Процесс щенков по одному.
ES / ftp_upload / 53304 / 53304fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Препарирование сокращений. Эти изображения показывают необходимые сокращения рассечение удалить череп от мозга Р6 мыши. Разрезы показаны пунктирными линиями. (А) Вырезать 1 показан. Порезы 1 и 2 выполнены из ствола головного мозга / задней двусторонней основе, соединяющей в глазницу на каждой стороне .. (B) Разрыв 3 и 4 показаны. Сократить 3 выполнен из одного глазницы с другими соединительными порезов 1 и 2. Вырезать 4 начинается на средней линии разреза 3 и продолжается в направлении кончика носа, разделяющей череп между обонятельной луковицы (масштаб бар = 4,4 мм). Пожалуйста, Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Обезболить P6 мыши, используя ИФ экспозиции (100%) ИФ. После примерно 5 мин при дыхании замедляется или нет признак дыхания, быстро обезглавитьмышь с острыми ножницами. Спрей голову с 70% этанола и место в культуре ткани блюдо.
- Использование больших тупые щипцы провести головой устойчивый, захватывая нос. Использование средних ножницы рассечение, удалить лишнюю кожу, чтобы выявить череп.
- Сделать сокращений 1 и 2 путем разрезания череп на двусторонней основе, от задней части черепа к передней на каждой стороне, соединяющий разрез в глазнице. Держите кончик ножниц как можно ближе к черепу, как это возможно, чтобы избежать повреждения тканей.
- Для сокращения 3, использовать небольшие весенние ножницы для подключения сокращений 1 и 2. Затем используйте маленькие тупые щипцы осторожно снимите череп.
- Использование малых пружин ножницы, аккуратно отрезать оставшийся череп вдоль средней линии сверху, таким образом, что остальные черепа становится 2 половинки (рисунок 2, вырезать # 4). Использование щипцов снимите череп выявить два обонятельных луковиц.
- Вставьте плоскую лицом шпателя (смоченной рассечение буфера, так ткань не будет придерживаться его) между бottom мозга и основания черепа, аккуратно удалите мозг и поместить в чашку, содержащую рассечение буфера на льду.
- Повторите шаг 6 для получения второго мозг для нарезки
7. Внедрение Мозги в агарозном
- Поместите два 35 мм 2 блюд открытых на льду и протрите пару больших тупыми щипцами с 70% этанола.
- Залить 3% с низким агарозы (полученного на стадии 3) в двух блюд до куполом на вершине формы. Установите таймер на 3 мин. На 3 минут (тест по касалась края агарозном заполненные купола, если можно наблюдать полимеризации агарозы, он готов) подобрать один мозг с тупыми щипцами и место в стороне агарозном заполненные 35 мм блюдо, то шаг его в центр чашки (это снимает избыточный буфер рассечение вокруг мозга, так что монтирует лучше).
- Повторите для 2-го мозга. Запуска таймера в течение 10 мин.
- Через 10 мин вставьте плоскую лопаточку в пространство междуагарозы и блюдо, чтобы вытолкнуть заполимеризованного агарозы, содержащий мозги P6.
- Используйте плоскую лезвие для обрезки агарозы в куб вокруг мозга, убедившись, что края как можно более прямо.
- Поместите суперклей на vibratome пластины в двух полос. Затем подобрать агарозном установлен мозг и мягко поместите его вниз по клеем, расположенный на сагиттальных срезах. Сделайте то же самое для другой мозг. Убедитесь, что оба мозги выстроились друг с другом.
- Пусть клей сухой при комнатной температуре 5-8 мин. В течение этого времени, заполните фразу область держателя vibratome с колотым льдом и водой.
8. Разрезание с Vibratome
- Поместите режущий резервуар в области держателя лед, перемещая ползунок в право заблокировать его на место.
- Использование круговой отвертку, поднимите круговой vibratome пластину с мозгами, склеенных на него, и установить его в резервуар. Удалить отвертку и закрепите пластину в месте с гое шестигранной головкой отвертка. Убедитесь, что пластина и режущий резервуар твердо на месте.
- Использование щипцов, пикап vibratome лезвие, вписать его в режущей головке, замок в месте с гексагональной отвертки. Затем закрепите режущую головку с прилагаемой лезвия на vibratome используя круглую винт.
- Поднимают положение бритвы в как можно ближе к агарозном встраиваемый мозга, как это возможно, в то время как убедившись, что бритва на той же высоте (или чуть выше) мозги. Заполните камеру с достаточно буфер холодной рассекает, чтобы покрыть лезвие.
- Нажмите ↕ кнопку один раз (вы должны увидеть это мигать, эта кнопка определяет границы, когда лезвие будет идти вперед и назад), а затем нажмите и удерживайте "вперед", чтобы вручную вырезать встроенный мозг, выпуск до тех пор, бритва не очищает агарозном блок. Немедленно нажмите кнопку ↕ опять же, это будет определять конец диапазона автоматической резки.
- Нажмите кнопку "Single / CONT" раз и лIGHT по CONT должны идти дальше. Установите толщину режущей 400-450 мкм, вибрируя частоту 5,5-6, и скорость 4. Это будет параметры обрезки.
- Нажмите кнопку "Пуск / Стоп" один раз, и автоматической резки должны начать. Пресс "Пауза", чтобы собрать ткань с помощью ложки с отверстиями, по мере необходимости. Следует принять около 5-10 мин, чтобы достичь ближе к средней линии. В этот момент, нажмите кнопку "пауза" и изменить скорость до 3 и изменить толщину до 200 мкм. Не собирать первый срез производится после внесения этого изменения.
- Нужные кусочки толщиной 200 мкм будет иметь обонятельная луковица через мозжечок хорошо определены. Передача каждого желаемого срез, как они разрезают на 6-луночных планшетах, заполненных рассечение буфера на льду. Сделайте это, перемещая буфер в камере нарезки вокруг ткани плавать кусочек, касаясь его как можно меньше, поднять его из буфера, когда это прямо над шумовкой. Обычно около 12 ломтика с желаемыми структур могут быть собраны. Ломтики можно оставить в рассекает буфера на льду в течение 20 мин.
- В то время как ломтики на льду, вынуть 6-луночный планшет со вставками покрыта ламинина 37 ° C инкубатора. В рассечение капюшона отбросить ламинина заботясь, чтобы не повредить пластины. Добавить 3,5 мл культуральной среды среза в верхней части каждой вставки. В верхней части средств массовой информации будет формировать купола форму без разлив в лунки.
9. Покрытие ломтики на вставок
- Использование щелевой инструмент ложку, положите кусочек мозга в средствах массовой информации на вставке, мягко толкая кусочек, чтобы быть полностью погружен в воду. Повторите для всех срезов.
- Использование P1000, чтобы вытянуть 1 мл культуральной среды среза от верхней части вставки и обойтись его в нижней части скважины. Снимите и выбросьте лишний носитель до края агарозы вокруг мозга не slicebecome видно. Сделайте это для оставшихся кусочков.
- Возьмите тон вставить в обод с пинцетом, наклона и удалить лишние носители. Затем, быстро передавать вставку в 35 мм 2 блюдо, содержащей 1 мл культуральной среды ломтик. Используйте 2 пары острых щипцов для удаления агарозы вокруг ткани, заботясь, чтобы не растянуть / повреждения кусочек или сделать дырку в мембране (проще, если вы делаете слезу на самом краю агарозы, затем растащить агарозы из любая сторона). Затем переместите вставку обратно на тарелку 6-а и повторите для остальных слоев.
- В капюшоне культуры ткани с вентилятором выключения (для предотвращения ломтики от высыхания) удалить агарозном фрагменты из каждой мембраны.
- Передача ломтики в 6-луночный планшет, полученного на стадии 5.1, и хранить пластины при температуре 37 ° С. Выдержите ломтики в течение 24-48 ч.
10. Изменение Slice культуральной среды
- Повторите шаг 5.1 с новым пластины 6-а.
- В капюшоне культуры ткани с вентилятором выключения, передачи вставки для новых пластин 6-а продолжениеAining свежий ломтик СМИ.
11. Покрытие Опухолевые клетки на ломтик
- Разрушать ультразвуком краситель Ст-DII и спина на средней скорости в течение 2 мин.
- Спином вниз опухолевые клетки используются для наложения на 201 мкг в течение 5 мин. Затем ресуспендируют в 2 мл культуральной среды срез.
- Добавить 7 мкл см-DiI в 2 мл клеток и сред и инкубируют при 37 ° С в течение 20 мин.
- Спин вниз клетки при 201 мкг в течение 5 минут и ресуспендируют в 200 мкл нарезки СМИ. Растирают осторожно, чтобы отделить клетки (в 10-20 раз или до тех пор, пока осадок ушел), а затем добавить 800 мкл нарезки СМИ, чтобы сделать 1000 мкл общего объема.
- Граф жизнеспособных опухолевых клеток с использованием трипанового синего. Добавить зеленые флуоресцирующие микросферы с клетками опухоли, в то же концентрации, что и клетки. Эти инертные микросферы будут служить в качестве контроля. Спин вниз клеток / микросфер в 201 смесь мкг в течение 5 мин и ресуспендируют в желаемом количестве срез культуральной среде. Пластина клеток при плотности 6000 клеток / SLлед в 65 мкл объем. Количество посеянных клеток в срезе может быть увеличена в зависимости от предпочтений и доступности.
- В культуре ткани капот обойтись клеток в 65 мкл среды / секции на центр среза.
12. Фиксация изображений и
Примечание: в Nikon Eclipse Ni C2si вертикально конфокальной был использован взять большое изображение сканирование всей сагиттальной ломтик на 4X с красными и зелеными флуоресцентными каналами. Если функция сканирования не доступна, принять нескольких изображений последовательно через кусок, а затем объединения изображений в Photoshop (с использованием расположение микросфер и край среза для навигации).
- На следующий день (день 1 томография), трансфер ломтики в шести 35 мм 2 блюд с 1 мл культуральной среды среза. Изображение каждый срез по одному на флуоресцентном микроскопе вертикальном. Возьмите большую изображения сканирование всей сагиттальной ломтик на 4X с красными и зелеными флуоресцентными каналами. Держите лазери усиления настройки то же самое для каждого среза. В конце обработки изображений, передачи всех срезов обратно в 6-луночный планшет, содержащий свежий ломтик носитель.
- Если добавление EDU, другой маркер пролиферации или состояния лекарственного желательно, создать запас среза средах с препарата, который будет использоваться для изменения медиа ежедневно в течение состояния обработки. Состояние лечение должно быть введено на этапе 12.1 (непосредственно после День 1 изображений). Любое EDU или распространение маркер должен быть добавлен в СМИ также начинает в 12,1 и обновляется ежедневно (используйте EDU в 10 мкм).
- Изображение снова на 7-й день, используя те же параметры, как День 1 изображений.
- После 7-й день изображений завершена, перемещать каждый кусочек в 6-луночный планшет с каждой лунке, содержащей 1,2 мл 4% параформальдегида (PFA). Осторожно и медленно падение еще 1 мл PFA на вершине каждого среза. Оставьте при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Удалить PFA из каждой лунки и из верхней части каждого среза. Вымойте каждую лунку 3x с PBS. Храните ломтики в PBS в4 ° С для окрашивания или монтажа на слайдах.
Примечание: Параметры ImageJ может должны быть скорректированы и оптимизированы для учета качества изображения и микроскопа, а также размер опухолевых клеток.
13. Количественная изображений (с помощью ImageJ)
Примечание: Параметры ImageJ может должны быть скорректированы и оптимизированы для учета качества изображения и микроскопа, а также размер опухолевых клеток.
- В ImageJ, используйте инструмент многоугольник очертить весь срез или участок, который вы хотите измерить. Добавить этот выбор менеджеру ROI, где вы можете переименовать его и сохранить его.
- Щелкните правой кнопкой мыши на выбранной области и выберите дублировать. Назовите этот дубликат изображения с области, ломтик, день. Нажмите Ctl + Shift + E, чтобы показать контур, затем выберите Process - вычесть фон - катящийся шар радиуса = 4.
- После вычитания фона, выберите "настроить порог" в "Изображение" в выпадающем меню. Проверьте темный фон -; посмотреть на изображение приближается и установить порог. Как вы установите порог путем перемещения порогового бар, убедитесь, что все клетки включены / выделенный но чрезвычайно маленькие точки, которые мусор (или меньше, чем клетки) не включены. Используйте тот же порог для всех изображений. Перемещение пороговое окно в сторону.
- Выберите "Процесс" - "Найти Maxima" и установить допуск шума между 5 и 10 и проверьте следующее: Предварительный выбор точки, тип выходного а Географическая частиц, исключить края максимумы, прежде нижнего порога. Затем повторно область интереса, нажав Ctl + Shift + E.
- Выберите "Анализ частиц" из меню Анализ упасть. Установите размер пикселя на 4-40 и округлости 0.00-1.00. Также нажмите "Показать наложение очертания", "отображение результатов" и "суммировать", а затем нажмите кнопку ОК.
- Запишите все исходные данные и резюме в офисе документа Microsoft. "Учитывать" для каждого региона Iы, необходимых для расчета раза изменение за неделю в культуре.
- Повторите эту процедуру для всех изображений и областях, представляющих интерес, убедившись, что порог и другие параметры остаются неизменными.
- Рассчитывают кратное изменение числа клеток на срез в течение недели в культуре путем деления числа опухолевых клеток на срез на 7 день по количеству клеток на срезе в День 1. Аналогично, изменение раза числа клеток в каждом регионе рассчитывается путем деления числа клеток в той области на 7 день по количеству клеток в той области на 1 день.
- Выполните шаг 13,8 для микросфер, а также. Микросфер номер на срезе должен быть одинаковым на 7 день и на 1-й день (Fold изменение = 1). Точно так же, микросфер число в каждом регионе должны быть одинаковыми на 7 день, как на 1 день (Свернуть изменение = 1). Если Fold изменение отличается от 1, то это указывает на изменения в топографии среза во времени.
14. Окрашивание
- Лента кусок парафильмом на гое лабораторном столе и рисовать круги шесть с жидким блокатор Пап пера (один для каждого среза, только большего, чем размер ломтик). Поместите около 400 мкл PBS в точкой в середине каждого круга. Количество или обозначить круги, чтобы идентифицировать каждый кусочек.
- В 1 мл PBS, использовать лезвие, чтобы отрезать квадрат вокруг срез, оставив некоторое пространство мембраны вокруг среза. Использование щипцов переместите вырезать кусочек в первом круге и аккуратно положите ломтик на верхней части пузыря PBS. Важно, чтобы убедиться, что срез не раз за на себя или получить перевернул с ног на голову во время этого процесса. Затем удалите PBS из-под срез и поставить его на верхней части среза и добавить больше PBS при необходимости, чтобы убедиться, она остается под водой. Повторите этот шаг для каждого среза.
- Сделайте 10 мл 3% БСА в PBS. Выньте 2 мл, и добавить 100 мкл дигитонина к нему. Смешайте и добавьте к ломтики блокировать и проницаемыми, 30 мин при комнатной температуре.
Примечание: Использование других пермеабилизирующего агентов, таких как Triт Х-100 приведет к потере CM-DiI маркировки. - Удалить проницаемости / блокирующего раствора и промыть 3 раза с PBS в течение 10 мин.
- Если окрашивание EDU, выполните инструкции, предоставляемые с помощью набора для сборки смеси. Нанесите смесь в течение 45 мин. Если окрашивание с другими антителами, протокол должен быть оптимизирован для концентрации первичных и вторичных антител (~ 1 час RT для первичного и вторичного). Промыть 3 раза ЗФР в течение 10 мин.
- Пятно с DAPI 1: 1000 в PBS в течение 5 мин РТ. Промыть 2x с PBS.
15. Монтаж фрагменты
- Передача ломтик предметное стекло. Убедитесь, что сторона мембраны с ломтиком остается вверх, и не раз за на себя. Нарисуйте рамку вокруг среза с жидким пера блокатор Пап.
- Поместите небольшое покровное стекло (5 мм) с каждой стороны среза (держать кусочек от повреждений). Бросьте два или три капли Fluoromount-G (для иммунофлуоресценции) на верхней частиломтик просто едва покрывают его. Затем накройте ломтик долго покровное (24 х 50 мм).
- Повторите для каждого среза. Печать края слайдов с лаком для ногтей и хранить при 4 ° С. У конфокальной микроскопии окрашивания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом разделе пример типа результатов можно ожидать от использования опухоль головного мозга / органотипической ломтик совместное культивирование исследовать региональную предпочтение микроокружения, а также для тестирования новых методов лечения. Мы показываем, что анализ предназначен для репликации микросреду для опухолей головного мозга, как тканевой организации и пролиферативную состояние ломтик поддерживается (рисунок 3). Мы также показали, что увеличение количества опухолевых клеток на срезе с течением времени может быть частично из-за миграции клеток на мозг среза микросреды (рис 4). Мы также показали, что это совместное культивирование может быть использован в качестве количественного анализа путем расчета кратное изменение числа клеток за неделю в культуре в течение определенных регионах среза, или для всего среза головного мозга (фиг.6) Предварительные результаты из нескольких Типы опухолевых клеток показали, что количество опухолевых клеток может быть определена количественно с помощью конфокальной микроскопии втолстый ломтик 200 мкм из-за того, что клетки мигрируют только на глубину 20-50 мкм из в срезе.
Мы обнаружили, что зеленые флуоресцентные микросферы эффективный контроль за изменениями в ломтик топографии, потому что они не показывают движение или изменение в количестве на протяжении всего времени в культуре (рисунок 5). После закрепления сотрудничества культуры, окрашивание можно сделать, чтобы изучить опухолевые клетки в микроокружения головного мозга и воздействия наркотиков на пролиферацию опухолевых клеток, клеточной смерти, или изменения в экспрессии белка (рисунок 7). Мы показали, что этот анализ может быть использован для проверки лекарственной терапии путем сравнения мыши медуллобластомой клетках, обработанных с Smo (Smoothened) антагониста LDE225 (Sonidegib) или с контрольным носителем. Кратное увеличение числа клеток на срез над одной недели в культуре количественно и графически (число клеток на День числа 7 / клеток на 1 день) Эти данные показывают, что в значительной степени де LDE225Количество складок опухолевых клеток по сравнению с контролем 6. Этот эффект может также рассматриваться в представительных изображений, включенных (рисунок 8). Мы также показываем, изображения медуллобластомой клеток человека, выращенных в культуре Кусочек теста (рисунок 9).
Рисунок 3. Опухоли головного мозга / Органотипической фрагмент Совместное культивирование Анализ конструкции. (А) Органотипической сагиттальной срез мозга от P6 мыши находится непосредственно на полу-пористой мембраны и среднего добавляется к нижней части чашки для культивирования. Культуру погружен в среду с одной стороны, и доступна кислорода с другой стороны. Меченые клетки опухоли накладными на количество срез и клетка может следовать в течение долгого времени. (В) В культуре, срез поддерживает организацию ткани, который очень похож, что наблюдается в естественных условиях. Preservatioп микросреды мозга свидетельствует EDU маркировки пролиферативных предшественников гранул нейронов во внешней гранул слоя (EGL) мозжечка в культуре среза. В культуре среза, эти клетки-предшественники включать аналог тимидина Edu, как было наблюдать в естественных условиях на данном этапе развития (P6) (белая стрелка указывает EGL). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Человеческий астроцитомы Клетки опухоли головного мозга / Органотипической фрагмент Совместное культивирование анализа. Увеличение человека клеток опухоли головного мозга на срезе могут отражать Релокализация опухолевых клеток от мембраны к культуре среза. (А) Область на краю ломтик на 1 день (сверху) и День 7 (внизу), где клетки могут м igrate из мембраны на срез головного мозга. (б) второй пример возможного миграции клеток на головном мозге на краю среза. День 1 (сверху) и День 7 (внизу). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. микросфер управления бусы. День 1 (красный) и День 7 управления (зеленый) изображения флуоресцентных микросфер накладываются (желтый), чтобы выявить никакого движения микросфер в течение недели в культуре. 1 день и день за последние 7 снимки были сделаны в том же положении в срезе (Масштаб бар = 45 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. Количественная в ImageJ. (А) Изображение среза открыт в ImageJ и вся кусочек и / или регионы описаны для количественного. (Б) область интереса выбирается и дубликат изображения производится. (С ) фоновой флуоресценции вычитается из образа. (D) порог установлен по размеру и форме клеток, определения того, что будет учитываться. (Е) Анализ частиц для подсчета количества клеток в пределах области, представляющей интерес. Fold изменение количества клеток, то можно рассчитать путем деления числа клеток на 7-й день по количеству клеток на 1 день для каждой области интереса или по всей площади среза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре ,
Рисунок 7. Окрашивание для распространения. Изображение пример того, как окрашивание (после фиксации кусочек в PFA) может успешно быть сделано на срезе через неделю в культуре. Изображение показывает DAPInuclear окрашивание (синий), красный флуоресцентно меченных мыши медуллобластомой клетки, и зеленый маркировка для включения тимидина в ДНК аналога в качестве маркера для пролиферации. EDU был включен в срез культуры средств массовой информации (10 мкм) в течение одной недели (белые стрелки указывает клетки положительные для EDU и желтые стрелки указывают клетки негативные для EDU) (Масштаб бар = 50 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого фигура.
Рисунок 8. Мышь Medulloblas Toma клеток, обработанных LDE225. Этот показатель демонстрирует медикаментозное лечение опухолевых клеток в системе срез наложения анализа. (А) Графическое представление данных, собранных из эксперимента мыши медуллобластома. ДМСО было состояние управления (CTL) и LDE225 (Sonidegib) (1 мкМ) (LDE) был состояние обращение. Кратное увеличение числа клеток по срезу в течение одной недели в культуре количественно (число клеток на 7-й день количества / клеток на 1 день), (N = 12 CTL, N = 13 LDE, Столбики ошибок = SEM). (Б) представитель Изображения управления транспортным средством, получавших ломтиками в 1 день (сверху) и День 7 (внизу). (С) Типичные изображения ЛДУ лечение ломтики на 1 день (сверху) и 7 день (нижней). Изображения были приняты на 4-кратным увеличением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
9 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 53304 / 53304fig9.jpg "/>
Рисунок 9. Человеческий медуллобластомой клеток в опухоли мозга / Органотипической Slice Co-культуре. Клетки человека медуллобластомы были получены от Джеймса М. Олсон в университете Вашингтона, и выращивали в течение одной недели в культуре Кусочек теста. (А) 1-й день изображение медуллобластомы клетки человека, выращенные на срезе мозга мыши. (б) изображение того же среза мозга мыши с медуллобластомой клеток человека после одной недели в культуре (день 7). Изображения были приняты на 4-кратным увеличением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает, как опухоли головного мозга, клетки могут быть флуоресцентно меченных и высевали на сагиттальной разделе мозга Р6 мыши, а затем мониторинг в течение одной недели в культуре. Эта опухоль головного мозга / Органотипической срез совместное культивирование анализ может быть использован для определения влияния микроокружения на региональном числа опухолевых клеток, а также могут быть использованы в качестве системы для измерения эффективности новых лекарственных средств на рост опухоли человека. Предыдущие исследования использовали подобную стратегию, чтобы оценить роль мозга микро-среды на нервной 7,8 пролиферации предшественник.
Этот анализ, в котором клетки опухоли головного мозга высевают в органотипической культуре среза 9 обеспечивает систему для выращивания человека клеток опухоли головного мозга, которые трудно распространяться в нормальных условиях культивирования клеток. Одним из важнейших аспектов этой процедуры является важность поддержания здоровья срез и опухолевых клеток. Длина времени, ломтики сидеть в буфере в течение Dissection и при комнатной температуре в течение визуализации должно быть ограничено, чтобы убедиться, что ломтики и клетки остаются здоровыми, как это возможно. Если первичные человека клетки опухоли головного мозга, используются в данном анализе клетки должны быть высевали на ломтики, как можно скорее после биопсии. Поэтому кусочки должны быть подготовлены до операции. Для предотвращения дифференциальный эффект времени между кусочками изображений, количество времени, проведенного из инкубатора должно быть коротким и последовательным для всех культур в срезов эксперимента. Управление микросфер важны, поскольку они обеспечивают пространственно последовательные знаки в течение долгого времени. Кроме того, искажения в культуре срезов из-за усадки, слезотечение, или складывания очевидны с помощью получения изображения микросфер бисером.
Одним из недостатков этого протокола является то, что клетки можно размножать только в этом среза культуральной системе в течение приблизительно одной недели. Тем не менее, для некоторых типов опухолей головного мозга, это значительное улучшение по сравнению текущего состояния OF дела. Второе ограничение в том, что гематоэнцефалический барьер устраняется, который является важным фактором при оценке препаратов, которые могут быть использованы для лечения опухолей головного мозга. Третье соображение то, что это низкий анализа пропускной способности и не может быть использована для тестирования библиотеки соединений.
Этот анализ является универсальным и легко модифицировать для изучения различных типов опухолевых клеток и различные следственные вопросы. Этот протокол может быть использован в качестве количественного анализа для изучения последствий новых методов лечения на выживание опухолевых клеток и роста (ВС и др., Личное сообщение). Сравнение сгиба изменением количества опухолевых клеток в различных областях головного мозга обеспечивает способ расшифровки эффекты микроокружения на рост опухоли.
Эта опухоль головного мозга / органотипической ломтик система совместного культивирования также обеспечивает возможность исследовать взаимосвязь между клеток опухоли головного мозга и конкретных микросреды мозга. МассачусетсТипы NY опухолей головного мозга показывают особый характер развития в конкретные регионы мозга и микросреды 3,4. При выращивании меченых опухолевых клеток человека на сагиттальной ломтик мозга мыши, клетки могут быть проверены для регионального предпочтения, которые могут быть в соответствии с региона в естественных условиях роста. Дальнейшее изучение микросреды, что опухолевые клетки предпочитают может привести к выявлению потенциальных факторов, которые поддерживают рост опухолевых клеток. Этот анализ может помочь в улучшении в пробирке условий культивирования клеток и может также обеспечивать систему для изучения, как инициирование опухоли можно предотвратить или лечить более эффективно.
Есть определенные типы опухолей головного мозга, которые не могут быть размножены в обычных условиях культивирования клеток или с помощью мыши или ортотопической подкожных ксенотрансплантатов. Для этих типов опухолей трудно испытать новые лекарственные терапии на опухолевые клетки человека. Этот протокол показывает, что человеческие клетки опухоли головного мозга могут быть выращены в срезекультура и анализа медикаментозное лечение может быть оценена количественно. После медикаментозного лечения, совместно окрашивание опухолевых клеток может обеспечить дальнейшую оценку эффекта препарата на пролиферацию опухолевых клеток и ингибирования пути. Недавние исследования показали, что могут быть резкое различие между эффектом препаратов на раковые клетки в нормальном культуры клеток против монослой 3D-гетерогенной клеточной культурной среды 10. Аналогично взрослых нормальных и опухолевых эпителиальных клеток, которые имеют короткий срок службы в пробирке, как было показано, условно перепрограммировать, чтобы пролиферативного состояния при выращивании на фибробластов фидерных клеток в сочетании с ингибитором киназы Rho 11. Эти исследования в дальнейшем поддерживать важность поддержания опухолевых клеток в органотипической, 3D, клинически значимых микросреды, и актуальность этой системы для культивирования клеток в текущем исследовании рака. Таким образом, это является ценным анализа для тестирования препаратов на опухолевые клетки человека в клинически relevanт способом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Invitrogen | 17504044 | |
| Glucose | Invitrogen | 17502048 | |
| Pennicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Neurobasal-A- Medium minus phenol red | Invitrogen | 12349015 | |
| Low Melting Point Agarose | Promega | V2111 | |
| Slice Culture Inserts | Milipore | PICM0RG50 | |
| laminin | Invitrogen | 23017015 | |
| Cm-DiI | Invitrogen | V22888 | |
| EDU (Labeling and Detection) | Life Technologies | c10337 | |
| Microspheres | Life Technologies | F-21010 | |
| Vibratome | Leica | ||
| Confocal Microscope | Nikon Eclipse Ni C2si | ||
| ImageJ software | |||
| 5 mm Cover Glasses | Fisher Scientific | 64-0700 (CS-5R) |
References
- Heddleston, J. M., et al. Glioma stem cell maintenance: the role of the microenvironment. Curr Pharm Des. 17 (23), 2386-2401 (2013).
- Sasai, K. Shh pathway activity is down-regulated in cultured medulloblastoma cells: implications for preclinical studies. Cancer Res. 66 (8), 4215-4222 (2006).
- Louis, D. N., et al. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system. Acta Neuropathol. 114 (2), 97-109 (2007).
- Duffau, H., Capelle, L. Preferential brain locations of low-grade gliomas. Cancer. 100 (12), 2622-2626 (2004).
- Chourmouzi, D., et al. Manifestations of pilocytic astrocytoma: a pictorial review. Insights Imaging. 5 (3), 387-402 (2014).
- Buonamici, S., et al. Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma. Sci Transl Med. 2 (51), 51ra70 (2010).
- Choi, Y., Borghesani, P. R., Chan, J. A., Segal, R. A. Migration from a mitogenic niche promotes cell-cycle exit. J Neurosci. 25 (45), 10437-10445 (2005).
- Chan, J. A., et al. Proteoglycan interactions with Sonic Hedgehog specify mitogenic responses. Nat Neurosci. 12 (4), 409-417 (2009).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three- dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nat Commun. 6, 6220 (2015).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
