Introduction
Senaste cancerforskning har gjort betydande framsteg i att identifiera genetiska mutationer, molekylära förändringar och möjliga behandlingar för en mängd olika hjärntumörer. Trots dessa framsteg, hjärntumörer förblir en av de främsta orsakerna till cancerrelaterad dödlighet för vuxna och barn. Begränsande faktorer i hjärntumör forskning är den begränsade tillgången på primärpatientprover och cellinjer och svårigheten att replikera den unika och heterogena hjärnmikro i tillgängliga experimentella system. För många hjärntumörer de villkor som krävs för att upprätthålla tumörceller över tiden är ännu inte kända. Även för hjärntumörer som kan odlas i cellsuspensionen som neurosfärer, kan odlingsbetingelser påverka tumörcellerna 1,2. Faktum att tillsats av basisk fibroblasttillväxtfaktor eller epidermal tillväxtfaktor uppmuntra proliferation och hämma differentiering kan förändra genuttryck 1. Andra metoder för tumörcelltillväxt sådansom tumörutbredning hos möss via orthotopic eller subkutan xenograft av tumörceller är värdefulla analyser, men begränsas av sådana faktorer som tiden för tumörutveckling (särskilt för lågvärdiga tumörer), kostnader, och antalet tumörceller som kan injiceras och studerade . Således nuvarande metoder för odling av humana hjärntumörceller är otillräckliga för att upprätthålla vissa tumörtyper, och ger ofta artificiella miljöer som inte efterlikna in vivo tumör miljöer.
Olika typer av barnhjärntumörer växer i högt specialiserade platser i hjärnan [3, 4] och detta kommer sannolikt att återspegla olika microenvironmental krav för tumörtillväxt [5]. Detta protokoll beskriver ett nytt system där celler som är svåra att föröka i normala odlingsbetingelser kan odlas i en organotypisk hjärnmikromiljö som imiterar in vivo-tumörtillväxtbetingelser. I denna kvantitativa analys, fluorescensmärkthjärntumörceller stryks ut på unga mus hjärnan organotypiska skivor och övervakas över tiden. Denna analys kan användas för att undersöka effekten av mikro på tumörtillväxt, och för att testa nya läkemedelsterapier i en kliniskt relevant hjärnmikro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Följande förfarande som inbegriper djurförsök gjordes i enlighet med National Institutes of Health riktlinjer och godkändes av Dana-Farber Cancer Institutional Animal Care och användning kommittén. Alla försökspersoner arbete granskats av Institutional Review Board kommittéer Brigham and Women sjukhus och Dana-Farber Cancer Institute, och av Stanford University för lämplig användning, som informerade samtycke erhölls från alla ämnen när det behövs, och lämplig upphävande av samtycke krav erhölls för minimal riskstudier.
Timeline av Slice kultur protokollet:
Figur 1. Tidslinje av hjärntumör / Organotypiska Slice Co-kultur protokollet. Denna siffra visar tidslinjen för den del kulturförfarandet omfattar alla åtta dagar of experimentet och viktigaste stegen i förfarandet. Tidslinjen är i förhållande till dag 0 när cellerna ströks ut på skivan för att understryka vikten av att börja proceduren dagar innan plätering cellerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
1. Dissektion Buffert
- Förbered 15 mM HEPES (1 M), 6,5 mg / ml glukos, 1,3 mM MgSO4 (1 M), 20 mM KCI (2 M) och 1% penicillin / streptomycin i 1x HBSS.
- Justera pH till 7,4 med NaOH.
- Filtrera och förvara vid -20 ° C.
2. Slice Kultur Media
- Förbered 2% B-27, 1% N2 tillägg, 1% penicillin / streptomycin, 1% Glutamax, och 1,5 mg / ml glukos i Neurobasal-A Medium minus fenol Red.
- Filtrera och förvara vid -20 ° C. Tina efter behov, och kasseras efter en vecka vid 4 ° C.
Obs: Följande procedur kan göras upp till dene dagen innan dissekering. - 3% lågsmältande agaros
Obs: Följande procedur kan göras upp till en dag innan dissekering. - Blanda 0,9 g låg smältpunkt agaros i ~ 31 ml dissektion buffert, mikrovågsugn för 25 sek med lock löst. Mikrovågsugn tills smält och se till att blandningen inte svämma över.
- Förvara vid 55-65 ° C tills det behövs.
Obs: Följande procedur kan göras upp till en dag innan dissekering.
4. Smörj Slice Kultur Skär med laminin
Obs: Följande procedur kan göras upp till en dag innan dissekering.
- I en vävnadsodling huva, med hjälp av steril pincett, placera en bit kultur insats i varje brunn i en 6-brunnar (matcha antalet skivor du tänker skaffa, cirka 12 kan hämtas från en procedur. Följande förfarande är skriven för sex skivor). Fyll en 15 ml konisk t Ube med 1 x PBS (800 pl / insats) och tillsätt laminin (10 | ig / ml).
- Lägg 800 pl av laminin blandningen till början av varje skiva odlingsinsatsen. Inkubera vid 37 ° C tills de behövdes.
5. Förberedelse för Dissection
- Fyll varje brunn i en 6-brunnsplatta med 1200 | il skiva odlingsmedier. Fyll oanvända brunnar med 1200 il PBS och fylla det centrala utrymmet av plattan med 5 ml 1x PBS. Förvara plattan vid 37 ° C.
- Sterilisera dissektion verktyg i 70% etanol. Torka vibratome blad med aceton för att avlägsna olja och sterilisera före användning.
- Placera tre 35 mm 2 rätter och fem 10 cm 2 vävnadsodlingsskålar i motorhuven. Fyll en 10 cm 2 skålen med dissektion buffert och placera på is.
Obs: Process pups en i taget.
6. Dissektion
Obs: Process pups en i taget.
es / ftp_upload / 53.304 / 53304fig2.jpg "/>
Figur 2. Dissection Cuts. Dessa bilder visar de nödvändiga dissekering nedskärningar för att ta bort skallen från hjärnan av en P6 mus. Cuts visas som prickade linjer. (A) Skär en visas. Cuts 1 och 2 är tillverkade av hjärnstammen / posteriort bilateralt ansluter till ögonhålan på varje sida .. (b) stycken 3 och 4 visas. Klipp 3 är tillverkad av en ögonhålan till andra anslutnings Cuts 1 och 2. Klipp 4 börjar vid mittlinjen skär 3 och fortsätter mot nästippen dela skallen mellan luktsinnet glödlampor (Skala bar = 4,4 mm). Vänligen Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Söva P6 musen med isofluran exponering (100% isofluran). Efter ca 5 min andning är långsammare eller om det finns inga tecken på andning, snabbt halshuggamus med vass sax. Spraya huvudet med 70% etanol och placera i en vävnadsodlingsskål.
- Använda stora trubbiga pincett hålla huvudet stadigt genom att ta tag i näsan. Med hjälp av medelstora dissektion sax, ta bort överflödig hud för att avslöja skallen.
- Göra nedskärningar 1 och 2 genom att skära skallen bilateralt, från bakre delen av skallen mot framsidan på varje sida, som förbinder den skurna till ögonhålan. Håll spetsen på saxen så nära skallen som möjligt för att undvika vävnadsskada.
- För snitt 3, använder små våren sax för att ansluta nedskärningar 1 och 2. Använd sedan de små trubbiga pincett för att försiktigt dra av skallen.
- Med hjälp av små våren sax, skär försiktigt resterande skallen längs mittlinjen på toppen, så att resterande skallen blir 2 halvor (Figur 2, klipp # 4). Använd pincett dra av skallen för att avslöja de två luktsinnet glödlampor.
- Sätt i en platt-faced spatel (fuktad med dissektion buffert, så vävnad inte hålla fast vid det) mellan bottom av hjärnan och basen av skallen, försiktigt bort hjärnan och placera i skålen som innehåller dissektion buffert på is.
- Upprepa steg 6 för att erhålla en andra hjärna för skivning
7. Bädda hjärnorna i agaros
- Placera två av de 35 mm 2 rätter öppna på isen och torka ett par stora trubbiga pincett med 70% etanol.
- Häll 3% låg smältpunkt agaros (framställd i steg 3) i de två rätter tills en kupol bildas på toppen. Set timer för 3 minuter. Vid 3 minuter (testet genom att trycka på kanten av agarosen fyllda kupol, om kan observeras polymerisation av agaros, är den klar) plocka upp en hjärna med trubbiga pincett och plats i sidan av en agaros fyllda 35 mm maträtt, sedan flytta det till mitten av skålen (detta tar bort överflödigt dissektion buffert runt hjärnan så det monterar bättre).
- Upprepa för 2: a hjärnan. Starta en timer för 10 minuter.
- Efter 10 minuter, in en platt spatel i utrymmet mellanagaros och skålen pop ut den polymeriserade agarosen innehåller P6 hjärnor.
- Använd en platt rakblad för att trimma agarosen i en kub runt hjärnan, att se till att kanterna är så rak som möjligt.
- Placera superlim på vibratome plattan i två band. Sedan plocka upp agarosen monterad hjärnan och försiktigt släppa den ner över limmet, positionerat för sagittal skivor. Gör samma sak för den andra hjärnan. Se till att båda hjärnor är uppradade med varandra.
- Låt limmet torka vid rumstemperatur under 5-8 minuter. Under denna tid, fyll isen hållaren område vibratome med krossad is och vatten.
8. Skiva med Vibratome
- Placera skär reservoaren i isen hållaren området, flytta fliken till höger för att låsa den på plats.
- Använda det cirkulära skruvmejsel, plocka upp den cirkulära vibratome plattan med hjärnor limmade på den, och montera den i behållaren. Ta bort skruvmejseln och säkra plattan på plats med the sexkantskalle skruvmejsel. Se till att plattan och skärbehållaren är ordentligt på plats.
- Använda pincett, pickup vibratome bladet, passa in i skärhuvudet, lås fast med sexkantiga skruvmejsel. Sedan säkra skärhuvudet med den bifogade bladet på vibratome med den runda skruven.
- Ta fram positionen för rakhyveln till så nära agaros-inbäddade hjärnor som möjligt, och samtidigt se till rakhyveln är på samma höjd (eller strax ovanför) hjärnan. Fyll kammare med tillräckligt kall dissekera buffert för att täcka bladet.
- Tryck ↕ en gång på knappen (du bör se det blinka, den här knappen definierar gränser när bladet kommer att gå fram och tillbaka), tryck och håll "Framåt" för att klippa den inbäddade hjärnan släpper manuellt tills rakhyveln rensar agarosen blocket. Tryck omedelbart ↕ knappen igen, detta kommer att definiera slutet av intervallet för automatisk skärning.
- Tryck på "SINGLE / CONT" -knappen en gång och light av CONT borde gå vidare. Ställ klipp tjocklek 400-450 um, vibrerande frekvens till 5,5-6 och hastighet till 4. Det blir beskärningsinställningen.
- Tryck på knappen "start / stopp" en gång, och automatisk skärning ska börja. Tryck "paus" för att samla vävnad med användning sked med hål, efter behov. Det bör ta omkring 5-10 minuter, för att nå närmare mittlinjen. Vid denna punkt, trycker du på "paus" och ändra hastigheten till tre och ändra tjockleken till 200 um. Inte samla den första skivan som producerats efter att ha gjort denna förändring.
- De önskade skivor av 200 um tjocklek kommer att ha luktbulben genom lillhjärnan snyggt definierade. Överför varje önskad skiva när de skärs i 6-brunnsplattor fyllda med dissektion buffert på is. Gör detta genom att flytta bufferten i skivkammaren runt vävnaden att flyta skivan, röra vid den så lite som möjligt, lyft den ur bufferten när det är rakt över hålslev. Typiskt omkring 12 segment med de önskade strukturerna kan samlas. Skivorna kan lämnas i dissekera buffert på is under upp till 20 minuter.
- Medan skivorna på is, ta ut 6-brunnars platta med skär är belagd med laminin från 37 ° C inkubator. I dissektion huva kassera laminin noga med att inte skada skären. Add 3,5 ml av skiva odlingsmedia till början av varje insats. Den översta delen av media kommer att bilda en kupolform utan att spilla ut i brunnarna.
9. Plätering Segment på skären
- Använda hålslev verktyget, placera en hjärna skiva i media på insatsen, försiktigt trycka segmentet vara helt under vatten. Upprepa för alla segment.
- Använd en P1000 för att dra ut 1 ml av skiva odlingsmedier från toppen av insatsen och dispensera den in i botten av brunnen. Ta bort och kasta överskottet media tills kanterna av agarosen runt hjärnan slicebecome synliga. Gör detta för de återstående segment.
- Plocka upp than sätter av kanten med pincett, lutning och ta bort överflödigt material. Sedan, snabbt överföra in insatsen i 35 mm 2 skål innehållande 1 ml av skiva odlingsmedia. Använd 2 par vassa pincett för att ta bort agarosen runt vävnaden, noga med att inte sträcka / skador skiva eller peta ett hål i membranet (enklast om du gör en tår vid kanten av agarosen, sedan dra isär agarosen från vardera sidan). Flytta sedan insatsen tillbaka till 6-brunnar och upprepa för de återstående segment.
- I en vävnadsodling huva med fläkten av (för att undvika skivor från uttorkning) avlägsna agaros fragment från varje membran.
- Överför skivorna till 6-brunnars platta som framställts i steg 5,1 och lagra plattan vid 37 ° C. Inkubera skivor för 24-48 timmar.
10. Ändring av Slice Kultur Media
- Upprepa steg 5,1 med en färsk 6-brunnar.
- I en vävnadsodling huva med från fläkten, överför skären till nya 6-brunnars plattor fortsaining ny skiva media.
11. Plating tumörceller på skiva
- Sonikera Cm-Dil färgämne och snurra på medelhastighet under 2 min.
- Spinn ner tumörceller som används för överlagringen vid 201 xg under 5 minuter. Sedan återsuspendera i 2 ml skiva odlingsmedia.
- Lägg 7 pl av Cm-DII i de 2 ml celler och media och inkubera vid 37 ° C under 20 minuter.
- Spinn ner cellerna vid 201 xg under 5 min och återsuspendera i 200 pl skivning media. Finfördela försiktigt dissociera cellerna (10-20 gånger eller tills pelleten är borta) och lägg sedan till 800 pl skiv media för att göra 1000 il total volym.
- Räkna livskraftiga tumörceller med användning av trypanblått. Lägg grönt fluorescerande mikrosfärer till tumörceller, vid samma koncentration som celler. Dessa inerta mikrosfärer kommer att fungera som en kontroll. Centrifugera ner cellen / mikrosfärblandningen vid 201 xg under 5 min och återsuspendera i önskad mängd skiva odlingsmedier. Plate celler vid en densitet av 6000 celler / slis i 65 pl volym. Antalet celler utstrukna per skiva kan ökas beroende på önskemål och tillgänglighet.
- I vävnadsodling huva avstå celler i 65 pl av media / skiva på mitten av skivan.
12. Imaging och fastställande
Obs: en Nikon Eclipse Ni C2si upprätt konfokal användes för att ta en stor bild genomsökning av hela sagittala skiva på 4X med röda och gröna fluorescerande kanaler. Om scanning funktion är inte tillgänglig, ta flera bilder i följd över skiva och senare sy bilderna tillsammans i Photoshop (med placeringen av mikrosfärer och kanten av den del att navigera).
- Nästa dag (dag 1 imaging), överföra skivor i sex 35 mm 2 rätter med 1 ml skiva odlingsmedium. Bild varje skiva i taget på den fluorescerande upprätt mikroskop. Ta en stor bild genomsökning av hela sagittala skiva på 4X med röda och gröna fluorescerande kanaler. Håll laseroch förstärkningsinställningar densamma för varje skiva. I slutet av bildbehandling, överföra alla segment tillbaka till en 6-brunnar innehåller ny skiva media.
- Om tillsats av EDU, andra spridnings markör eller drogtillstånd önskas, skapa ett lager av skiva media med läkemedel som kommer att användas för media ändras dagligen för behandling tillståndet. Behandlings villkor bör införas i steg 12,1 (direkt efter dag 1 imaging). Alla EDU eller proliferation markör bör läggas till medierna också börjar vid 12,1 och uppdateras dagligen (använd EDU vid 10 ^ M).
- Bilden igen på dag 7 med samma inställningar som Dag 1 bilder.
- Efter Dag 7 avbildning är klar flyttar varje skiva i en 6-brunnsplatta med vardera brunn innehållande 1,2 ml av 4% paraformaldehyd (PFA). Försiktigt och långsamt släppa ytterligare 1 ml PFA på toppen av varje skiva. Lämna vid RT under 1 timme.
- Ta bort PFA från varje brunn och från toppen av varje skiva. Tvätta varje brunn 3x med PBS. Förvara skivorna i PBS vid4 ° C för färgning eller montering på objektglas.
Obs: ImageJ inställningar kan behöva justeras och optimeras för att redogöra för bild och mikroskop kvalitet samt tumörcellstorlek.
13. Kvantifiering av bilder (Använda ImageJ)
Obs: ImageJ inställningar kan behöva justeras och optimeras för att redogöra för bild och mikroskop kvalitet samt tumörcellstorlek.
- I ImageJ använder polygonverktyget att beskriva hela skivan eller den region som du vill att kvantifiera. Lägg till detta val till ROI manager där du kan byta namn på den och spara den.
- Högerklicka på det markerade området och välj kopiera. Namnge denna kopia med den regionen, skiva, dag. Tryck Ctl + Skift + E för att visa konturen, välj sedan Process - subtrahera bakgrund - Rullande boll Radius = 4.
- Efter bakgrundssubtraktion, välj "justera tröskeln" i "Bild" rullgardinsmenyn. Kontrollera mörk bakgrund -; titta på bilden zoomas in och sätta gränsen. När du ställer in tröskeln genom att flytta tröskel bar, se till att alla celler ingår / markerade men extremt små prickar som är skräp (eller mindre än en cell) ingår inte. Använd samma tröskel för alla bilder. Flytta tröskel luckan åt sidan.
- Välj "Process" - "Hitta Maxima" och ställ in buller toleransen mellan 5 och 10 och kontrollera följande: Förhandsgranska punkt, typ utdata som segmenterade partiklar, utesluta kant maxima, ovanför lägre tröskel. Sedan markera regionen av intresse genom att trycka på CTRL + Skift + E.
- Välj "Analysera Partiklar" från Analysera rullgardinsmenyn. Ställ in pixelstorleken till 4-40 och cirkel till 0,00-1,00. Även klicka på "Visa overlay konturer" "visa resultat" och "sammanfattar", tryck sedan på OK.
- Registrera alla rådata och sammanfattningen i ett Microsoft Office-dokument. Den "Räkna" för varje region is behövs för att beräkna faldig förändring under veckan i kulturen.
- Upprepa denna process för alla bilder och intresseområden, att se till att tröskeln och andra inställningar förblir konsekvent.
- Beräkna faldig förändring av cellantalet på skiva under veckan i odling genom att dividera antalet tumörceller på segmentet på dag 7 med antalet celler på skivan på dag 1. På liknande, faldig förändring i cellantal inom varje region beräknas genom att dividera antalet celler i den regionen på dag 7 med antalet celler i den regionen på dag ett.
- Utför steg 13,8 för mikrosfärer också. Mikrosfär nummer på skivan bör vara densamma på dag 7 som Dag 1 (Vik förändring = 1). På samma sätt bör mikrosfärnummer inom varje region vara densamma på dag 7 som Dag 1 (Vik förändring = 1). Om Vik förändring skiljer sig från en indikerar detta förändringar i skiva topografi över tiden.
14. Färgning
- Tejpa en bit parafilm på the laboratoriebänk och rita sex cirklar med en flytande blockerare pap penna (en för varje skiva, precis större än storleken på en skiva). Placera cirka 400 l PBS i en prick i mitten av varje cirkel. Antal eller märka cirklarna för att identifiera varje segment.
- I 1 ml PBS, använda ett rakblad för att skära en fyrkant runt skiva, lämnar utrymme av membranet runt skivan. Använd pincett flytta skära ut skiva in i den första cirkeln och lägg försiktigt segmentet ovanpå bubblan PBS. Det är viktigt att se till att segmentet inte vikas över sig själv eller få vänt upp och ned under denna process. Ta sedan bort PBS underifrån skivan och placera den på toppen av den del och lägga till fler PBS om det behövs för att se till att det förblir nedsänkt. Upprepa detta steg för varje skiva.
- Gör 10 ml av 3% BSA i PBS. Ta ut 2 ml och tillsätt 100 l av digitonin till det. Blanda och lägg till skivor för att blockera och permeabilisering, 30 min vid RT.
Obs: Användning av andra Permeabilization medel såsom Triton X-100 kommer att resultera i förlust av CM-DII märkning. - Avlägsna permeabilization / blockeringslösning och skölj 3x med PBS under 10 minuter.
- Om färgning för EDU, följ anvisningarna från satsen för att montera blandningen. Applicera blandningen under 45 minuter. Om färgning med andra antikroppar, måste protokollet optimeras för koncentrationen av primära och sekundära antikroppar (~ 1 tim RT för primär och sekundär). Skölj 3x med PBS under 10 minuter.
- Fläcken med DAPI en: 1000 i PBS under 5 minuter RT. Skölj 2x med PBS.
15. Montering av skivor
- Överför skiva till ett objektglas. Se till att sidan av membranet med skivan fortfarande uppåt, och inte vika över sig själv. Rita en ram runt segmentet med en flytande blockerare pap penna.
- Placera ett litet glas täckglas (5 mm) på varje sida av den del (för att hålla skivan skadas). Drop två eller tre droppar Fluoromount-G (för immunofluorescens) ovanpåslice att bara knappt täcka det. Täck sedan slice lång täck (24 x 50 mm).
- Upprepa för varje skiva. Försegla kanterna av objektglasen med nagellack och förvara vid 4 ° C. Gör konfokal avbildning av färgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta avsnitt exemplifierar den typ av resultat som kan förväntas från användning av hjärntumör / organotypic slice co-kultur för att undersöka regionala mikro önskemål samt att testa nya terapier. Vi visar att analysen är utformad för att reproducera mikromiljön för hjärntumörer, som vävnadsorganisation och proliferativt tillstånd av den del bibehålls (figur 3). Vi visar också att en ökning av antalet tumörceller på skiva med tiden delvis kan bero på migrering av celler på hjärnan skiva mikro (Figur 4). Vi har också visat att detta samarbete kultur kan användas som en kvantitativ analys genom att beräkna faldig förändring av antalet celler under veckan i kultur för specifika regioner i skiva, eller hela hjärnan slice (Figur 6) Preliminära resultat från flera tumörcelltyper har visat att antalet tumörceller kan kvantifieras genom konfokal avbildning avden 200 | j, m tjock skiva på grund av det faktum att cellerna endast migrera till ett djup av 20 till 50 | im in i segmentet.
Vi har funnit att grönt fluorescerande mikrosfärer är en effektiv kontroll för förändringar i slice topografi eftersom de visar ingen rörelse eller förändring av antalet hela tiden i kultur (Figur 5). Efter fastställande av co-kultur, kan färgning göras för att undersöka tumörceller i en hjärna mikro och effekterna av läkemedel på tumörcelltillväxt, celldöd, eller förändringar i proteinuttryck (Figur 7). Vi har visat att denna analys kan användas för att testa drogterapier genom en jämförelse av mus medulloblastom celler behandlade med en Smo (Smoothened) -antagonist LDE225 (Sonidegib) eller med en vehikelkontroll. Faldig ökning av cellantalet på segmentet under en vecka i kultur kvantifieras och återges grafiskt (cellantal på dag 7 / cell nummer på dag 1) Dessa data visar att LDE225 kraftigt deveck antalet tumörceller i jämförelse med kontroll 6. Denna effekt kan också ses i de representativa bilder ingår (Figur 8). Vi visar också bilder på humana medulloblastom celler odlade i skiva kultur-analysen (figur 9).
Figur 3. hjärntumör / Organotypiska Slice Samodling Assay design. (A) Organotypiska sagittala hjärnskiva från en P6 mus placeras direkt på ett semiporöst membran och medium sätts till botten av odlingsskålen. Kulturen är nedsänkt i mediet på en sida och är tillgänglig för syre från den andra sidan. Märkta tumörceller överlagras på skiva och mobilnummer kan följas över tiden. (B) I kultur, segmentet har en vävnads organisation som liknar den som observerades in vivo. Preservation av hjärnan mikro demonstreras av edu märkning av proliferativa granulat neuron prekursorer i den yttre granulskiktet (EGL) av lillhjärnan i skiva kultur. I bit kultur, dessa prekursorceller införliva tymidinanalog edu, som skulle observeras in vivo på detta utvecklingsstadium (P6) (vit pil indikerar EGL). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Human astrocytomceller i hjärntumör / Organotypiska Slice Co-kultur analys. En ökning av humana hjärntumörceller på skivan kan återspegla relocalization av tumörceller från membranet till skiva kultur. (A) Ett område i utkanten av en bit dag 1 (överst) och Dag 7 (nederst) där celler får m igrate från membranet på hjärnan skiva. (B) Ett andra exempel på möjliga cellmigration på hjärnan vid kanten av segmentet. Dag 1 (överst) och Dag 7 (botten). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Mikrosfär kontrollgranula. Dag 1 (röd) och Dag 7 (grön) kontroll bilder av fluorescerande mikrosfärer överlagras (gul) för att avslöja några rörelser av mikrosfärerna över en vecka i kultur. Dag 1 och dag 7 bilder togs vid samma position inom segmentet (Skala bar = 45 nm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Kvantifiering i ImageJ. (A) Bilden av en skiva öppnas i ImageJ och hela skiva och / eller regioner beskrivs för kvantifiering. (B) Regionen av intresse väljs och duplicera bilden görs. (C ) Bakgrunden fluorescens subtraheras från bilden. (D) Tröskelvärdet ställs in för cellstorlek och form, att fastställa vad som kommer att räknas. (E) Analysera partiklar för att räkna antalet celler inom regionen av intresse. Faldig förändring av cellantalet kan sedan beräknas genom att dividera antalet celler på dag 7 av antalet celler på dag 1 för varje region av intresse eller hela området av den del. Klicka här för att se en större version av denna siffra .
Figur 7. Färgning för spridning. Bild exemplifierar hur färgning (efter fixering segmentet i PFA) kan med framgång göras på skiva efter en vecka i kultur. Bilden visar DAPInuclear färgning (blå), röd fluorescerande mus medulloblastom celler och grön märkning för inkorporering av tymidinanalog i DNA som en markör för spridning. ENE ingick i segmentet odlingsmedier (10 ^ M) för en vecka (vita pilar indikerar celler positiva för EDU och gula pilarna visar celler negativa för EDU) (Skala bar = 50 pm). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8. Mus Medulloblas Toma celler som behandlats med LDE225. Denna siffra visar läkemedelsbehandling av tumörceller i segmentet overlay analyssystemet. (A) Grafisk representation av data som samlats in från en mus medulloblastom experiment. DMSO var kontrollgrupp (CTL) och LDE225 (Sonidegib) (1 M) (LDE) var behandlingsbetingelse. Faldig ökning av cellantalet på segmentet över en vecka i odling kvantifierades (cellantal på dag 7 / cellantal på dag 1), (n = 12 CTL, n = 13 LDE, Felstaplar = SEM) (B) representanten. bilder av fordonskontrollsystem behandlade skivor på Dag 1 (överst) och Dag 7 (botten). (C) Representativa bilder av LDE behandlade skivor på Dag 1 (överst) och Dag 7 (botten). Bilder togs vid 4X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
9 "src =" / filer / ftp_upload / 53304 / 53304fig9.jpg "/>
Figur 9. Human medulloblastom celler i hjärntumör / Organotypiska Slice Co-kultur. Humana medulloblastom celler erhölls från James M. Olson vid University of Washington, och odlades under en vecka i skiva kultur analysen. (A) Dag 1 bild av humana medulloblastom celler som odlats på musen hjärnan skiva. (B) en bild av samma mus hjärnan skiva med humana medulloblastom celler efter en vecka i kultur (Dag 7). Bilder togs vid 4X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver hur hjärntumörceller kan fluorescensmärkt och ströks ut på en sagittala hjärnsektion av en P6 mus och därefter övervakas med avseende en vecka i kultur. Denna hjärntumör / organotypic skiva sam-odlingsanalys kan användas för att bestämma effekten av regionala mikromiljö på tumörcellantalet och kan även användas som ett system för mätning av effektiviteten av nya läkemedelsbehandlingar på human tumörtillväxt. Tidigare studier har använt en liknande strategi för att bedöma betydelsen av hjärnans mikromiljö på neurala prekursor spridning 7,8.
Denna analys i vilken hjärntumör celler sås i en organotypisk bit kultur 9 tillhandahåller ett system för odling av humana hjärntumörceller som är svåra att föröka i normala cellodlingsbetingelser. En kritisk aspekt av detta förfarande är att det är viktigt att bibehålla hälsan hos slice och tumörcellerna. Den tid som skivorna sitter i buffert under dissection och vid RT under avbildning bör begränsas, så att skivorna och celler förblir så friska som möjligt. Om primära humana hjärntumörceller används vid denna analys, bör cellerna pläteras på skivorna så snart som möjligt efter biopsi. Därför skivorna bör utarbetas före operationen. För att förhindra differentiella effekten av imaging tid bland skivor, den tid som tillbringats utanför kuvösen bör vara kort och konsekvent för alla slice kulturer i ett experiment. Kontrollerna mikrosfär är viktiga eftersom de ger rums konsekventa varumärken över tiden. Dessutom snedvridningar i bit kultur på grund av krympning, bristningar, eller vikning är uppenbara genom att avbilda mikrosfär pärlor.
En av begränsningarna i detta protokoll är att cellerna endast kan förökas i denna bit odlingssystem för ungefär en vecka. Icke desto mindre är detta en signifikant förbättring jämfört med den nuvarande tillståndet O för vissa typer av hjärntumörerf frågor. En andra begränsning är att blod-hjärn-barriären elimineras, vilket är en viktig faktor vid utvärdering av läkemedel som kan användas för behandling av hjärntumörer. Ett tredje övervägande är att detta är en genomströmningsanalys låg som inte kan användas för att testa ett bibliotek av föreningar.
Denna analys är mångsidig och lätt modifieras för att studera olika typer av tumörceller och en mängd olika undersökande frågor. Detta protokoll kan användas som en kvantitativ analys för att undersöka effekterna av nya terapier på tumörcellöverlevnad och tillväxt (Sun et al., Personlig kommunikation). En jämförelse av den faldig förändring av antalet tumörceller i distinkta regioner av hjärnan tillhandahåller ett förfarande för att dechiffrera effekterna av mikromiljö på tumörtillväxt.
Denna hjärntumör / organotypic slice samodlingssystemet ger också möjlighet att undersöka förhållandet mellan hjärnan tumörceller och specifika hjärnmikromiljöer. MaNY typer av hjärntumörer visar ett tydligt mönster av att utveckla i specifika delar av hjärnan och mikromiljöer 3,4. Genom att odla märkta humana tumörceller på ett sagittalt mushjärna skiva, kan celler övervakas för regionala preferenser, vilka kan vara förenliga med regionen in vivo av tillväxten. Ytterligare undersökning av mikro att tumörcellerna föredrar skulle kunna leda till identifiering av potentiella faktorer som stödjer tumörcelltillväxt. Denna analys kan hjälpa till att förbättra i cellodlings vitro förhållanden och kan också ge ett system för att studera hur tumörinitiering kan förebyggas eller mer effektivt behandlas.
Det finns vissa typer av hjärntumörer som inte kan förökas under normala cellodlingsbetingelser eller med musen orthotopic eller subkutana xenografter. För dessa tumörtyper är det svårt att testa nya läkemedelsterapier på humana tumörceller. Detta protokoll visar att humana hjärntumörceller kan odlas i segmentetodlingsanalys och läkemedelsbehandlingar kan bedömas kvantitativt. Efter läkemedelsbehandling, co-färgning av tumörcellerna kan ge ytterligare utvärdering av läkemedlets effekt på tumörcelltillväxt och väg inhibition. Nyligen genomförda studier har visat att det kan finnas en drastisk skillnad mellan en narkotika effekt på cancerceller i en normal monolager cellkultur vs. en 3D heterogen cellodlingsmiljö 10. På liknande vuxna normala och tumörepitelceller, vilka har en kort livslängd in vitro, har visat sig villkor omprogrammera till ett proliferativt tillstånd när den odlas på fibroblast matarceller i kombination med en Rho-kinashämmare 11. Dessa studier stödjer ytterligare vikten av att upprätthålla tumörceller i en organotypisk, 3D, kliniskt relevant mikro, och relevansen av denna cellodlingssystem till aktuell cancerforskning. Därför är detta en värdefull analys för att testa läkemedel på humana tumörceller i ett kliniskt relevant sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Invitrogen | 17504044 | |
| Glucose | Invitrogen | 17502048 | |
| Pennicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Neurobasal-A- Medium minus phenol red | Invitrogen | 12349015 | |
| Low Melting Point Agarose | Promega | V2111 | |
| Slice Culture Inserts | Milipore | PICM0RG50 | |
| laminin | Invitrogen | 23017015 | |
| Cm-DiI | Invitrogen | V22888 | |
| EDU (Labeling and Detection) | Life Technologies | c10337 | |
| Microspheres | Life Technologies | F-21010 | |
| Vibratome | Leica | ||
| Confocal Microscope | Nikon Eclipse Ni C2si | ||
| ImageJ software | |||
| 5 mm Cover Glasses | Fisher Scientific | 64-0700 (CS-5R) |
References
- Heddleston, J. M., et al. Glioma stem cell maintenance: the role of the microenvironment. Curr Pharm Des. 17 (23), 2386-2401 (2013).
- Sasai, K. Shh pathway activity is down-regulated in cultured medulloblastoma cells: implications for preclinical studies. Cancer Res. 66 (8), 4215-4222 (2006).
- Louis, D. N., et al. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system. Acta Neuropathol. 114 (2), 97-109 (2007).
- Duffau, H., Capelle, L. Preferential brain locations of low-grade gliomas. Cancer. 100 (12), 2622-2626 (2004).
- Chourmouzi, D., et al. Manifestations of pilocytic astrocytoma: a pictorial review. Insights Imaging. 5 (3), 387-402 (2014).
- Buonamici, S., et al. Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma. Sci Transl Med. 2 (51), 51ra70 (2010).
- Choi, Y., Borghesani, P. R., Chan, J. A., Segal, R. A. Migration from a mitogenic niche promotes cell-cycle exit. J Neurosci. 25 (45), 10437-10445 (2005).
- Chan, J. A., et al. Proteoglycan interactions with Sonic Hedgehog specify mitogenic responses. Nat Neurosci. 12 (4), 409-417 (2009).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three- dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nat Commun. 6, 6220 (2015).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
