Introduction
Микро возникли как новые терапевтические мишени из-за их универсальной роли в регуляции экспрессии генов и прямое доказательство причастности болезни. МикроРНК активно исследовал их потенциал в качестве лекарственного средства цели 1,2. Кроме того, изменения в экспрессии микроРНК связаны с несколькими заболеваниями 3 и моделирования этих изменений искусственным возмущением выражения микроРНК может быть использован для изучения клеточных путей, вовлеченных в проявлении заболевания. Тканеспецифическую доставка микроРНК, направленных наркотиков в настоящее время является серьезной проблемой для развития, основанного микроРНК наркотиков. Antagomirs и микроРНК имитирует перспективные средства для возмущающих уровней микроРНК 4-6. Тем не менее, особенности, которые повышают свою специфику и эффективность должны быть включены в дизайн antagomirs, прежде чем они могут быть использованы для возмущения в естественных условиях выражения микроРНК.
Микро особенно актуальны в качестве мишеней в настоящее время неизлечимой нейродегенеративных и нервно-развития заболеваний. Барьер гематоэнцефалический представляет ограничение на поставку antagomirs в головном мозге. Стереотаксические инъекции широко используются в моделях грызунов, чтобы доставить молекулы в определенные места в мозге 7. Это требует умения, значительные инвестиции в приборы и времени. Стереотаксические инъекции являются инвазивными, включать операции, вызывает, по меньшей мере незначительные травмы и ограничены локальной доставки. Использование клеточных пептидов проникать с предпочтением, направленных нейронов может противостоять эти ограничения, так как они могут быть доставлены через транс-сосудистой маршруту, но нарушают гематоэнцефалический барьер. Такой пептид, полученный из вируса бешенства гликопротеина (РВГ), ранее был использован, чтобы доставить миРНК против японского энцефалита Вирус у мышей 8. Мы обнаружили, что с помощью пептида по antagomir доставки, микроРНК может быть эффективно в нокдауне в мозге мыши 9.
ontent "> Второй важной задачей из микроРНК нокдаун возникает из-за небольшого размера микроРНК и наличие близкородственных изоформ последовательности. Возьмем пример MMU-Мир-29 семья, которая состоит из трех тесно связанных изоформ, микроРНК-29а , В и С. Antagomirs также обычно модифицируют по магистрали, чтобы увеличить их стабильность и делает их устойчивыми к воздействию нуклеаз. Закрытые нуклеиновых кислот (МШУ) предлагают дополнительное преимущество, что они увеличивают термическую стабильность и даже привести к целевой деградации над и за пространственное затруднение 10. внесения изменений вдоль всего позвоночника может быть эффективным, но дорогим. Ранее мы обнаружили, что модификации вне оптимального числа не может еще больше увеличить эффективность. Конструкция antagomir поэтому предполагает оптимальную модификацию antagomir.Для сложнее antagomir нековалентно с нейротропной пептида, заряженный гептабромированных к Нона-аргинин расширения используется. D-аргининостатки используются, так как они придают высокую стабильность, поскольку они не являются чувствительными к расщеплению протеазами. Гепта- на Нона-аргинин участках действуют как эффективные агенты клеток проникать, хотя они не предоставляют типа клеток специфику. По ковалентного связывания пептида RVG к нона-аргинина линкера, в нейротропных, мобильный проникая пептид был сгенерирован. Положительно заряженные остатки пептида взаимодействовать с отрицательно заряженной основной цепи нуклеиновой кислоты, с образованием комплексов. Эти комплексы могут быть использованы для эффективного трансфекции ДНК или РНК в культивируемые клетки и в естественных условиях в ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Все процедуры в том числе субъектов животных были одобрены Комитетом по этике институциональной животных (ИКАЭ) в Институте геномики и интегративной биологии, Нью-Дели (ИГИБ / AEC / 10/2013). Этот протокол специально учетом адресной доставки Antagomir-29 в головном мозге и нокдаун Мир-29.
1. Стратегия Antagomir Дизайн
- Получить зрелый микроРНК последовательности из miRBase 11 (http://www.mirbase.org/).
- Получить последовательности связанных членов семьи микроРНК, используя "Джин" Семья ссылку в записи miRBase
(Http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009). - Обратный дополнять последовательность: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html предоставляет удобный инструмент дляобратная комплемента последовательности.
- Отметьте позиции для модифицированные LNA, используя следующие правила:
- Выбрать тимин остатков размещенных 3-4 основы, кроме для модификации МШУ, LNA, поскольку пиримидинов являются более стабильными, чем пуринов 12.
- Выберите остатков цитозина, разделенных на 3-4 остатков, если предыдущий шаг производит меньше, чем пять модификаций.
- Приоритетность пять модификаций в конце 5 'antagomir, так как это позволяет избежать последовательности семян.
2. Antagomir-нейропептида Комплексная подготовка
Примечание: Это самый важный шаг в протоколе, и она должна стандартизации. Для стандартизации протокола любой флуоресцентно меченных олигонуклеотидов (FLO) может быть использован вместо antagomir 9. Пептиды следует иметь высокую степень чистоты (ВЭЖХ, чистота 98%) и .Sequences заряд пептида и antagomir приведены в таблице 1.
- Решите число моле из antagomir, который будет введен на основании молярного заряда на antagomir, его токсичности и веса мыши. Рассчитать количество молей пептида, который будет введен на основании молярном соотношении заряда antagomir: пептид.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартизация молярное соотношение зарядов antagomir: пептид токсичности и эффективной доставки в мозг мыши. Используйте различные коэффициенты молярного заряда флуоресцентно меченного олигонуклеотида: пептид для стандартизации. Мы обнаружили, что Antagomir-29 и контроль оба были токсичны в 4microgram / грамм веса тела мыши. Antagomir-29 и управления были использованы в 2microgram / грамм веса тела, но это эффективная концентрация, скорее всего, меняться для каждого микроРНК. - Развести пептида и antagomir в отдельных микроцентрифужные пробирки из маточных растворов с 10% стерильной D-глюкозы к желаемой конечной концентрации в расчете на этапе 1.
- Держите пробирке с раствором пептида на вихря при умеренной скорости встряхиванием.
- Добавьте 1/3 РД в аntagomir решение пептидный раствор трубки, медленно, по каплям, в то время как тщательно смешивают на вихревом смесителе.
- Продолжить перемешивания растворов на вихрь на следующий 1 мин, а затем дайте смеси отстояться в течение 1 мин.
- Повторите шаг 4 и 5 еще два раза, чтобы смешать оставшееся antagomir решение с раствора пептида в той же пробирке. Медленным добавлением является критическим для формирования моно- дисперсных комплексов, которые являются эффективными в трансфекции. Быстрое добавление может привести к агрегации комплексов и их осадков.
- Инкубируйте комплекс в течение 30 мин при комнатной температуре без встряхивания. В течение этого времени инкубации, акклиматизации мышей в лабораторию, где будет выполняться инъекции.
3. хвостовую вену Инъекция Antagomir-нейропептида комплекса
- Для сдержать животное, поместите курсор в фиксатор или decapicone надлежащего размера.
- Очистите поверхность хвоста с помощью ватного тампона прэлектронной замачивают в теплой воде (около 40 ° C). Это будет способствовать расширение кровеносных сосудов и увеличение видимости вены.
- Подойдите хвост с небольшим объемом (0,5 - 1,0 см) инсулина шприц под углом 15-20 ° в. Будьте осторожны, чтобы не вводить какие-либо воздух в шприц. Начало в дистальной части хвоста. Внедрить комплекс. Удалить иглу и применить антисептическим тампона непосредственно в месте инъекции (примерно 5-10 сек), чтобы остановить кровотечение.
- Заменить мышь в отдельности проветриваемом клетке в группе 3-5, с кукурузы в початках и папиросной бумаги, как обогащение. Не держите неинъецированных и вводили мышам в одной клетке.
4. Поведенческие анализы
Примечание: Держите интервал времени 3-4 часа между впрыска и поведенческих тестах, чтобы восстановление после инъекции. Принесите мышь, чтобы тихой комнате. Не беспокоить животных в этот период акклиматизации.
- Акклиматизироваться мышь кНовый номер в течение 30 мин, а затем запустите следующие поведенческие анализов. Держите пробел 10 мин между каждым поведенческой анализа.
- Задних конечностей обхватив:
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот тест показывает дисфункции двигателя и неврологические нарушения.- Поднимите мышь мягко удерживая у основания хвоста в ясном фоне.
- Проверьте положение задних конечностей в течение 10-15 сек. Splays дикого типа мыши задних конечностей от живота, в то время как мыши, как правило, атаксическая отказаться одного или обоих задних конечностей к животу более 50% от времени взвешенных 13.
- Верните мышь в клетку
- Выступ тест:
- Поднимите мышь мягко, держа хвост и держать его на выступе клетке.
- Соблюдайте мышь конкретно на углу клетки. Дикий тип мыши может пройти углы легко без страха и потери равновесия. Атаксический мыши теряют свою баланса, замораживание или качает во время прогулки по клетке выступ и в углах.
- Держите мышь мягко одной рукой и применять краску на задних конечностях кистью.
- Поместите абсорбирующий лист на полу узкой полосы.
- Разрешить мыши, чтобы идти или бежать за абсорбирующий листовой в прямой взлетно-посадочной полосы в от одного конца до другого.
- Повторите процесс еще два раза с каждой мыши с помощью свежего поглощающего листа.
- Измерьте расстояние между двумя последовательными шагами в поступательном движении. Не включать в себя первый и последний несколько следы, где животное просто начала и заканчивая свой бег, соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя методику, представленные здесь, комплексы 50microgram флуоресцентно-меченного олигонуклеотида (FLO) и ~ 850microgram РВГ пептида молярное соотношение 1:15 заряд (FLO: пептид) получали и вводили только один раз через хвостовую вену. Комплекс без нейротропные бешенства Вирус матрица (РВМ) пептида и FLO был использован в качестве контроля доставки. На следующий день мышам мозга и печени были выделены и суспензии отдельных клеток получали. Клетки наблюдали под микроскопом для зеленой флуоресценции. FLO-РВГ комплекс был успешно доставлен с кратчайшим временем в один день и обнаружении в зеленой флуоресценции в клетках головного мозга, но не в печени (Фигура 2В, 2D), а РВМ пептид поставляемого FLO в печени, но не в клетках мозга ( 2А, 2В).
Для нокдаун Мир-29 в мыши мозга antagomir против микроРНК-29 были разработаны с пяти модификациях LNA. Скремблированный, не микроРНК ориентации последовательность, используемая в качестве заключенного, AntagomirTrol. Комплекс 50microgram Antagomir-контроля или Antagomir-29 с ~ 850microgram RVG пептид был подготовлен и вводят через хвостовую вену в течение 3 дневного курса, с последующим ежедневным анализов поведения, как показано на рисунке 1. В целях достижения максимальной нокдаун эффект, комплексы были вводили один раз в день в течение 3 дней подряд. На четвертый день поведение анализы проводили без инъекций. Мышь анализ показал, след значительное снижение длины шага в Antagomir-29 РВГ вводили мышам (3А-3В). Задних конечностей обхватив анализа в Antagomir-29 RVG вводили мышам ясно показали, атаксический поведение с тенденцией к отказу одного или обоих задних конечностей к животу. В тесте выступ Antagomir-29 РВГ вводят мышам показали замораживания или встряхивания поведение с потерей равновесия в углу клетки. Мышей умерщвляли путем инъекции ксилазина гидрохлорида (16milligram / кг) и тиопентала натрия (80milligram / кг) на четвертый день (24 ч после последней инъекции комплекса).Образцы мозга были использованы для выполнения молекулярной и клеточной анализ. Всего РНК собраны из коры, мозжечка и гиппокампа. Количественный ПЦР в реальном времени Анализ показал четкую снижение уровней экспрессии обоих изоформ Мир-29, Мир-29а (рис 4а) и Мир-29b (рис 4В), в Antagomir-29 РВГ вводили мышам части мозга.
Рисунок 1. Схема для хвоста мыши инъекции вены и поведения.
В целях выявления Мир-29 в головном мозге, Antagomir-управления или Antagomir-29 с РВГ пептида вводили один раз в день в течение 3 последовательных дней через хвостовую вену. Поведенческие тесты проводились ежедневно, после периода 3 ч, чтобы позволить мышь, чтобы оправиться от инъекции. На четвертый день только поведенческие тесты были выполнены и мышей умерщвляли и ткани мозга были собраны для ПЦР в реальном времени и клеточной попун я. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. RVG пептид поставляет флуоресцентно меченных олигонуклеотида специально для мозга мыши.
Используя методику, описанную в этой статье, сложные флуоресцентно меченых олигонуклеотидов (FLO) и пептид, РВГ / РВМ были приготовлены и введены только один раз через хвостовую вену. FLO-РВГ комплекс был обнаружен в зеленой флуоресценции в клетках головного мозга, но не в печени (B, D), а РВМ пептид доставлен FLO в печени, но не мозга (A, C) 9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть больше Версия этой фигуры.
Рисунок 3. микроРНК-29 сбить ведет к атаксический поведения.
След мыши анализы (A) на четвертый день показали четкую снижение расстояния между двумя последовательными шагами для мыши, обработанной Antagomir-29 (B) (**) р <0,001 -Value; п = 3 (рис редактировался 9). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Antagomir-29 и РВГ комплекс вниз регулирует Мир-29 в мозге мыши.
Всего РНК собраны из трех частей головного мозга. Количественный ПЦР в реальном времени анализ проводили для оценки уровней экспрессии обоих изоформ Мир-29, Мир-29а (A) и Мир-29b (B) 9). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| имя | Последовательность | Заряд | Длина |
| RVG-пептид | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGK RASN-ГГГГ-RRRRRRRRR * | 11 + | 41 |
| РВМ-пептид | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSSPASA PLD-ГГГГ-RRRRRRRRR * | 11 + | 40 |
| Antagomir-контроль (Яичница) | 5 'А С Т ВГА CGAC C AA С 3' | 14 - | 14 |
| Antagomir-29 | 5 'С Т переменного тока Г.А. Т ТТ С Т ААА Г.Г. 3' | 16 - | 16 |
| * Аргининостатков у С-терминального конца РВГ и РВМ пептидов в D-форме. | |||
| LNA модифицированные основания в последовательностях Antagomir подчеркнуты. |
Таблица 1. Последовательности пептида и Antagomirs
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Other | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
References
- Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases. Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).
- Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease and other Human CNS Disorders. Current Genomics. 10, 154-168 (2009).
- Soifer, H. S., Rossi, J. J., Saetrom, P. MicroRNAs in Disease and Potential Therapeutic Applications. Mol Ther. 15, 2070-2079 (2007).
- Bader, A. G., Brown, D., Winkler, M. The Promise of MicroRNA Replacement Therapy. Cancer research. 70, 7027-7030 (2010).
- Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3, 1-17 (2012).
- Trang, P., et al. Systemic Delivery of Tumor Suppressor microRNA Mimics Using a Neutral Lipid Emulsion Inhibits Lung Tumors in Mice. Molecular Therapy. 19, 1116-1122 (2011).
- Barbash, S., Hanin, G., Soreq, H. Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome. J Vis Exp. (76), e50170 (2013).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Roshan, R., et al. Brain-specific knockdown of miR-29 results in neuronal cell death and ataxia in mice. RNA. 20, 1287-1297 (2014).
- Kaur, H., Wengel, J., Maiti, S. Thermodynamics of DNA−RNA Heteroduplex Formation: Effects of Locked Nucleic Acid Nucleotides Incorporated into the DNA Strand. Biochemistry. 47, 1218-1227 (2008).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, D140-D144 (2006).
- Kaur, H., Babu, B. R., Maiti, S. Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked Nucleic Acid (LNA). Chemical Reviews. 107, 4672-4697 (2007).
- Guyenet, S. J., et al. A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia. J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Bergen, J. M., Park, I. -K., Horner, P. J., Pun, S. H. Nonviral Approaches for Neuronal Delivery of Nucleic Acids. Pharmaceutical Research. 25, 983-998 (2008).
- Zou, L. -L., Ma, J. -L., Wang, T., Yang, T. -B., Liu, C. -B. Cell-Penetrating Peptide-Mediated Therapeutic Molecule Delivery into the Central Nervous System. Current Neuropharmacology. 11, 197-208 (2013).
- Hwang, D. W., et al. A brain-targeted rabies virus glycoprotein-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of neurogenic microRNA. Biomaterials. 32, 4968-4975 (2011).
