Introduction
מיקרו RNA צמחו כמטרות טיפוליות חדשניות בשל תפקידם האוניברסלי בוויסות של ביטוי גנים וראיה ישירה למעורבות במחלה. MiRNAs הם נבדקות באופן פעיל לפוטנציאל שלהם כתרופת מטרות 1,2. יתר על כן, שינויים בביטוי מירנה קשורים עם כמה מחלות 3 וסימולציה של שינויים אלה על ידי ההפרעות מלאכותיות של ביטוי מירנה ניתן להשתמש כדי ללמוד את מסלולי הסלולר מעורבים בביטוי מחלה. משלוח רקמות ספציפי של תרופות המכוונות למירנה הוא כיום אתגר גדול לפיתוח תרופות המבוסס מירנה. Antagomirs ומחקה מירנה סוכנים מבטיחים לperturbing רמות מירנה 4-6. עם זאת, תכונות מיוחדות המשפרות את הספציפיות והיעילות שלהם צריכה להיות משולבות בעיצוב של antagomirs לפני שהם יכולים לשמש להפרעות בvivo של ביטוי מירנה.
מיקרו RNA רלוונטי במיוחד כמטרות בניווניות חשוכות מרפא כיום ומחלות נוירו-התפתחותית. מחסום דם-המוח מהווה מגבלה למסירת antagomirs במוח. זריקות stereotactic נמצאות בשימוש נרחבת במודלים של מכרסמים לספק מולקולות למקומות ספציפיים במוח 7. זה דורש מיומנות, השקעה נרחבת במכשור וזמן. זריקות stereotactic הן פולשני, כוללים ניתוח, לגרום לקטין לפחות פציעה ומוגבלת לאספקה מקומית. השימוש בפפטידים תא חודר עם העדפה לנוירונים מיקוד יכול להתמודד מגבלות אלה שכן הם יכולים להיות מועברים באמצעות מסלול טרנס וכלי דם, אך לפרוץ את מחסום דם המוח. כגון פפטיד נגזר מוירוס הכלבת גליקופרוטאין (RVG), שימש בעבר כדי לספק siRNA כנגד וירוס דלקת מוח יפני בעכברים 8. מצאנו כי השימוש בפפטיד לantagomir משלוח, miRNAs יכול להיות יעיל הפיל במוח העכבר 9.
ontent "> האתגר הגדול השני של מירנה לדפוק למטה נובע מגודלו הקטן של miRNAs ואת הנוכחות של isoforms רצף קשור באופן הדוק. אנחנו לוקחים את הדוגמא של MMU-miR-29 משפחה שמורכבת משלושה isoforms קשור באופן הדוק, miR-29 , B ו- C. Antagomirs גם בדרך כלל שונה לאורך עמוד השדרה כדי להגדיל את היציבות שלהם והופך אותם עמידים להתקפות של nucleases. נעול חומצות גרעין (LNAs) מציעות יתרון נוסף שהם משפרים יציבות תרמית ואף להוביל ליעד השפלה מעל ומעבר הפרעה סטרית 10. היכרות עם שינויים לכל אורך עמוד השדרה יכולה להיות יעילה אך יקר. יש לנו קודם לכן ראו ששינויים מעבר למספר אופטימלי עשויים שלא לשפר את היעילות נוספת. העיצוב של antagomir לכן כרוך השינוי האופטימלי של antagomir.למורכב antagomir לא קוולנטית עם פפטיד neurotropic, יחויב hepta- להארכה נונה-ארגינין משמשת. D-ארגיניןשאריות משמשות מאז שהם מעניקים יציבות גבוהה יותר כפי שהם לא רגישים למחשוף על ידי פרוטאזות. Hepta- למתיחות נונה-ארגינין לפעול סוכני תא חודר יעילים כ, למרות שהם אינם מקנים סגוליות סוג התא. על ידי קוולנטית קישור פפטיד RVG למקשר נונה-ארגינין, neurotropic, פפטיד תא חודר נוצר. שאריות מטען החשמליות חיובי של פפטיד אינטראקציה עם עמוד השדרה חומצות גרעין הטעון השלילי, ליצירת קומפלקסים. מתחמים אלה יכולים לשמש לtransfect יעילות DNA או RNA לתאים בתרבית וin vivo לרקמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל ההליך כוללים נושאי בעלי חיים אושרו על ידי ועדת אתיקה המוסדית בעלי חיים (וא"א) במכון לגנומיקה וביולוגיה אינטגרטיבית, ניו דלהי (IGIB / AEC / 10/2013). פרוטוקול זה מותאם במיוחד עבור משלוח ממוקד של Antagomir-29 במוח ובמציאה של miR-29.
האסטרטגיה עיצוב Antagomir 1.
- אחזר את רצף מירנה בוגר מ -11 miRBase (http://www.mirbase.org/).
- אחזר את הרצפים של בני משפחת מירנה הקשורים באמצעות הקישור "ג'ין המשפחה" בשיא miRBase
(Http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009). - הפוך משלים את הרצף: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html מספק כלי נוח ללהפוך רצפים משלימים.
- סמן את העמדות להיות שונה על ידי השימוש בLNA ההנחיות הבאות:
- בחר שאריות תימין להציב מלבד 3-4 בסיסים לשינוי LNA, מאז pyrimidines LNA הם יציבים יותר מpurines 12.
- בחר שאריות ציטוזין מופרדות על ידי 3-4 שאריות אם שלב קודם מייצר פחות מחמישה שינויים.
- לתעדף חמישה שינויים עד סוף '5 של antagomir, שכן זה ימנע את רצף הזרע.
הכנה מורכבת 2. Antagomir-neuropeptide
שים לב: זהו שלב הקריטי ביותר בפרוטוקול ושהוא צריך תקינה. כדי לתקן את הפרוטוקול כל oligonucleotide שכותרתו fluorescently (FLO) ניתן להשתמש במקום של antagomir 9. פפטידים צריכים להיות של טוהר גבוה (הכיתה HPLC, 98% טוהר) ניתנות .Sequences ואחראי על פפטיד וantagomir בטבלה 1.
- החלט מספר מוles של antagomir להיות מוזרק המבוסס על תשלום טוחנת בantagomir, רעילותו ומשקליו של העכבר. לחשב את מספר השומות של פפטיד להיות מוזרק המבוסס על יחס טוחנת אחראי antagomir: פפטיד.
הערה: סטנדרטיזציה יחס טוחנת אחראי antagomir: פפטיד לרעילות ואספקה יעילה במוח העכבר. השתמש ביחסים שונים תשלום טוחנת של oligonucleotide שכותרתו fluorescently: פפטיד לתקינה. מצאנו שAntagomir-29 ושליטה היו שניהם רעילים במשקל גוף 4microgram / גרם של עכבר. Antagomir-29 ושליטה שמשו במשקל גוף 2microgram / גרם, אבל ריכוז יעיל זה עשוי להשתנות בכל מיקרו-רנ"א. - לדלל את הפפטיד וantagomir בצינורות microfuge נפרדים מפתרונות מניות עם 10% D-גלוקוז סטרילי לריכוז הסופי הרצוי כפי שמחושב בשלב 1.
- שמור את צינור microfuge עם פתרון פפטיד במערבולת במהירות vortexing מתון.
- להוסיף 1/3 שלישי שלפתרון ntagomir לצינור פתרון פפטיד, לאט, טיפה חכם, בזמן שהוא מעורב באופן יסודי על מיקסר מערבולת.
- המשך ערבוב של פתרונות במערבולת דקות 1 הבאות ולאחר מכן לאפשר לתערובת לעמוד במשך דקות 1.
- חזור על השלב 4 ו -5 פעמים נוספות לערבב antagomir פתרון שנותר עם פתרון פפטיד באותו הצינור microfuge. בנוסף האיטי הוא קריטי ליצירת מתחמים מונו לפזר כי הם יעילים בtransfection. בנוסף מהיר יכול להוביל להצטברות של המתחמים והמשקעים שלהם.
- דגירה המורכבת למשך 30 דקות ב RT ללא vortexing. בתקופה זו של דגירה, להתאקלם העכברים למעבדה שבה זריקות תבוצענה.
3. זנב הזרקה לוריד של קומפלקס Antagomir-neuropeptide
- לרסן את החיה, הצב את העכבר בעוצר או decapicone של גודל נכון.
- נקה את פני השטח של הזנב באמצעות יחסי ציבור מקלון צמר גפןבמים חמים (כ -40 מעלות צלזיוס) ספוג דואר. זה יקדם התרחבות ולהגדיל את הנראות של הווריד.
- מתקרב לזנב עם נפח קטן (0.5-1.0 סמ"ק) מזרק אינסולין בזווית 15-20 מעלות. היזהר שלא להציג את כל אוויר לתוך המזרק. התחל בחלק הדיסטלי של הזנב. הזרק המורכב. הסר את המחט ולהחיל ספוגית חיטוי ישירות לאתר ההזרקה (כ 5-10 שניות) כדי לעצור את דימום.
- החלף את העכבר בכלוב מאוורר בנפרד בקבוצה של 3-5, עם קלח התירס ונייר טישו כהעשרה. אין להשאיר עכברי uninjected והזריקו באותו כלוב.
4. מבחני התנהגות
הערה: שמור את המרווח של 3-4 שעות הזמן במבחנים בין הזרקה והתנהגות, כדי לאפשר התאוששות לאחר הזרקה. להביא את העכבר לחדר שקט. נא לא להפריע בעלי החיים בתקופה זו של התאקלמות.
- להתאקלם בעכבר כדיחדר חדש למשך 30 דקות ולאחר מכן להתחיל את מבחני ההתנהגות הבאים. שמור פער של 10 דקות בין כל assay התנהגות.
- צְבִיטָה Hindlimb:
הערה: בדיקה זו מצביעה על בעיות בתפקוד מוטורי וליקוי נוירולוגים.- הרם את העכבר בעדינות על ידי החזקת בסיס ליד הזנב ברקע ברור.
- בדוק את מצב hindlimb במשך 10-15 שניות. מתנפץ עכבר סוג בר hindlimbs מבטן, ואילו עכבר Ataxic נוטה לחזור hindlimbs אחד או שניהם לכיוון הבטן יותר מ -50% מהזמן מושעים 13.
- להחזיר את העכבר לכלוב
- מבחן מדף:
- הרם את העכבר בעדינות על ידי לחיצה על הזנב ולשמור אותו על המדף של כלוב.
- שים לב במיוחד העכבר בפינת הכלוב. עכבר סוג בר יכול לעבור בקלות הפינות בלי פחד ולאבד את שיווי המשקל. עכבר Ataxic לאבד את שיווי המשקל, הקפאתה או מנער תוך כדי ההליכה לאורך מעקה כלוב ובפינות.
- החזק את העכבר בעדינות ביד אחת ולהחיל דיו על הגפיים האחורי על ידי מברשת.
- הנח את גיליון הסופג על רצפת מסלול צר.
- לאפשר עכבר כדי ללכת או לרוץ על גיליון סופג בקו ישר במסלול מקצה אחד לשני.
- חזור על התהליך עוד פעמיים עם כל עכבר באמצעות גיליון סופג טרי.
- מדוד את המרחק בין שני צעדים רצופים בתנועה קדימה. אין לכלול כמה עקבות הראשונות והאחרונה שבו החיה רק ייזום וסיימה הריצה שלה, בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות ההליך שהוצג כאן, מתחמים של oligonucleotide 50microgram שכותרתו fluorescently (FLO) ו~ פפטיד RVG 850microgram של 01:15 יחס תשלום טוחנת (FLO: פפטיד) הוכנו והזריקו רק פעם אחת דרך וריד זנב. מורכב של מטריקס וירוס כלבת אינו neurotropic פפטיד (RVM) וFLO שימש כביקורת משלוח. למחרת, מוח עכברים וכבד היו מבודדים והשעיות תא בודדות היו מוכנות. תאים נצפו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הירוק. מורכב FLO-RVG נמסר בהצלחה עם זמן קצר ביותר של יום אחד וזוהה כקרינה ירוקה בתאי המוח, אך לא בכבד (איור 2, 2D) בזמן שפפטיד RVM נמסר FLO אל הכבד, אך לא בתאי המוח ( איור 2 א, 2 ג).
למציאת miR-29 בantagomir מוח העכבר נגד miR-29 נועדו עם חמישה שינויי LNA. הרצף המקושקשת, לא מירנה המיקוד משמש כAntagomir-קוןTrol. מורכב של 50microgram Antagomir-שליטה או Antagomir-29 עם ~ פפטיד RVG 850microgram הוכן והוחדר דרך וריד זנב במשך זמן 3 ימים, ואחרי מבחני התנהגות יומיומיים, כפי שמוצג באיור 1. על מנת להשיג את האפקט מרבי מציאה, מתחמים היו מוזרק פעם ביום במשך 3 ימים רצופים. ביום הרביעי מבחני התנהגות בוצעו ללא הזרקה. ניתוח טביעת רגל העכבר הראה ירידה משמעותית באורך הצעד של Antagomir-29 RVG הזריק עכברים (איור 3 א-3B). Hindlimb לופת assay של Antagomir-29 RVG הזריק עכברים הראה בבירור התנהגות Ataxic עם נטייה לחזור hindlimbs אחד או שניהם לכיוון הבטן. במבחן מדף Antagomir-29 RVG הזריק עכברים הראה הקפאה או רועד התנהגות עם אובדן שיווי המשקל בפינה של הכלוב. עכברים מורדמים על ידי הזרקה של hydrochloride xylazine (16milligram / קילוגרם) ותיופנטון נתרן (80milligram / קילוגרם) ביום הרביעי (24 שעות לאחר ההזרקה האחרונה של מורכב).דגימות מוח שמשו לביצוע ניתוח מולקולרי ותאי. RNA סה"כ נאסף מקליפה, המוח הקטן וההיפוקמפוס. assay PCR בזמן אמת כמותי הראה ירידה ברורה ברמות הביטוי של שני isoforms של miR-29, miR-29 (איור 4 א) וmiR-29b (איור 4), בRVG Antagomir-29 הזריק חלקי מוח עכברים.
איור סכימה 1. להזרקה לוריד זנב עכבר והתנהגות.
על מנת למקד את miR-29 במוח, Antagomir-שליטה או Antagomir-29 עם פפטיד RVG הוזרקה פעם ביום במשך 3 ימים ברציפות דרך וריד זנב. מבחני התנהגות בוצעו יומי, לאחר תקופה של 3 שעות, כדי לאפשר העכבר כדי להתאושש מהזרקה. ביום הרביעי רק מבחני התנהגות בוצעו ועכברים מורדמים ורקמת המוח נאספה בזמן אמת PCR וסלולארי התחת ays. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. פפטיד RVG מספק שכותרתו fluorescently oligonucleotide במיוחד למוח העכבר.
בשיטה המתוארת במאמר זה, oligonucleotides המורכב של שכותרתו fluorescently (FLO) וRVG פפטיד / RVM הוכנו והזריקו רק פעם אחת דרך וריד זנב. מורכב FLO-RVG זוהה כקרינה ירוקה בתאי המוח, אך לא בכבד (B, D) ואילו פפטיד RVM נמסר FLO אל הכבד, אבל לא המוח (A, C) 9. אנא לחץ כאן לצפייה גדולה יותר גרסה של נתון זה.
her.within עמודים = "1"> 
איור 3. miR-29 להפיל מוביל להתנהגות Ataxic.
מבחני טביעת רגל העכבר () ביום הרביעי הראו ירידה ברורה במרחק בין שני צעדים רצופים לעכבר שטופל בAntagomir-29 (ב) (**) -value p <0.001; n = 3 (איור שונה מ9.) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
4. Antagomir-29 וRVG מורכב איור למטה מסדיר miR-29 במוח עכבר.
RNA סה"כ נאסף משלושה חלקי מוח. assay PCR בזמן אמת כמותי בוצע להעריך רמות ביטוי של שני isoforms של miR-29, miR-29 (א) ו miR-29b (ב) מ9.) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| שֵׁם | סדר פעולות | תַשְׁלוּם | אורך |
| RVG-פפטיד | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGK RASN-GGGG-RRRRRRRRR * | 11 + | 41 |
| RVM-פפטיד | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSSPASA PLD-GGGG-RRRRRRRRR * | 11 + | 40 |
| Antagomir-שליטה (מקושקשת) | 5 'ג AA C CAA T CGAC C 3' | 14 - | 14 |
| Antagomir-29 | 5 'ג T AC GA T TT C AAA T GG 3' | 16 - | 16 |
| * ארגיניןשאריות בסוף C-המסוף של פפטידים RVG וRVM נמצאות בD-צורה. | |||
| בסיסים שונה LNA ברצפי Antagomir הם הדגישו. |
1. רצפי שולחן של פפטיד וAntagomirs
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Other | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
References
- Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases. Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).
- Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease and other Human CNS Disorders. Current Genomics. 10, 154-168 (2009).
- Soifer, H. S., Rossi, J. J., Saetrom, P. MicroRNAs in Disease and Potential Therapeutic Applications. Mol Ther. 15, 2070-2079 (2007).
- Bader, A. G., Brown, D., Winkler, M. The Promise of MicroRNA Replacement Therapy. Cancer research. 70, 7027-7030 (2010).
- Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3, 1-17 (2012).
- Trang, P., et al. Systemic Delivery of Tumor Suppressor microRNA Mimics Using a Neutral Lipid Emulsion Inhibits Lung Tumors in Mice. Molecular Therapy. 19, 1116-1122 (2011).
- Barbash, S., Hanin, G., Soreq, H. Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome. J Vis Exp. (76), e50170 (2013).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Roshan, R., et al. Brain-specific knockdown of miR-29 results in neuronal cell death and ataxia in mice. RNA. 20, 1287-1297 (2014).
- Kaur, H., Wengel, J., Maiti, S. Thermodynamics of DNA−RNA Heteroduplex Formation: Effects of Locked Nucleic Acid Nucleotides Incorporated into the DNA Strand. Biochemistry. 47, 1218-1227 (2008).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, D140-D144 (2006).
- Kaur, H., Babu, B. R., Maiti, S. Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked Nucleic Acid (LNA). Chemical Reviews. 107, 4672-4697 (2007).
- Guyenet, S. J., et al. A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia. J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Bergen, J. M., Park, I. -K., Horner, P. J., Pun, S. H. Nonviral Approaches for Neuronal Delivery of Nucleic Acids. Pharmaceutical Research. 25, 983-998 (2008).
- Zou, L. -L., Ma, J. -L., Wang, T., Yang, T. -B., Liu, C. -B. Cell-Penetrating Peptide-Mediated Therapeutic Molecule Delivery into the Central Nervous System. Current Neuropharmacology. 11, 197-208 (2013).
- Hwang, D. W., et al. A brain-targeted rabies virus glycoprotein-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of neurogenic microRNA. Biomaterials. 32, 4968-4975 (2011).
