Introduction
MicroRNAs zijn ontstaan als nieuwe therapeutische targets te wijten aan hun universele rol in de regulering van genexpressie en direct bewijs voor de betrokkenheid bij de ziekte. MiRNAs worden actief onderzocht voor hun potentieel als drug targets 1,2. Verder, veranderingen in miRNA expressie zijn geassocieerd met verschillende aandoeningen 3 en simulatie van deze veranderingen door kunstmatige verstoring van miRNA expressie kan worden gebruikt om de cellulaire routes betrokken bij de ziekte manifestatie bestuderen. Weefsel specifieke aflevering van miRNA targeting drugs is momenteel een grote uitdaging voor miRNA gebaseerde ontwikkeling van geneesmiddelen. Antagomirs en miRNA bootst zijn veelbelovend agenten voor verstoren miRNA niveaus 4-6. Echter, speciale functies die hun specificiteit en doeltreffendheid te verbeteren hebben in het ontwerp van antagomirs op te nemen voordat ze kunnen worden toegepast voor in vivo verstoring van miRNA expressie.
MicroRNAs zijn vooral relevant als doelen in momenteel ongeneeslijke neurodegeneratieve en neuro-ontwikkelingsstoornissen ziekten. De bloed-hersenbarrière vormt een beperking voor de levering van antagomirs de hersenen. Stereotactische injecties worden veel gebruikt in diermodellen om moleculen op specifieke locaties te leveren in de hersenen 7. Het vereist vaardigheid, omvangrijke investeringen in instrumentatie en tijd. Stereotactische injecties zijn invasief, betrekken chirurgie, veroorzaken ten minste lichte verwondingen en zijn beperkt tot lokale levering. Het gebruik van mobiele penetrerende peptiden met een voorkeur voor het richten neuronen kunnen deze beperkingen tegengaan aangezien zij door de trans-vasculaire route kan worden geleverd, maar schenden de bloed-hersenbarrière. Een dergelijk peptide afgeleid van het rabiësvirus glycoproteïne (RVG), is eerder gebruikt om siRNA leveren tegen Japanse encefalitis virus bij muizen 8. We vonden dat het gebruik van het peptide voor antagomir levering, miRNAs effectief kan worden neergehaald in muizenhersenen 9.
NHOUD "> De tweede grote uitdaging van miRNA neerhalen komt voort uit de geringe omvang van miRNAs en de aanwezigheid van nauw verwante sequentie isovormen. We nemen het voorbeeld van de MMU-miR-29 familie die bestaat uit drie nauw verwante isovormen, miR-29a , b en c. antagomirs zijn meestal ook gewijzigd langs de ruggengraat om hun stabiliteit te verhogen en ze bestand zijn tegen aantasting door nucleasen render. Locked Nucleic Acids (LNA) bieden een verder voordeel dat de thermische stabiliteit en zelfs leiden tot afbraak over en voorbij richten sterische hindering 10. Invoering wijzigingen langs de hoofdketen effectief maar duur kunnen zijn. Wij hebben eerder gezien dat modificaties voorbij een optimaal aantal niet verder verbeteren van de werkzaamheid. Het ontwerp van de antagomir gaat dus om optimale aanpassing van de antagomir.Om de complexe antagomir niet-covalente wijze met de neurotrope peptide, een geladen hepta- tot nona-arginine extensie wordt gebruikt. D-Arginineresiduen worden gebruikt omdat daarmee een hogere stabiliteit zij niet gevoelig zijn voor splitsing door proteasen. Hepta- tot nona-arginine trajecten dienen als efficiënte cel penetrerende middelen, hoewel ze verleent celtype specificiteit. Door covalente koppeling van het peptide aan het RVG nona-arginine linker, een neurotrope celpenetrerende peptide werd gegenereerd. De positief geladen resten van het peptide interactie met de negatief geladen nucleïnezuur backbone, tot complexen. Deze complexen kunnen worden gebruikt om effectief te transfecteren DNA of RNA in gekweekte cellen en in vivo in weefsels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Let op: Al de procedure met inbegrip van dierlijke onderwerpen zijn door Institutional Dieren Ethische Commissie (IAEC) aan het Institute of Genomics en Integrative Biology, New Delhi goedgekeurd (IGIB / AEC / 10/2013). Dit protocol is specifiek aangepast voor gerichte afgifte van Antagomir-29 in de hersenen en knockdown van miR-29.
1. Antagomir Design Strategy
- Haal de volwassen miRNA sequentie uit miRBase 11 (http://www.mirbase.org/).
- Haal de sequenties van verwante miRNA familieleden via de link "Gene familie" in de miRBase opnemen
(Http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009). - Omgekeerde complement van de sequentie: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html biedt een handig hulpmiddel omreverse complement sequenties.
- Markeren de posities door LNA worden aangepast met behulp van de volgende richtlijnen:
- Kies Thymine resten geplaatst 3-4 basen apart voor de LNA modificatie, omdat LNA pyrimidinen zijn stabieler dan 12 purines.
- Kies cytosineresten gescheiden door 3-4 resten als vorige stap produceert minder dan vijf wijzigingen.
- Prioriteren van de vijf wijzigingen einde van de antagomir de 5 ', aangezien dit voorkomt het zaad sequentie.
2. Antagomir-neuropeptide Complex Voorbereiding
Opmerking: Dit is de meest kritische fase in het protocol en standaardisatie nodig. Het protocol elke fluorescerend gemerkte oligonucleotide (FLO) kan worden gebruikt in plaats van de antagomir 9 standaardiseren. De peptiden moet zeer zuiver zijn (HPLC kwaliteit, 98% zuiver) .Sequences en belast peptide en antagomir zijn in tabel 1.
- Bepaal het aantal moles van antagomir te injecteren op basis van molaire lading op antagomir, de toxiciteit en het gewicht van de muis. Bereken het aantal mol peptide worden geïnjecteerd gebaseerd op molaire ladingsverhouding van antagomir tot: peptide.
OPMERKING: Standaardiseren molaire lading verhouding van antagomir: peptide voor toxiciteit en effectieve levering in de hersenen van muizen. Gebruik verschillende molaire lading verhoudingen van fluorescent gelabelde oligonucleotide: peptide voor standaardisatie. We vonden dat Antagomir-29 en de controle waren allebei giftig bij 4microgram / gram lichaamsgewicht van de muis. Antagomir-29 en de controle werden gebruikt 2microgram / gram lichaamsgewicht, maar deze effectieve concentratie kan variëren voor elke microRNA. - Verdun het peptide en antagomir in afzonderlijke microfugebuizen van voorraadoplossingen met steriele 10% D-glucose om de gewenste eindconcentratie zoals berekend in stap 1.
- Houd de microcentrifugebuis met het peptide-oplossing op een vortex bij matige snelheid vortexen.
- Voeg 1/3 van de antagomir oplossing voor de peptide oplossing buis, langzaam, druppelsgewijs, terwijl het grondig wordt gemengd op een vortex mixer.
- Zet mengen van oplossingen op de vortex gedurende 1 minuut volgende en laat vervolgens het mengsel gedurende 1 min staan.
- Herhaal stap 4 en 5 twee keer om de resterende antagomir oplossing met de peptide-oplossing in dezelfde microcentrifugebuis mengen. De langzame toevoeging is essentieel voor de vorming van mono-disperse complexen die effectief transfectie zijn. Snelle toevoeging kan leiden tot aggregatie van de complexen en de neerslag.
- Incubeer het complex 30 min bij kamertemperatuur zonder te vortexen. Gedurende deze incubatietijd, acclimatiseren de muizen naar het laboratorium waar de injectie zal worden uitgevoerd.
3. staartader Injectie van Antagomir-neuropeptide Complex
- Om het dier te beperken, plaatst u de muis in een restrainer of decapicone van de juiste grootte.
- Reinig het oppervlak van de staart met behulp van wattenstaafje pre-geweekt in warm water (ongeveer 40 ° C). Dit zal vaatverwijding bevorderen en de zichtbaarheid van de ader.
- Benader de staart met een klein volume (0,5-1,0 cc) insulinespuit in een 15-20 ° hoek. Wees voorzichtig eventuele lucht niet in te voeren in de spuit. Begin bij de distale deel van de staart. Injecteren van het complex. Verwijder de naald en een antiseptische wattenstaafje direct op de plaats van injectie (ongeveer 5-10 sec) om het bloeden te stoppen.
- Vervang de muis in een afzonderlijk geventileerde kooi in de groep 3-5, met maïskolf en tissuepapier als verrijking. Heeft geïnjecteerde en geïnjecteerde muizen niet te houden in dezelfde kooi.
4. Behavioural Testen
Opmerking: Bewaar het tijdsinterval van 3-4 uur tussen injectie en gedragsmatige testen om het herstel na de injectie toe te staan. Breng de muis om een rustige kamer. Hebben de dieren niet storen tijdens deze periode van acclimatisatie.
- Acclimatiseren de muis om denieuwe kamer gedurende 30 minuten en dan beginnen de volgende gedrags-assays. Dient een ruimte van 10 minuten tussen elke gedrags assay.
- Achterbeen clasping:
OPMERKING: Deze test geeft motorische stoornissen en neurologische stoornissen.- Til de muis voorzichtig door het houden van de buurt basis van de staart in de heldere achtergrond.
- Controleer het achterbeen positie voor 10-15 sec. Wildtype muis splays achterpoten vanaf buik, terwijl een atactisch muis neiging om één of beide achterpoten trekken naar het abdomen meer dan 50% van de tijd gesuspendeerd 13.
- Breng de muis naar de kooi
- Ledge-test:
- Til de muis voorzichtig door het houden van de staart en houd het op de rand van een kooi.
- Let op de muis die specifiek op de hoek van de kooi. Wild-type muis kan de hoeken gemakkelijk zonder angst en verlies van de balans. Ataxic muis verliest zijn evenwicht, bevriezen of schudt tijdens een wandeling langs de kooi richel en op de hoeken.
- Houd de muis voorzichtig met de ene hand en opbrengen van inkt op de achterpoten met een borstel.
- Plaats de absorberende laag op de vloer van een smalle baan.
- Laat de muis om te wandelen of lopen over een absorberende blad in een rechte lijn in een start-en landingsbaan van de ene naar de andere.
- Herhaal dit proces nog twee keer bij elke muis met verse absorberende laag.
- Meet de afstand tussen twee opeenvolgende stappen in de voorwaartse beweging. Do eerste en de laatste paar voetafdrukken omvatten niet waar het dier is gewoon het initiëren en afwerking zijn looppas, respectievelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de hier gepresenteerde procedure, complexen van 50microgram fluorescent gelabelde oligonucleotide (FLO) en ~ 850microgram RVG peptide van 1:15 molaire lading ratio: waren (FLO peptide) bereid en geïnjecteerd slechts eenmaal door staartader. Complex van niet-neurotropic rabiësvirus Matrix (RVM) peptide en FLO werd gebruikt als een afgiftesysteem control. De volgende dag muizen hersenen en de lever werden geïsoleerd en enkele cel suspensies werden bereid. De cellen werden waargenomen onder microscoop groene fluorescentie. FLO-RVG complex werd succesvol afgeleverd met een kortste tijd van één dag en gedetecteerd als groene fluorescentie in de hersencellen, maar niet in de lever (Figuur 2B, 2D) terwijl RVM peptide geleverd FLO naar de lever, maar niet in de hersencellen ( Figuur 2A, 2C).
Om miR-29 knock-down in de hersenen van muizen antagomir tegen miR-29 werden ontworpen met vijf LNA wijzigingen. De gecodeerde, niet-miRNA targeting-sequentie gebruikt als een Antagomir-control. Complex van 50microgram Antagomir-control of Antagomir-29 met ~ 850microgram RVG peptide werd voorbereid en geïnjecteerd door staartader over een 3 dagen de tijd natuurlijk, gevolgd door dagelijks gedrag testen zoals weergegeven in figuur 1. Om een maximale knock-down effect te bereiken, complexen waren eenmaal geïnjecteerd per dag gedurende 3 aaneengesloten dagen. Op de vierde dag werden het gedrag testen uitgevoerd zonder injectie. Mouse footprint analyse toonde significante vermindering van de staplengte van Antagomir RVG-29 geïnjecteerde muizen (Figuur 3A-3B). Achterbeen clasping assay van Antagomir RVG-29 geïnjecteerde muizen toonde duidelijk ataxic gedrag neiging tot één of beide achterpoten naar de buik trekken. In de richel-test geïnjecteerd Antagomir-29 RVG muizen bleek het invriezen of schudden gedrag verlies van evenwicht op de hoek van de kooi. Muizen werden gedood door injectie van xylazine hydrochloride (16milligram / kg) en thiopentonnatrium (80milligram / kg) op de vierde dag (24 uur na de laatste injectie van complex).Hersenmonsters werden gebruikt voor moleculaire en cellulaire analyse. Totaal RNA vanuit cortex, cerebellum en hippocampus. Kwantitatieve real time PCR toonde duidelijke verlaging van de expressieniveaus van beide isovormen van miR-29, miR-29a (figuur 4A) en miR-29b (figuur 4B), in het Antagomir RVG-29 geïnjecteerde muizen hersendelen.
Figuur 1. Schema van de muis staartader injectie en gedrag.
Om miR-29 gericht in de hersenen, werd Antagomir-control of Antagomir-29 met RVG peptide eenmaal daags geïnjecteerd gedurende 3 opeenvolgende dagen tot staartader. Behavioural assays werden dagelijks uitgevoerd, na een periode van 3 uur, zodat de muis om te herstellen van de injectie. Op de vierde dag alleen gedragsproblemen werden uitgevoerd en muizen werden gedood en hersenweefsel werd verzameld voor real-time PCR en cellulaire kontegen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. RVG peptide levert fluorescent gelabelde oligonucleotide specifiek aan muizenhersenen.
Met behulp van de in dit artikel beschreven methode, werden complex van fluorescent gelabelde oligonucleotiden (FLO) en peptide RVG / RVM voorbereid en geïnjecteerd slechts eenmaal door staartader. FLO-RVG complex gedetecteerd als groene fluorescentie in de hersencellen, maar niet in de lever (B, D) terwijl RVM peptide geleverd FLO naar de lever, maar niet de hersenen (A, C) 9. Klik hier om een vergroting versie van deze figuur.
Figuur 3. miR-29 knock down leidt tot de ataxic gedrag.
Muis footprint testen (A) op de vierde dag vertoonden duidelijke vermindering in afstand tussen twee opeenvolgende stappen voor de muis behandeld met Antagomir-29 (B) (**) p-waarde <0,001; n = 3 (Figuur gewijzigd ten opzichte van 9.) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Antagomir-29 en RVG complexe down-reguleert miR-29 in de hersenen van muizen.
Totaal RNA verzameld uit drie hersendelen. Kwantitatieve real time PCR werd uitgevoerd om een schatting expressieniveaus van beide isovormen van miR-29, miR-29a (A) en miR-29b (B) 9.) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Naam | Sequentie | In rekening brengen | Lengte |
| RVG-peptide | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGK RASN-GGGG-RRRRRRRRR * | 11 + | 41 |
| RVM-peptide | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSSPASA PLD-GGGG-RRRRRRRRR * | 11 + | 40 |
| Antagomir-control (Scrambled) | 5 'A C CAA T CGAC C AA C 3' | 14 - | 14 |
| Antagomir-29 | 5 'C AC T GA T TT C AAA T GG 3' | 16 - | 16 |
| * Arginineresiduen aan het C-terminale uiteinde van RVG en RVM peptiden in D-vorm. | |||
| LNA gemodificeerde basen in de Antagomir sequenties zijn onderstreept. |
Tabel 1. Sequenties van peptide en antagomirs
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Other | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
References
- Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases. Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).
- Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease and other Human CNS Disorders. Current Genomics. 10, 154-168 (2009).
- Soifer, H. S., Rossi, J. J., Saetrom, P. MicroRNAs in Disease and Potential Therapeutic Applications. Mol Ther. 15, 2070-2079 (2007).
- Bader, A. G., Brown, D., Winkler, M. The Promise of MicroRNA Replacement Therapy. Cancer research. 70, 7027-7030 (2010).
- Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3, 1-17 (2012).
- Trang, P., et al. Systemic Delivery of Tumor Suppressor microRNA Mimics Using a Neutral Lipid Emulsion Inhibits Lung Tumors in Mice. Molecular Therapy. 19, 1116-1122 (2011).
- Barbash, S., Hanin, G., Soreq, H. Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome. J Vis Exp. (76), e50170 (2013).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Roshan, R., et al. Brain-specific knockdown of miR-29 results in neuronal cell death and ataxia in mice. RNA. 20, 1287-1297 (2014).
- Kaur, H., Wengel, J., Maiti, S. Thermodynamics of DNA−RNA Heteroduplex Formation: Effects of Locked Nucleic Acid Nucleotides Incorporated into the DNA Strand. Biochemistry. 47, 1218-1227 (2008).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, D140-D144 (2006).
- Kaur, H., Babu, B. R., Maiti, S. Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked Nucleic Acid (LNA). Chemical Reviews. 107, 4672-4697 (2007).
- Guyenet, S. J., et al. A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia. J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Bergen, J. M., Park, I. -K., Horner, P. J., Pun, S. H. Nonviral Approaches for Neuronal Delivery of Nucleic Acids. Pharmaceutical Research. 25, 983-998 (2008).
- Zou, L. -L., Ma, J. -L., Wang, T., Yang, T. -B., Liu, C. -B. Cell-Penetrating Peptide-Mediated Therapeutic Molecule Delivery into the Central Nervous System. Current Neuropharmacology. 11, 197-208 (2013).
- Hwang, D. W., et al. A brain-targeted rabies virus glycoprotein-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of neurogenic microRNA. Biomaterials. 32, 4968-4975 (2011).
