Introduction
MicroRNAs har dukket opp som nye terapeutiske mål på grunn av sin universelle rolle i regulering av genekspresjon og direkte bevis for engasjement i sykdom. Mirnas blir aktivt utforsket for sitt potensial som legemiddel rettet mot 1,2. Videre er endringer i miRNA uttrykk forbundet med flere sykdommer 3 og simulering av disse endringene ved kunstig forstyrrelse av miRNA uttrykk kan benyttes for å studere de cellulære veier som er involvert i sykdomsmanifestasjonen. Vevsspesifikk levering av miRNA rettet mot narkotika er i dag en stor utfordring for miRNA basert legemiddelutvikling. Antagomirs og miRNA etterligner er lovende agenter for perturbing miRNA nivåer 4-6. Imidlertid spesielle egenskaper som forbedrer deres spesifisitet og effekt må bli innlemmet i utformingen av antagomirs før de kan anvendes for in vivo forstyrrelse av miRNA uttrykk.
MicroRNAs er spesielt relevant som mål i dag uhelbredelig nevrodegenerativ og nevroutviklingsmessige sykdommer. Blod-hjerne-barrieren utgjør en hindring for levering av antagomirs i hjernen. Stereotaktisk injeksjon er mye brukt i gnagermodeller å levere molekyler til bestemte steder i hjernen 7. Det krever dyktighet, omfattende investeringer i instrumentering og tid. Stereotaktiske injeksjoner er invasiv, involverer kirurgi, føre til minst mindre skade, og er begrenset til lokal levering. Bruken av celle penetrerende peptider med en preferanse for målretting neuroner kan motvirke disse begrensningene, siden de kan leveres via trans-vaskulære ruten, men bryter blod-hjerne barrieren. Et slikt peptid avledet fra Rabies virus glykoprotein (RVG), ble tidligere brukt til å levere siRNA mot japansk encefalitt Virus i mus 8. Vi fant at bruk av peptid for antagomir levering, kan mirnas være effektivt slått ned i musen hjernen 9.
ontent "> Den andre store utfordringen miRNA knock-down oppstår fra den lille størrelsen på mirnas og tilstedeværelsen av nært beslektede sekvens isoformer. Vi tar eksempelet med MMU-Mir-29 familien som består av tre nært beslektede isoformer, Mir-29a , b og c. Antagomirs blir også generelt modifisert langs ryggraden for å øke deres stabilitet og gjøre dem motstandsdyktige mot angrep av nukleaser. Låst Nucleic Acids (LNAs) har en ytterligere fordel at de forbedrer termisk stabilitet og med føre til målet degradering over og utover sterisk hindring 10. Innføring modifikasjoner langs ryggraden kan være effektive, men kostbart. Vi har tidligere sett at modifikasjoner utover et optimalt antall, kan ikke ytterligere å øke effektiviteten. Utformingen av antagomir involverer derfor den optimale modifikasjon av antagomir.Til komplekse antagomir ikke-kovalent med neurotropisk peptid, et ladet hepta- til Nona-arginin extension brukes. D-Argininerester blir brukt siden de gi bedre stabilitet som de ikke er utsatt for spaltning av proteaser. Hepta- til nona-arginin strekninger fungere som effektive celle penetrerende midler, selv om de ikke gi celletype spesifisitet. Ved kovalent å knytte RVG peptidet til nona-arginin linker, en neurotropisk, celle penetrerende peptid ble dannet. De positivt ladede rester av peptidet interagere med den negativt ladede nukleinsyre ryggrad, for å danne komplekser. Disse kompleksene kan benyttes til effektivt å transfektere DNA eller RNA i dyrkede celler og in vivo i vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: All prosedyren inkludert dyr fag har blitt godkjent av Institutional Dyr Ethics Committee (IAEC) ved Institutt for Genomics og Integrative Biology, New Delhi (IGIB / AEC / 10/2013). Denne protokollen er spesielt justert for målrettet levering av Antagomir-29 i hjernen og knockdown av Mir-29.
1. Antagomir Design Strategy
- Hente den modne miRNA sekvensen fra miRBase 11 (http://www.mirbase.org/).
- Hente sekvenser av relaterte miRNA familiemedlemmer ved hjelp av "Gene Family" i miRBase posten
(Http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009). - Omvendt utfylle sekvensen: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html gir et praktisk verktøy for årevers komplement sekvenser.
- Markere posisjoner for å bli endret av LNA hjelp av følgende retningslinjer:
- Velge tymin rester er lagt 3-4 baser hverandre for LNA modifikasjon, ettersom LNA pyrimidiner er mer stabile enn puriner 12.
- Velg cytosinrestene adskilt med 3-4 rester hvis forrige trinn produserer mindre enn fem modifikasjoner.
- Prioritere de fem modifikasjoner til 5'-enden av den antagomir, siden dette unngår frøet sekvensen.
2. Antagomir-neuropeptide Complex Forberedelse
Merk: Dette er den mest kritiske trinn i protokollen og det er behov for standardisering. For å standardisere protokollen noen fluorescens merket oligonukleotid (FLO) kan brukes i stedet for antagomir 9. Peptidene bør være av høy renhet (HPLC, 98% renhet) .Sequences og ladning av peptid og antagomir er gitt i tabell 1.
- Bestemme antall moles av antagomir skal injiseres basert på molar ladning på antagomir, dets toksisitet og vekten av musen. Beregne antall mol peptid som skal injiseres, på grunnlag av mol-ladning-forhold på antagomir: peptid.
MERK: Standard molar kostnad ratio på antagomir: peptid for giftighet og effektiv levering i musen hjernen. Bruk ulike molar lade prosenter av fluoresceinmerket oligonukleotid: peptid for standardisering. Vi fant ut at Antagomir-29 og kontroll var både giftige på 4microgram / gram kroppsvekt av mus. Antagomir-29 og kontroll ble anvendt ved 2microgram / gram kroppsvekt, men denne effektive konsentrasjonen er egnet til å variere for hver mikroRNA. - Fortynn peptidet og antagomir i adskilte mikrofugerør fra stamløsninger med steril 10% D-glukose til den ønskede sluttkonsentrasjon som beregnet i trinn en.
- Hold mikrosentrifugerør med peptidet løsning på en virvel ved moderat hastighet virvling.
- Legg 1/3 av enntagomir løsning til peptidoppløsningen røret, langsomt, dråpevis, mens det blandes grundig på en vortex-blander.
- Blanding fortsettes av løsninger på vortex i neste 1 min, og deretter la blandingen stå i 1 min.
- Gjenta trinn 4 og 5 ytterligere to ganger for å blande den gjenværende antagomir løsning med peptidløsningen i samme mikrosentrifugerør. Den langsomme tilsetningen er kritisk for dannelse av mono-disperse komplekser som er effektiv i transfeksjon. Rapid tillegg kan føre til aggregasjon av kompleksene og deres utfelling.
- Inkuber komplekset i 30 minutter ved romtemperatur uten virvling. I løpet av denne tiden for inkubasjon, akklimatisere musene til laboratoriet hvor injeksjoner vil bli utført.
3. Tail Vein Injeksjon av Antagomir-neuropeptide Complex
- Å holde dyret, plasserer du muse i en rainer eller decapicone av riktig størrelse.
- Rengjør overflaten av halen ved hjelp av bomullspinne pre-dyppet i varmt vann (ca. 40 ° C). Dette vil fremme vasodilatasjon og øke synligheten av venen.
- Approach halen med et lite volum (0,5 - 1,0 cm) insulinsprøyte med en 15-20 ° vinkel. Vær forsiktig med å innføre noe luft inn i sprøyten. Start ved den distale delen av halen. Injisere komplekset. Fjern kanylen og bruke en antiseptisk pinne direkte til injeksjonsstedet (ca 5-10 sek) for å stoppe blødninger.
- Erstatte musen i et individuelt ventilerte bur i gruppe 3-5, med maiskolbe og silkepapir som berikelse. Ikke holde uinjiserte og injisert mus i samme bur.
4. Atferds Analyser
Merk: Hold tidsintervall på 3-4 timer i mellom injeksjon og atferdsmessige analyser for å tillate utvinning etter injeksjon. Ta med musen til et stille rom. Ikke forstyrr dyrene i denne perioden av akklimatisering.
- Akklimatisere musen tilnye rommet i 30 minutter og deretter starte følgende atferds analyser. Hold en avstand på 10 min mellom hver atferdsanalyse.
- Bakben spenne:
MERK: Denne testen indikerer motorisk dysfunksjon og nevrologisk svekkelse.- Løft forsiktig ved å holde musen i nærheten av roten av halen på klar bakgrunn.
- Sjekk bakben posisjon for 10-15 sek. Villtype-mus splays bakbena bort fra magen, mens en ataxic mus en tendens til å trekke tilbake en eller begge bakbena mot magen mer enn 50% av tiden suspendert 13.
- Returner musen til buret
- Ledge test:
- Løft musen forsiktig ved å holde halen og holde den på hylle av et bur.
- Observere musen spesifikt på hjørnet av buret. Villtype mus kan passere hjørnene enkelt uten frykt og miste balansen. Ataxic mus miste sin balanse, fryse eller rister mens jeg gikk langs buret hylle og i hjørnene.
- Hold mus forsiktig med en hånd og gjelder blekk på baklemmene av en børste.
- Plasser absorberende ark på gulvet av en smal rullebane.
- Tillate musen til å gå eller kjøre over et absorberende ark i en rett linje i en rullebane fra den ene enden til andre.
- Gjenta prosessen to ganger med hver mus med ferske absorberende ark.
- Mål avstanden mellom to på hverandre følgende trinn i den videre bevegelse. Ikke ta med første og siste spor der dyret er bare å initiere og fullføre sitt løp, henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av prosedyren som presenteres her, komplekser av 50microgram fluoresceinmerket oligonukleotid (FLO) og ~ 850microgram RVG peptid fra 01:15 molar kostnad ratio: ble (FLO peptid) utarbeidet og injiseres bare en gang gjennom halevenen. Kompleks av ikke-neurotropisk Rabies Virus Matrix (RVM) peptid og FLO ble anvendt som et leveringskontroll. Neste dag, ble musene hjerne og lever isolert og enkeltcellesuspensjoner ble fremstilt. Celler ble observert i henhold mikroskop for grønn fluorescens. FLO-RVG-kompleks ble levert med en korteste tid på en dag, og detekteres som en grønn fluorescens i hjernecellene, men ikke i lever (figur 2B, 2D) mens RVM peptid levert FLO til leveren, men ikke i hjernecellene ( Figur 2A, 2C).
Til knockdown Mir-29 i mus hjernen antagomir mot Mir-29 ble utformet med fem LNA modifikasjoner. Kryptert, ikke-miRNA målretting sekvens brukes som en Antagomir-conkontrollen. Kompleks av 50microgram Antagomir-kontroll eller Antagomir-29 med ~ 850microgram RVG Peptidet ble fremstilt og injisert via halevenen i løpet av en 3 dagers tidsforløp, etterfulgt av daglig adferds assays slik som vist i figur 1. For å oppnå maksimal effekt knockdown, komplekser var injiseres en gang per dag i 3 sammenhengende dager. På fjerde dag atferdsanalyser ble utført uten injeksjon. Mus fotavtrykk analyse viste signifikant reduksjon i trinnet lengden av Antagomir-29 RVG injiserte mus (figur 3A-3B). Bakben griper analysen av Antagomir-29 RVG injisert mus viste tydelig ataxic atferd med tendens til å trekke tilbake en eller begge bakbena mot magen. I avsatsen test Antagomir-29 RVG injisert mus viste frysing eller risting atferd med tap av balanse på hjørnet av buret. Mus ble avlivet ved injeksjon av xylazin hydroklorid (16milligram / kg) og tiopenton-natrium (80milligram / kg) på fjerde dag (24 timer etter den siste injeksjon av komplekset).Hjerneprøvene ble brukt til å utføre molekylær og cellulær analyse. Total RNA hentet fra cortex, cerebellum og hippocampus. Kvantitativ real time PCR-analyse viste klar reduksjon i uttrykket nivåer av begge isoformer av Mir-29, Mir-29a (Figur 4A) og Mir-29b (4B), i Antagomir-29 RVG injisert mus hjernedeler.
Figur 1. Skjema for musehalevenen injeksjon og atferd.
For å målrette Mir-29 i hjernen, ble Antagomir-kontroll eller Antagomir-29 med RVG peptid injisert en gang daglig i 3 påfølgende dager gjennom halevenen. Atferds ble utført daglig, etter en tre timers periode, slik at musen til å gjenopprette fra injeksjon. På fjerde dagen bare atferdsanalyser ble utført og mus ble avlivet og hjernevev ble samlet for real time PCR og cellulær assays. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. RVG peptid leverer fluorescens-merket oligonukleotid spesifikt til musehjerne.
Ved hjelp av metoden beskrevet i denne artikkelen, ble komplekse av fluorescensmerkede oligonukleotider (FLO) og peptid RVG / RVM forberedt og injisert bare en gang gjennom halevenen. FLO-RVG komplekset ble oppdaget som en grønn fluorescens i hjernecellene, men ikke i leveren (B, D) mens RVM peptid levert FLO til leveren, men ikke hjernen (A, C) 9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Mir-29 slå ned fører til ataxic atferd.
Mus fotavtrykk assays (A) på fjerde dag viste tydelig reduksjon av avstanden mellom to på hverandre følgende trinn for mus behandlet med Antagomir-29 (B) (**) p-verdi <0,001; n = 3 (Figur modifisert fra 9.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Antagomir-29 og RVG komplekse nedregulerer Mir-29 i mus hjernen.
Total RNA samlet inn fra tre hjernedeler. Kvantitativ sanntid PCR-analyse ble utført for å beregne uttrykk nivåer av begge isoformer av Mir-29, Mir-29a (A) og Mir-29b (B) 9.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Navn | Sekvens | Lade | Lengde |
| RVG-peptid | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGK RASN-GGGG-RRRRRRRRR * | 11 + | 41 |
| RVM-peptid | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSSPASA PLD-GGGG-RRRRRRRRR * | 11 + | 40 |
| Antagomir-kontroll (Egge) | 5 'A C CAA T CGAC C AA C 3' | 14 - | 14 |
| Antagomir-29 | 5 'C AC T GA T TT C AAA T GG 3' | 16 - | 16 |
| * Argininrester ved den C-terminale enden av RVG og RVM peptider er i D-form. | |||
| LNA modifiserte baser i de Antagomir sekvensene er understreket. |
Tabell 1. Sekvenser av peptid og Antagomirs
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Other | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
References
- Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases. Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).
- Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease and other Human CNS Disorders. Current Genomics. 10, 154-168 (2009).
- Soifer, H. S., Rossi, J. J., Saetrom, P. MicroRNAs in Disease and Potential Therapeutic Applications. Mol Ther. 15, 2070-2079 (2007).
- Bader, A. G., Brown, D., Winkler, M. The Promise of MicroRNA Replacement Therapy. Cancer research. 70, 7027-7030 (2010).
- Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3, 1-17 (2012).
- Trang, P., et al. Systemic Delivery of Tumor Suppressor microRNA Mimics Using a Neutral Lipid Emulsion Inhibits Lung Tumors in Mice. Molecular Therapy. 19, 1116-1122 (2011).
- Barbash, S., Hanin, G., Soreq, H. Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome. J Vis Exp. (76), e50170 (2013).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Roshan, R., et al. Brain-specific knockdown of miR-29 results in neuronal cell death and ataxia in mice. RNA. 20, 1287-1297 (2014).
- Kaur, H., Wengel, J., Maiti, S. Thermodynamics of DNA−RNA Heteroduplex Formation: Effects of Locked Nucleic Acid Nucleotides Incorporated into the DNA Strand. Biochemistry. 47, 1218-1227 (2008).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, D140-D144 (2006).
- Kaur, H., Babu, B. R., Maiti, S. Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked Nucleic Acid (LNA). Chemical Reviews. 107, 4672-4697 (2007).
- Guyenet, S. J., et al. A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia. J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Bergen, J. M., Park, I. -K., Horner, P. J., Pun, S. H. Nonviral Approaches for Neuronal Delivery of Nucleic Acids. Pharmaceutical Research. 25, 983-998 (2008).
- Zou, L. -L., Ma, J. -L., Wang, T., Yang, T. -B., Liu, C. -B. Cell-Penetrating Peptide-Mediated Therapeutic Molecule Delivery into the Central Nervous System. Current Neuropharmacology. 11, 197-208 (2013).
- Hwang, D. W., et al. A brain-targeted rabies virus glycoprotein-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of neurogenic microRNA. Biomaterials. 32, 4968-4975 (2011).
