Introduction
MicroRNAs har dykt upp som nya terapeutiska mål på grund av sin universella roll vid regleringen av genuttryck och direkt bevis för inblandning i sjukdom. MiRNA är aktivt utforskas för sin potential som målproteiner 1,2. Vidare förändringar i miRNA uttryck i samband med flera sjukdomar 3 och simulering av dessa förändringar genom artificiell störning av miRNA uttryck kan användas för att studera de cellulära vägarna inblandade i sjukdomsmanifestation. Vävnadsspecifika leverans av miRNA inriktnings läkemedel är för närvarande en stor utmaning för miRNA baserad läkemedelsutveckling. Antagomirs och miRNA härmar är lovande medel för störande miRNA nivåer 4-6. Men speciella funktioner som förbättrar deras specificitet och effektivitet måste införlivas i utformningen av antagomirs innan de kan användas för in vivo störning av miRNA uttryck.
MicroRNAs är särskilt relevanta som mål i närvarande obotlig neurodegenerativa och neuroutvecklingssjukdomar. Blod-hjärnbarriären utgör en begränsning till leveransen av antagomirs i hjärnan. Stereotaktiska injektioner används ofta i gnagarmodeller att leverera molekyler till specifika platser i hjärnan 7. Det kräver skicklighet, omfattande investeringar i instrumentering och tid. Stereotaktiska injektioner är invasiva, innebär kirurgi, orsaka åtminstone mindre skada och är begränsade till lokal leverans. Användningen av cellpenetrerande peptider med en preferens för inriktnings neuroner kan motverka dessa begränsningar, eftersom de kan tillföras genom det trans vaskulär väg men bryta blodhjärnbarriären. En sådan peptid härledd från rabiesvirus glykoprotein (RVG), har tidigare använts för att leverera siRNA mot japansk encefalitvirus i möss 8. Vi fann att användning av peptiden för antagomir leverans, kan miRNAs vara effektivt slog ner i mushjärna 9.
INNEHÅLL "> Den andra stora utmaningen miRNA knock-down härrör från den lilla storleken av miRNA och närvaron av närbesläktade sekvens isoformer. Vi tar exemplet med MMU-MIR-29 familjen som består av tre närbesläktade isoformer, MIR-29a , b och c. Antagomirs är också i allmänhet modifieras längs ryggraden för att öka deras stabilitet och göra dem resistenta mot angrepp av nukleaser. Låst nukleinsyror (LNA) erbjuda en ytterligare fördel att de ökar termisk stabilitet och även leda till mål nedbrytning över och bortom steriskt hinder 10. Presentation modifieringar längs ryggraden kan vara effektivt men dyrt. Vi har tidigare sett att modifieringar utöver ett optimalt antal inte vidare kan förstärka effektiviteten. Utformningen av antagomir involverar därför den optimala modifiering av antagomir.Till komplexet antagomir icke-kovalent med neurotrop peptid, en laddad hepta- till nona-arginin förlängning används. D-argininrester används, eftersom de ger högre stabilitet, eftersom de inte är känsliga för klyvning av proteaser. Hepta- till nona-arginin sträckor fungerar som effektiva cell penetrerande medel, även om de inte ger celltyp specificitet. Genom att kovalent binda RVG peptiden till nona-arginin länk, en neurotrop, cellpenetrerande peptid genererades. De positivt laddade resterna i peptiden interagerar med den negativt laddade nukleinsyran ryggraden, för att bilda komplex. Dessa komplex kan användas för att effektivt transfektera DNA eller RNA i odlade celler och in vivo in i vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Notera: All förfarandet inklusive djurförsök har godkänts av Institutional Djur etikkommitté (IAEC) vid Institutet för genomik och integrativ biologi, New Delhi (IGIB / AEC / 10/2013). Detta protokoll är speciellt justerad för målinriktad leverans av Antagomir-29 i hjärnan och knockdown av MIR-29.
1. Antagomir Design Strategy
- Hämta den mogna miRNA sekvensen från miRBase 11 (http://www.mirbase.org/).
- Hämta sekvenserna av närstående miRNA familjemedlemmar med hjälp av länken "Gene familj" i miRBase posten
(Http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009). - Omvänd komplettera sekvensen: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html ger ett praktiskt verktyg för attomvända komplementet sekvenser.
- Markera de ståndpunkter som ändras av LNA med följande riktlinjer:
- Välj Thymine rester placerade 3-4 baser isär för LNA ändring, eftersom LNA pyrimidiner är mer stabila än puriner 12.
- Välj cytosinenheter separerade med 3-4 rester om föregående steg producerar mindre än fem ändringar.
- Prioritera de fem ändringar av 5 'änden av antagomir, eftersom detta undviker fröet sekvensen.
2. Antagomir-neuropeptid Complex Framställning
Obs: Detta är det mest kritiska steget i protokollet och det behöver standardisering. Att standardisera protokollet någon fluorescensmärkt oligonukleotid (FLO) kan användas i stället för antagomir 9. Peptiderna bör vara av hög renhet (HPLC-kvalitet, 98% renhet) .Sequences och laddning av peptid och antagomir ges i tabell 1.
- Bestäm antalet moles av antagomir som skall injiceras baserat på molär laddning på antagomir, dess toxicitet och vikt hos musen. Beräkna antalet mol av peptiden som skall injiceras baserat på molladdningsförhållande av antagomir: peptid.
OBS: Standardisera molladdningsförhållande av antagomir: peptid för toxicitet och effektiv leverans i mushjärna. Använd olika molar laddningsförhållanden av fluorescerande oligonukleotid: peptid för standardisering. Vi fann att Antagomir-29 och kontroll var både giftiga vid 4microgram / gram kroppsvikt mus. Antagomir-29 och kontroll användes vid 2microgram / gram kroppsvikt, men denna effektiva koncentration sannolikt kommer att variera för varje mikroRNA. - Späd peptiden och antagomir i separata mikrofugrör från stamlösningar med steril 10% D-glukos till den önskade slutliga koncentrationen som beräknats i steg 1.
- Håll mikrofugrör med peptidlösningen på en virvel vid måttlig vortex hastighet.
- Lägg 1/3 av enntagomir lösning till peptidlösningen, långsamt, släpp klokt, medan det blandas noggrant i en virvelblandare.
- Fortsätt blandningen av lösningar på virveln för nästa 1 min och sedan låta blandningen stå under en minut.
- Upprepa steg 4 och 5 två ytterligare gånger för att blanda den kvarvarande antagomir lösningen med peptidlösningen i samma mikrofugrör. Den långsamma tillsatsen är kritisk för bildningen av mono-dispers komplex som är effektiva i transfektion. Snabb tillsats kan leda till aggregation av komplexen och deras utfällning.
- Inkubera komplexa för 30 min vid RT utan virvling. Under denna tid av inkubation acklimatisera mössen till labbet där injektioner kommer att utföras.
3. svansveninjektion av Antagomir-neuropeptid Complex
- Att hålla djuret, placera musen i fixerings eller decapicone av lämplig storlek.
- Rengör ytan av svansen med hjälp bomullspinne pre-indränkt i varmt vatten (ca 40 ° C). Detta kommer att främja vasodilatation och öka synligheten av venen.
- Närma svansen med en liten volym (0,5 - 1,0 cm ^) insulinspruta med en 15 till 20 ° vinkel. Var noga med att inte införa någon luft i sprutan. Börja vid den distala delen av svansen. Injicera komplexet. Ta bort nålen och tillämpa en antiseptisk kompress direkt till injektionsstället (ca 5-10 sekunder) för att stoppa blödning.
- Ersätt musen i en individuellt ventilerade bur i den grupp av 3-5, med majskolven och mjukpapper som anrikning. Förvara inte oinjicerade och injicerade möss i samma bur.
4. Beteendeanalyser
Obs: Håll tidsintervallet 3-4 timmar mellan injektion och beteendemässiga analyser för att tillåta återhämtning efter injektion. Ta musen till ett tyst rum. Stör inte djuren under denna period av acklimatisering.
- Acklimatisera musen tillnya rum under 30 minuter och sedan starta följande beteendemässiga analyser. Håll ett avstånd på 10 minuter mellan varje beteendeanalys.
- Bakben spännan:
OBS: Detta test indikerar motorisk dysfunktion och neurologisk försämring.- Lyft musen försiktigt genom att hålla nära svansbasen i den klara bakgrunden.
- Kontrollera bakdelen position 10-15 sek. Vildtyp mus splays bakben bort från buken, medan en ataxisk mus tenderar att dra tillbaka en eller båda bakbenen mot buken mer än 50% av tiden suspenderades 13.
- Återgå musen till buren
- Ledge test:
- Lyft musen försiktigt genom att hålla svansen och hålla den på hyllan i en bur.
- Beakta musen specifikt vid hörn av buren. Vild typ mus kan passera hörnen lätt utan rädsla och förlora balansen. Ataxisk mus förlora sin balans, frysa eller skakar när hon gick längs hylshyllan och i hörnen.
- Håll musen försiktigt genom en hand och applicera bläck på bakbenen av en borste.
- Placera det absorberande arket på golvet i en smal bana.
- Låt musen för att gå eller köra över ett absorberande ark i en rak linje i en bana från ena änden till andra.
- Upprepa processen två gånger med varje mus med färska absorberande.
- Mäta avståndet mellan två på varandra följande steg i den framåtgående rörelsen. Ta inte med första och sista några fotspår där djuret bara initiera och avslutar dess körning, respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med användning av förfarandet som presenteras här, komplex av 50microgram fluorescerande oligonukleotid (FLO) och ~ 850microgram RVG peptid med 1:15 molladdningsförhållande: var (FLO peptid) beredd och injicerades endast en gång genom svansvenen. Komplex av icke-neurotrop rabiesvirus Matrix (RVM) peptid och FLO användes som en leveranskontroll. Nästa dag mössen hjärna och lever isolerades och enkelcellsuspensioner bereddes. Celler observerades under mikroskop för grön fluorescens. FLO-RVG komplexet framgångsrikt levererat med en kortast tid på en dag och detekteras som en grön fluorescens i hjärncellerna, men inte i levern (Figur 2B, 2D) medan RVM peptid levereras FLO till levern, men inte i hjärncellerna ( Figur 2A, 2C).
Att knockdown miR-29 i mushjärna antagomir mot miR-29 konstruerades med fem LNA ändringar. Den krypterade, icke-miRNA inriktning sekvens som används som en Antagomir-conkontroll. Komplex av 50microgram Antagomir-kontroll eller Antagomir-29 med ~ 850microgram RVG Peptiden preparerades och injicerades genom svansvenen under en tre dagars tidsförlopp, följt av dagliga beteendeanalyser som visas i figur 1. För att uppnå maximal knockdown effekt, komplex var injiceras en gång per dag under 3 på varandra följande dagar. På fjärde dagen beteende utfördes utan injektion. Mus footprint-analys visade signifikant minskning av steglängden för Antagomir-29 RVG injicerade möss (figur 3A-3B). Bakben knäppa fast analys av Antagomir-29 RVG injicerade möss visade tydligt ataxic beteende med tendens att dra tillbaka en eller båda bakbenen mot buken. I kanten testet Antagomir-29 RVG injicerade möss visade frysning eller skakning beteende med förlust av balans i hörnet av buren. Möss avlivades genom injektion av xylazinhydroklorid (16milligram / kg) och tiopental natrium (80milligram / kg) på fjärde dagen (24 timmar efter den sista injektionen av komplex).Hjärnprover användes för att utföra molekylär och cellulär analys. Totalt RNA uppsamlades från hjärnbarken, lillhjärnan och hippocampus. Kvantitativ realtids-PCR-analys visade tydlig minskning i uttrycksnivåer hos både isoformerna av MIR-29, MIR-29a (Figur 4A) och MIR-29b (Figur 4B), i Antagomir-29 RVG injicerade möss hjärndelar.
Figur 1. Schema för mus svansveninjektion och beteende.
För att rikta miR-29 i hjärnan, var Antagomir-kontroll eller Antagomir-29 med RVG peptid injiceras en gång om dagen i 3 dagar i följd genom svansvenen. Beteendeanalyser utfördes dagligen, efter en 3 h period, för att tillåta musen för att återhämta sig från injektion. På fjärde dagen bara beteendeanalyser utfördes och mössen avlivades och hjärnvävnad samlades för realtids PCR och cellulär assays. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. RVG peptid levererar fluorescensmärkta oligonukleotid specifikt till mushjärna.
Med användning av metoden som beskrivs i den här artikeln, har komplex av fluorescerande oligonukleotider (FLO) och peptid RVG / RVM beredd och injiceras bara en gång genom svansvenen. FLO-RVG komplexet detekteras som en grön fluorescens i hjärncellerna, men inte i levern (B, D) medan RVM peptid levereras FLO till levern, men inte hjärnan (A, C) 9. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. miR-29 slå ner leder till ataxisk beteende.
Mus fotavtryck analyser (A) på fjärde dagen visade tydlig minskning av avståndet mellan två på varandra följande steg för mus behandlad med Antagomir-29 (B) (**) p-värde <0,001; n = 3 (Figur modifierad från 9.) klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Antagomir-29 och RVG komplexa nedreglerar miR-29 i mushjärna.
Totalt RNA uppsamlades från tre hjärndelar. Kvantitativ realtids-PCR-analys utfördes för att uppskatta uttrycksnivåer av båda isoformerna av MIR-29, MIR-29a (A) och MIR-29b (B) 9.) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Namn | Sekvens | Avgift | Längd |
| RVG-peptid | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGK RASN-GGGG-RRRRRRRRR * | 11 + | 41 |
| RVM-peptid | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSSPASA PLD-GGGG-RRRRRRRRR * | 11 + | 40 |
| Antagomir-kontroll (scrambled) | 5 'A C CAA T CGAC C AA C 3' | 14 - | 14 |
| Antagomir-29 | 5 'C AC T GA T TT C AAA T GG 3' | 16 - | 16 |
| * Argininrester vid den C-terminala änden av RVG och RVM peptider är i D-formen. | |||
| LNA modifierade baser i Antagomir sekvenserna är understrukna. |
Tabell 1. Sekvenser av peptid och Antagomirs
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Other | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
References
- Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases. Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).
- Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease and other Human CNS Disorders. Current Genomics. 10, 154-168 (2009).
- Soifer, H. S., Rossi, J. J., Saetrom, P. MicroRNAs in Disease and Potential Therapeutic Applications. Mol Ther. 15, 2070-2079 (2007).
- Bader, A. G., Brown, D., Winkler, M. The Promise of MicroRNA Replacement Therapy. Cancer research. 70, 7027-7030 (2010).
- Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3, 1-17 (2012).
- Trang, P., et al. Systemic Delivery of Tumor Suppressor microRNA Mimics Using a Neutral Lipid Emulsion Inhibits Lung Tumors in Mice. Molecular Therapy. 19, 1116-1122 (2011).
- Barbash, S., Hanin, G., Soreq, H. Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome. J Vis Exp. (76), e50170 (2013).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Roshan, R., et al. Brain-specific knockdown of miR-29 results in neuronal cell death and ataxia in mice. RNA. 20, 1287-1297 (2014).
- Kaur, H., Wengel, J., Maiti, S. Thermodynamics of DNA−RNA Heteroduplex Formation: Effects of Locked Nucleic Acid Nucleotides Incorporated into the DNA Strand. Biochemistry. 47, 1218-1227 (2008).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, D140-D144 (2006).
- Kaur, H., Babu, B. R., Maiti, S. Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked Nucleic Acid (LNA). Chemical Reviews. 107, 4672-4697 (2007).
- Guyenet, S. J., et al. A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia. J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Bergen, J. M., Park, I. -K., Horner, P. J., Pun, S. H. Nonviral Approaches for Neuronal Delivery of Nucleic Acids. Pharmaceutical Research. 25, 983-998 (2008).
- Zou, L. -L., Ma, J. -L., Wang, T., Yang, T. -B., Liu, C. -B. Cell-Penetrating Peptide-Mediated Therapeutic Molecule Delivery into the Central Nervous System. Current Neuropharmacology. 11, 197-208 (2013).
- Hwang, D. W., et al. A brain-targeted rabies virus glycoprotein-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of neurogenic microRNA. Biomaterials. 32, 4968-4975 (2011).
