Introduction
마이크로 RNA에 의한 유전자 발현과 질병에의 참여에 대한 직접적인 증거의 규제에서의 보편적 인 역할에 새로운 치료 대상으로 등장했다. 약물이 1, 2를 대상으로 miRNA가 적극적으로 자신의 잠재력에 대한 탐구되고있다. 더욱이, miRNA의 발현의 변화가 여러 질환 3의 miRNA 발현의 인공 섭동에 의한 이러한 변화의 시뮬레이션과 관련된 질병의 발현에 관여하는 세포 경로를 연구하기 위해 사용될 수있다. miRNA의 표적 약물의 조직 특정 배달은 현재의 miRNA 기반 신약 개발의 주요 과제입니다. Antagomirs 및 miRNA의 모방은 miRNA의 레벨 4-6을 교란하기위한 유망 에이전트입니다. 그러나, 특이성 및 효능을 향상 특징들은 miRNA의 발현 생체 섭동에 사용될 수 있기 전에 antagomirs의 디자인에 혼입 될 수있다.
마이크로 RNA는 특히 관련이 현재 불치의 퇴행성 신경과 신경 발달 질환 대상으로. 혈액 - 뇌 장벽은 뇌에 antagomirs의 전달에 제한을 포즈. 정위 주사 널리 7 뇌의 특정 위치로 분자를 전달하는 설치류 모델에서 사용된다. 그것은 기술, 계측 및 시간에 광범위한 투자를 필요로한다. 정위 주사는 적어도 경미한 부상의 원인, 수술을 포함하고 로컬 배달로 제한됩니다, 침략이다. 표적 뉴런의 설정에 셀 관통 펩티드의 사용은 트랜스 혈관 경로를 통해 전달 될 수 있기 때문에 이러한 제한에 대응하지만, 혈액 뇌 장벽을 위반할 수있다. 광견병 바이러스 당 단백질 (RVG) 유래의 펩타이드 등, 이전 쥐 8 일본 뇌염 바이러스에 대한 siRNA를 전달하기 위해 사용되었다. 우리는 antagomir 배달 펩타이드를 사용하여,의 miRNAs 효과적으로 할 수 마우스 뇌 9 무너 뜨렸다 수 있다는 것을 발견했다.
ontent ">의 miRNA의 두 번째 주요 과제는 노크 다운의 miRNAs의 작은 크기와 밀접한 관련이 시퀀스 동종의 존재에서 발생한다. 우리는 세 밀접하게 관련 동종 구성-은 miR-29 MMU 가족의 예를 취할 미르-29A 핵산 (LNA들)이 그들은 심지어 열 안정성을 향상시키고 또 다른 장점을 제공 잠금, b와 c. Antagomirs는 일반적으로 안정성을 높이고 뉴 클레아의 공격에 저항하는 렌더링하는 백본을 따라 수정됩니다. 이상과 그 이후 저하를 대상으로지도 입체 장애 (10). 모든 백본을 따라 수정을 소개하는 것은 효과가 있지만 비용이 많이들 수 있습니다. 우리는 이전의 최적의 수를 넘어 수정이 더 효과를 강화하지 않을 수 있음을 보았다. antagomir의 디자인은 따라서 antagomir의 최적의 수정을 포함한다.복잡한 antagomir 비공유 노나 아르기닌 확장에 neurotropic 펩타이드, 충전 헵타와 함께 사용된다. D-아르기닌그들은 단백질 분해 효소에 의해 분해에 민감하지 않은으로 높은 안정성을 부여하기 때문에 잔류 물이 사용된다. 노나 아르기닌까지 뻗어 헵타은 세포 유형 특이성을 부여하지 않지만, 효율적인 세포 침투제의 역할. 공유 노나 아르기닌 링커 neurotropic, 세포 투과 펩티드가 생성되었던 RVG 펩티드 연결함으로써. 펩티드의 양으로 하전 된 잔기가 복합체를 형성하기 위해, 음으로 하전 된 핵산 백본과 상호 작용. 이러한 착물은 효과적으로 배양 세포 내로 생체 내에서 조직 내로 DNA 또는 RNA를 형질 감염 할 수있다.
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Protocol
참고 : 동물 과목을 포함한 모든 절차는 기관 동물 윤리 유전체학 연구소의위원회 (IAEC)와 통합적인 생물학, 뉴 델리에 의해 승인 된 (IGIB / AEC / 2,013분의 10). 이 프로토콜은 특히은 miR-29의 뇌와 최저의 Antagomir-29의 표적 전달을 위해 조정됩니다.
1. Antagomir 디자인 전략
- miRBase (11)의 성숙한 miRNA의 순서를 검색 ( http://www.mirbase.org/ ).
- miRBase 레코드 "유전자 패밀리"링크를 사용하여 관련 miRNA의 가족 구성원의 서열을 검색
( http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009 ). - 순서를 보완 역 : http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html이 할 수있는 편리한 도구를 제공합니다보완 순서를 역.
- 다음 지침에 따라 LNA에 의해 수정 될 수있는 위치를 표시 :
- LNA의 피리 미딘는 퓨린 (12)보다 더 안정적이기 때문에, LNA의 수정을 위해 3 ~ 4 기지 떨어져 배치 티민 잔류를 선택합니다.
- 이전 단계가 5 개 미만의 수정을 생성하는 경우 3-4 잔류 물에 의해 분리 된 시토신 잔류를 선택합니다.
- 이 시드 서열을 방지하기 때문에, antagomir의 5 '말단에 다섯 수정 우선 순위.
2. Antagomir - 신경 펩타이드 복합 준비
주 :이 프로토콜에서 가장 중요한 단계이며 표준화를 필요로한다. 임의의 형광 표지 된 올리고 뉴클레오타이드 (FLO)는 antagomir 9 대신에 사용될 수있는 프로토콜을 표준화. 펩티드 고순도이어야한다 (HPLC 등급은 98 % 순도) 및 .Sequences 펩타이드 antagomir의 전하를 표 1에 나타내었다.
- MO의 수를 결정할antagomir의 레는 마우스의 antagomir, 독성 및 무게에 몰 요금을 기준으로 주입한다. 펩티드 : 펩티드의 몰수를 계산하는 분사 antagomir 몰 투입 비율에 기초한다.
참고 : 마우스 뇌의 독성 및 효과적인 전달을위한 펩타이드 : antagomir 몰 충전 비율을 표준화. 표준화를위한 펩타이드 : 형광 표지 된 올리고 뉴클레오티드의 다른 몰 충전 비율을 사용합니다. 우리는 Antagomir-29 및 제어 마우스의 4microgram / g의 체중에서 독성이 두 사실을 발견했습니다. Antagomir-29 및 제어 2microgram / g 체중으로 사용되었지만,이 유효 농도는 각각의 마이크로 RNA에 따라 다를 가능성이있다. - 1 단계에서 계산 된 목적하는 최종 농도로 멸균 10 % D 글루코스 원액으로부터 미세 원심 분리 튜브에 펩티드 antagomir 희석.
- 적당한 텍싱 속도 소용돌이에 펩타이드 용액으로 미세 원심 튜브를 유지한다.
- 1/3 번째 추가이 와류 믹서에서 충분히 혼합하면서 펩티드 용액 튜브에 ntagomir 용액을 천천히, 적가.
- 다음으로 1 분 동안 와동에 용액의 혼합을 계속 한 다음, 혼합물을 1 분 동안 방치한다.
- 같은 미세 원심 분리 튜브에 펩타이드 솔루션 나머지 antagomir 솔루션을 혼합하는 단계 4와 5를 두 번 더 반복합니다. 느린 첨가는 형질 효과적이다 모노 - 분산 복합체의 형성에 중요하다. 빠른 추가는 단지 그들의 강수량의 집합으로 이어질 수 있습니다.
- 텍싱없이 RT에서 30 분 동안 인큐베이션 복합체. 배양이 기간 동안 주사가 수행 될 실험실 쥐를 순응.
Antagomir - 신경 펩타이드 콤플렉스 3. 꼬리 정맥 주입
- 동물을 억제하기 위해, 적절한 크기의 제한 수단 또는 decapicone에 마우스를 놓습니다.
- 면봉 홍보를 사용하여 꼬리의 표면을 청소전자 적신 따뜻한 물 (약 40 ℃)에서. 이는 혈관 확장을 촉진하고 혈관의 가시성을 증가시킬 것이다.
- 15 ~ 20 ° 각도로 - (1.0 CC 0.5) 인슐린 주사기 작은 볼륨 꼬리에 접근. 주사기에있는 공기를 도입하지 않도록주의하십시오. 꼬리의 말단부에 시작한다. 단지를 주입. 바늘을 제거하고 출혈을 멈추게하기 위해 주사 부위 (약 5 ~ 10 초)에 직접 살균 면봉을 적용합니다.
- 농축과 옥수수 속대와 티슈 페이퍼로, 3-5의 그룹에서 개별적으로 환기 케이지에 마우스를 교체합니다. 같은 케이지에서 uninjected 및 주입 쥐를 보관하지 마십시오.
4. 행동 분석 실험
주 : 주사 후 회복을 허용하기 위해 주입 및 행동 분석 사이에서 3-4 시간의 시간 간격을 유지. 조용한 방에 마우스를 가져 오십시오. 적응의이 기간 동안 동물을 방해하지 마십시오.
- 마우스를 순응새로운 방 30 분 후 다음 행동 분석을 시작합니다. 각각의 행동 분석 사이에 10 분의 간격을 유지합니다.
- 뒷다리 물림쇠 :
참고 :이 테스트는 운동 기능 장애 및 신경 손상을 나타냅니다.- 분명 배경에 꼬리 근처에 기반을 잡고 부드럽게 마우스를 올립니다.
- 10 ~ 15 초 동안 사지의 위치를 확인합니다. 실조 마우스가 시간의 50 % 이상 13 현탁 복부쪽으로 한쪽 또는 양쪽 뒷다리 경향 후퇴하면서 야생형 마우스 splays 멀리 복부에서 뒷다리.
- 케이지에 마우스를 반환
- 난간에 시험 :
- 꼬리를 잡고 부드럽게 마우스를 올려 케이지의 선반에 보관하십시오.
- 케이지의 모서리에 구체적으로 마우스를 관찰합니다. 야생형 마우스는 두려움과 균형을 잃지 않고 쉽게 모서리를 전달할 수 있습니다. 케이지 선반을 따라 코너에 걷는 동안 운동 실조증 마우스는 균형, 동결을 잃거나 흔들립니다.
- 한 손으로 부드럽게 마우스를 잡고 브러시에 의해 뒷다리에 잉크를 적용합니다.
- 좁은 활주로 바닥에 흡수 시트를 놓습니다.
- 마우스를 걷거나 다른 한 끝에서 활주로에 직선으로 흡수 시트를 통해 실행할 수 있습니다.
- 신선한 흡수 시트를 사용하여 각 마우스로 과정을 두 번 더 반복합니다.
- 전방 이동에 두 개의 연속 단계들 사이의 거리를 측정한다. 동물은 단지 각각 시작과 실행을 마무리된다 처음과 마지막 몇 발자국를 포함하지 마십시오.
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Representative Results
여기에 제시된 절차를 이용하여 형광 표지 된 올리고 뉴클레오티드 50microgram (FLO)와 전하 ~ 1시 15분 몰 비율의 850microgram RVG 펩타이드 복합체 (FLO : 펩티드)을 준비하고, 꼬리 정맥을 통해 한 번만 주입 하였다. 비 neurotropic 광견병 바이러스 매트릭스 (RVM) 펩티드 및 FLO의 복합체는 대인 대조군으로 사용 하였다. 다음날, 마우스 뇌 및 간을 분리 하였다 및 단일 세포 현탁액을 제조 하였다. 세포는 녹색의 형광 현미경으로 관찰 하였다. FLO-RVG 착체 성공적 아니지만 RVM 펩티드가 간뿐만 아니라 뇌 세포에서 FLO 전달하면서 간 (도 2B, 2D)에서 (뇌 세포에서의 녹색 형광 어느 날의 최단 시간에 전달하고 검출 된 도 2A, 2C).
은 miR-29 5 개의 LNA 수정 설계되었습니다에 대한 마우스의 뇌 antagomir 미르-29를 넉다운합니다. Antagomir-CON로 사용되는 스크램블, 비 miRNA의 표적 순서트롤. 50microgram Antagomir 제어 또는 Antagomir-29 최대 녹다운 효과를 달성하기 위해도 1에 도시 된 바와 같이 ~ 850microgram의 RVG 펩티드 매일 행동 분석 한 후, 제조 및 3- 일 시간 과정을 통해 꼬리 정맥을 통해 주사 하였다으로, 복합체이었다 복잡한 3 연속 일 동안 하루에 한 번 주입. 넷째 날에 행동 분석은 주입없이 수행 하였다. 마우스 발자국 분석 마우스 (도 3A-3B)를 주입 Antagomir RVG-29의 스텝 길이의 현저한 감소를 보였다. Antagomir-29 RVG의 분석을 clasping 뒷다리는 명확하게 쥐를 주입 복부를 향해 하나 또는 두 개의 뒷다리를 철회하는 경향이 운동 실조증 행동을 보여 주었다. 선반 테스트에서 Antagomir-29 RVG 쥐 주입 동결 또는 케이지의 모서리에 균형의 손실 동작을 흔들어 보였다. 마우스는 자일 라진 하이드로 클로라이드 (16milligram / ㎏)과 넷째 날에 thiopentone 나트륨 (80milligram / ㎏) (복잡한의 마지막 주사 후 24 시간)의 주사로 안락사시켰다.뇌 시료는 분자 및 세포 분석을 수행 하였다. 피질, 소뇌와 해마에서 수집 된 총 RNA. 정량 실시간 PCR 분석은 Antagomir-29 RVG 생쥐 뇌 부분을 주입에서의 발현 수준 둘은 miR-29, 미르 (29A) (도 4A) 미르-29B (도 4b)의 이성체에서 명확한 감소가 나타났다.
마우스의 꼬리 정맥 주입 및 동작에 대한 그림 1. 스키마.
뇌은 miR-29를 표적으로하기 위해, RVG 펩티드 Antagomir 제어 또는 Antagomir-29은 꼬리 정맥을 통해 연속 3 일 동안 하루에 한번 주사되었다. 행동 분석은 마우스에서 회복 주입 할 수 있도록, 3 시간 기간 후에, 매일 수행되었다. 넷째 날에 단지 행동 분석을 수행하고, 마우스를 안락사시키고 뇌 조직은 실시간 PCR 및 세포의 엉덩이에 대한 수집AYS. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. RVG 펩타이드는 형광 마우스의 뇌에 구체적으로 올리고 뉴클레오티드 레이블 제공합니다.
이 문서에 기술 된 방법을 사용하여, 복합체의 형광 표지 된 올리고 뉴클레오타이드 (FLO)와 펩티드 RVG / RVM 준비하고, 꼬리 정맥을 통해 한 번만 주입 하였다. FLO-RVG 단지가 아니라 간 (B, D)의 뇌 세포에서 녹색 형광으로 검출 된 RVM 펩타이드 간 아닌 뇌 (A, C) 9.에 FLO를 전달하면서 더 크게 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 버전입니다.
그림 3은 miR-29은 운동 실조증을 행동으로 리드를 넣었습니다.
넷째 날에 마우스 발자국 분석 (A)는 Antagomir-29 (B)로 처리 된 마우스에 대한 두 개의 연속적인 단계 사이의 거리에 분명 감소 (**) P - 값 <0.001을 보여 주었다; N = 3 (9에서 수정 된 그림.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. Antagomir-29과 RVG 복잡한 마우스 뇌은 miR-29을 하향 조절한다.
총 RNA를 세 뇌 부분에서 수집. 정량 실시간 PCR 분석은은 miR-29은 miR-29A (A) 미르-29B의 이성체 모두의 발현 량 (B)을 추정하기 위해 수행되었다 (9에서 수정 된 그림.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 이름 | 순서 | 요금 | 길이 |
| RVG 펩타이드 | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGK RASN-GGGG-RRRRRRRRR * | 11 + | (41) |
| RVM 펩타이드 | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSSPASA PLD-GGGG-RRRRRRRRR * | 11 + | (40) |
| Antagomir 제어 (스크램블) | 5 'C CAA T CGAC C 단 C 3' | 14 - | (14) |
| Antagomir-29 | 5 'C AC T GA T AAA T GG 3 TT C' | 16 - | (16) |
| * 아르기닌RVG 및 RVM 펩티드의 C 말단 잔기는 D-형태이다. | |||
| Antagomir 시퀀스에서 LNA 수정 기지 밑줄. |
펩타이드 및 Antagomirs 표 1. 시퀀스
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Other | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
References
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