Introduction
微小RNA已成为新的治疗目标，因为它们在基因表达和直接的证据参与疾病的调节普遍作用。 miRNA是正在积极探讨了他们的潜力作为药物靶点1,2。另外，在miRNA表达的改变与几种疾病3和仿真这些变化由miRNA表达的人工扰动的相关联的可用于研究参与疾病表现的细胞途径。 miRNA的靶向药物组织特异性递送目前是miRNA的基础的药物发展的一个重大挑战。拮抗和miRNA模仿是有希望的代理商扰动miRNA水平4-6。但是，特特点增强了它们的特异性和功效必须掺入RNA拮抗剂的设计中，可以使用之前在体内扰动miRNA表达。
微RNA是特别相关在目前无法治愈的神经变性疾病和神经发育疾病的目标。血 - 脑屏障构成限制拮抗在大脑的输送。立体定向注射广泛用于啮齿动物模型，提供分子的特定位置在大脑7。它需要技巧，仪器仪表和时间大量的投资。立体定向注射是侵入性的，包括外科手术，造成至少轻微伤害和被限制在本地投递。同时优先使用靶向神经元的使用细胞穿透肽的可以应对这些限制，因为它们可以通过跨血管途径给药，但违反血脑屏障。这种由狂犬病毒糖蛋白（RVG）衍生肽，以前是用来提供的siRNA对乙型脑炎病毒在小鼠8。我们发现，使用的肽为微小RNA拮抗剂递送中，miRNA可有效在小鼠大脑9撞倒。
内容】“>的miRNA的第二个主要挑战击倒源于miRNA的小尺寸和密切相关的序列同种型的存在。我们采取的示例的mmu-的miR-29家族，包括三个密切相关的同种型中，miR-29a的，b和c。RNA拮抗剂一般也沿着主链修饰以增加它们的稳定性和使它们耐受核酸酶的攻击。锁核酸（LNA的）提供，它们提高的热稳定性，甚至进一步的优点导致了超越目标降解空间位阻10。所有沿主干引入的修改可能是有效的，但昂贵的。前面我们已经看到，超过最优数量的修改不能进一步提高疗效。因此，RNA拮抗剂的设计涉及到RNA拮抗剂的优化改造。到复杂的微小RNA拮抗剂与亲神经肽，带电七溴到壬精氨酸扩展非共价地被使用。 D型精氨酸残基被使用的，因为它们赋予更高的稳定性，因为它们不被蛋白酶敏感的切割。七溴到壬精氨酸延伸充当有效的细胞渗透剂，虽然它们不赋予细胞类型特异性。通过共价连接的RVG肽与壬精氨酸连接体，亲神经，产生细胞穿透肽。肽的正电荷的残基带负电荷的核酸骨架相互作用，以形成复合物。这些复合物可以用于有效转染的DNA或RNA导入培养的细胞和体内进入组织。
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Protocol
注：所有包括动物受试者的程序已经被批准机构动物伦理委员会（原子能委员会）的基因组学研究所与整合生物学，新德里（IGIB / AEC / 10/2013年）。这个协议是专为中的miR-29的脑和击倒靶向递送RNA拮抗剂-29的调节。
1. RNA拮抗剂设计策略
- 检索来自miRBase 11成熟miRNA序列（http://www.mirbase.org/）。
- 检索相关的miRNA家族成员使用的miRBase记录的“基因家族”链接序列
（http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009）。 - 反向互补序列：http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html提供了一个方便的工具反向互补序列。
- 使用以下准则标记由LNA修饰的位置：
- 选择胸腺嘧啶残基放置3-4个碱基分开用于LNA修饰，因为LNA嘧啶是比嘌呤12更稳定。
- 选择胞嘧啶残基3-4残余物中分离，如果前面的步骤产生不到五年的修改。
- 优先的五个修改到微小RNA拮抗剂的5'端，因为这可避免的种子序列。
2. RNA拮抗剂，神经肽复合制剂
注意：这是在协议中最关键的步骤，它需要标准化。标准化任何荧光标记的寡核苷酸（FLO）可以代替RNA拮抗剂9的要使用的协议。肽应该是高纯度的（HPLC级，纯度98％）.Sequences和电荷肽和RNA拮抗剂的列于表1。
- 确定莫数量微小RNA拮抗剂的莱斯基于上微小RNA拮抗剂的鼠标，其毒性和重量摩尔电荷注入。基于RNA拮抗剂的摩尔电荷比计算肽的摩尔数被注入：肽。
注：规范RNA拮抗剂的摩尔电荷比：肽毒性和有效的传递在小鼠大脑。使用荧光标记的寡核苷酸的不同摩尔电荷比：肽进行标准化。我们发现，微小RNA拮抗剂-29和对照均在4microgram /克体重的小鼠的毒性。微小RNA拮抗剂-29和控制被用于在2microgram /克体重，但这种有效浓度可能随每个微RNA。 - 稀释在从储备液用无菌10％D-葡萄糖至所需的最终浓度分离微量离心管的肽和RNA拮抗剂作为计算在步骤1。
- 保持离心管，以中等涡旋速度在涡流肽的解决方案。
- 加入1/3 RD的一对ntagomir溶液到肽溶液管，慢慢逐滴，而这是在涡旋混合器上充分混合。
- 继续解决方案上的旋涡混合下1分钟，然后让混合物静置1分钟。
- 重复步骤4和5两个次混合在同一离心管将肽溶液的其余RNA拮抗剂溶液。缓慢加入为的单分散复合物能有效地转染的形成至关重要。快速加入可导致配合物及其沉淀的聚集。
- 孵育复为在室温30分钟无涡流。在孵化的这段时间，使其恢复小鼠到注射将执行了实验室。
3.尾静脉注射的RNA拮抗剂，神经肽复合物
- 为了抑制动物，将鼠标在适当大小的限制部分或decapicone。
- 使用棉签公关清洁尾部的表面电子浸泡在温水（约40℃）。这将促使血管扩张，增加静脉的知名度。
- 接近尾用小体积（0.5 - 1.0毫升）胰岛素注射器15-20°角。注意不要引入任何空气进入注射器。开始在尾的远端部分。注入复杂。取出针，直接涂抹防腐剂棉球消毒注射部位（约5-10秒），以制止任何出血。
- 更换鼠标在组的3-5在独立通风笼，用玉米芯和纸巾的富集。不要让未注射及注射的小鼠在同一个笼子里。
4.行为测定
注意：保持3-4小时的时间间隔中注入和行为测定之间，以允许注射后恢复。把鼠标一个安静的房间。在此期间，水土不服，不要打扰动物。
- 逐渐适应鼠标到新空间30分钟，然后启动以下行为测定。保持10分钟的间隙中的每个行为测定之间。
- 后肢夹紧：
注：此试验表明运动功能障碍和神经系统损伤。- 握住尾巴的基地附近在清晰的背景拿起鼠标轻轻。
- 检查后肢姿势10-15秒。野生型小鼠扩张部分后肢离开腹部，而一个共济失调小鼠趋于缩回的一个或两个后肢朝向腹部的时间超过50％的悬浮13。
- 返回鼠标笼子
- 礁测试：
- 提起鼠标轻轻握住尾巴，并保持在一个笼子里的窗台。
- 观察小鼠专门在笼子的一角。野生型小鼠可以很容易地通过弯道，而不必担心，失去了平衡。共济失调鼠标失去平衡，冻结或抖动而沿着笼窗台，在角落走。
- 将鼠标轻轻地用一只手，并用刷子上的后肢适用的油墨。
- 上放置的一个狭窄的跑道的地板的吸收性片材。
- 允许小鼠行走或从一端到另一辗过在一条直线上的吸收性片材在跑道。
- 与使用新鲜吸收性片材各小鼠重复该过程两次以上。
- 测量在前进移动两个连续步骤之间的距离。不包括第一和最后几个脚印，其中动物是刚刚启动，并完成它的运行，分别。
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Representative Results
用这里介绍的方法，50microgram荧光标记的寡核苷酸（FLO）和〜1:15的摩尔电荷比850microgram RVG肽的复合物：制备并通过尾静脉注射一次（FLO肽）。非嗜神经狂犬病毒矩阵（RVM）肽和FLO的复杂用作传送控制。第二天，将小鼠脑和肝中分离和单细胞悬浮液制备。将细胞在显微镜下观察到绿色荧光。 FLO-RVG络合物成功传递与一天中的时间最短，并检测为绿色荧光在脑细胞而不是在肝脏（图2B，2D），同时 ，RVM肽递送FLO至肝脏而不是在脑细胞（图2A，2C）。
拦截的miR-29在对抗的miR-29设计有五个LNA修饰的小鼠大脑RNA拮抗剂。用作微小RNA拮抗剂-CON加扰的，非的miRNA靶向序列控制。 50microgram RNA拮抗剂控制或微小RNA拮抗剂-29以〜850microgram RVG肽制备并通过尾静脉，在3天时间过程注射，随后日常行为分析，如图1。为了达到最大的击倒作用，复合物的复合物注射每天一次连续3天。在第四天是没有注射进行行为分析。鼠标足迹分析显示显著降低微小RNA拮抗剂-29 RVG的步长给小鼠注射（图3A-3B）。后肢紧握着RNA拮抗剂-29 RVG的实验小鼠注射清楚地显示出与趋势共济失调行为收回一个或两个朝向腹部后肢。在窗台测试RNA拮抗剂-29 RVG注射的小鼠表现出冻结或发抖失去平衡的行为在笼子的一角。小鼠通过注射甲苯噻嗪盐酸盐（16milligram / kg）和上第四天硫喷妥钠钠（80milligram /千克）（在最后一次注射复合物后24小时）的安乐死。脑样品用于进行分子和细胞分析。皮层，小脑和海马收集的总RNA。实时定量PCR检测结果显示明显降低的表达水平两者的miR-29中，miR-29A（ 图4A）和miR-29B（ 图4B）的异构体，在RNA拮抗剂-29 RVG注射的小鼠的大脑部位。
图1.架构小鼠尾静脉注射和行为。
为了目标的miR-29在大脑中，微小RNA拮抗剂控制或微小RNA拮抗剂-29与RVG肽通过尾静脉每天注射一次，连续3天。行为分析每日进行，一个3小时期间后，以允许鼠标从喷射中恢复过来。在第四天只有行为测定法和小鼠安乐死，脑组织收集实时PCR和细胞的屁股AYS。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. RVG肽提供专门的荧光标记的寡核苷酸的小鼠大脑 。
使用本文中所描述的方法中，配合物的荧光标记的寡核苷酸（FLO）和肽RVG / RVM制备并通过尾静脉注射一次。 FLO-RVG复合物检测为绿色荧光的脑细胞，但不是在肝脏（B，D），而 RVM肽交付FLO到肝脏，但无脑（A，C）9。 请点击此处查看大图版本这个数字。
图3的miR-29击倒导致的共济失调行为。
鼠标足迹分析（一）在第四天显示连续两个步骤之间明显降低的距离与RNA拮抗剂-29（B）治疗的小鼠（**）p -值<0.001; N = 3（图9修改。） 点击此处查看该图的放大版本。
图4. RNA拮抗剂-29和RVG复杂的小鼠脑下调的miR-29。
从三个大脑部分总RNA收集。定量实时PCR测定法来估计的miR-29中，miR-29a的（A）和miR-29b的两个同种型的表达水平（B）的 9修改。） 点击此处查看该图的放大版本。
| 名称 | 序列 | 收费 | 长度 |
| RVG肽 | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGK RASN-GGGG-RRRRRRRRR * | 11 + | 41 |
| RVM肽 | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSSPASA PLD-GGGG-RRRRRRRRR * | 11 + | 40 |
| RNA拮抗剂控制（炒） | 5'A C CAA 牛逼 CGACçAA C 3' | 14 - | 14 |
| RNA拮抗剂-29 | 5'C交流 牛逼 牛逼 GA TTçAAA 牛逼 GG 3' | 16 - | 16 |
| *精氨酸残RVG并RVM肽的C-末端是在D-型。 | |||
| 在RNA拮抗剂的序列的LNA修饰的碱基被下划线。 |
表1.序列肽和RNA拮抗剂的
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Other | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
References
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