Introduction
マイクロRNAは、遺伝子発現と疾患への関与のための直接的な証拠の調節におけるそれらの普遍的役割に起因する新規治療ターゲットとして浮上しています。薬は1,2をターゲットとして、miRNAは、積極的に自分の可能性について検討されています。さらに、miRNA発現の変化は、いくつかの疾患および3 miRNA発現の人工的な摂動により、これらの変化のシミュレーションが疾患症状に関与する細胞経路を研究するために使用することが可能に関連付けられています。 miRNAを標的とする薬剤の組織特異的送達は、現在のmiRNAベースの薬剤開発のための大きな課題です。アンタゴとのmiRNA模倣体は、miRNAレベル4-6を摂動するための有望な薬剤です。しかし、それらの特異性および有効性を高める特殊な特徴は、それらがmiRNA発現のインビボでの摂動のために使用することができる前に、アンタゴの設計に組み込まれなければなりません。
マイクロRNAは、特に関連しています現在不治の神経変性および神経発達疾患における標的として。血液脳関門は、脳内のアンタゴの配信に制限を課します。定位注射は広く脳7内の特定の位置に分子を送達するためのげっ歯類モデルで使用されています。それは、スキル、計測および時間の大規模な投資を必要とします。定位注射は侵襲的であり、手術を伴う、少なくとも軽傷を引き起こし、ローカル配信に制限されます。ニューロンを標的化するための嗜好を有するペプチドを貫通する細胞の使用は、それらがトランス血管経路を介して送達することができるので、これらの制限に対抗するが、血液脳関門を破ることができます。狂犬病ウイルス糖タンパク質（RVG）に由来するようなペプチドは、以前にマウス8で日本脳炎ウイルスに対するsiRNAを送達するために使用されました。私たちは、アンタゴmir配信のためにペプチドを使用して、miRNAが効果的にマウス脳9にノックダウンできることを見出しました。
ontent "> miRNAの第二の主要課題は、ノックダウンは、miRNAの小さなサイズから生じると密接に関連した配列の存在は、私たちは3の密接に関連したアイソフォームで構成されてMMU-のmiR-29ファミリー、のmiR-29aの例を取る。アイソフォームa、bおよびc。アンタゴはまた、一般的にその安定性を向上させ、ヌクレアーゼによる攻撃にそれらが耐性をレンダリングするために骨格に沿って変更されます。ロックされた核酸（LNAのは）彼らは熱安定性を向上させるというさらなる利点を提供し、さらにオーバー以降劣化をターゲットにつながります立体障害10。すべての骨格に沿って修正を導入することは有効であるが高価になることができます。私たちは、以前の最適な数を超えた修正は、さらに有効性を増強ない可能性があることを見てきました。アンタゴの設計は、したがって、アンタゴの最適な変更を伴います。向神経ペプチドと非共有結合的に複雑なアンタゴには、ノナアルギニン内線にヘプタ充電に使用されます。 D-アルギニン彼らは、プロテアーゼによる切断を受けないよう、より高い安定性を付与するため、残基が使用されています。ノナアルギニンストレッチにヘプタは、それらが細胞型特異性を付与しませんが、効率的細胞透過剤として作用します。共有結合ノナアルギニンリンカーにRVGペプチドをリンクすることにより、神経向性、細胞透過性ペプチドを生成しました。ペプチドの正に荷電した残基は、複合体を形成するために、負に帯電した核酸骨格と相互作用します。これらの複合体は、効果的に培養された細胞内および組織内へのインビボでの DNAまたはRNAをトランスフェクトするために使用することができます。
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Protocol
注意：動物被験体を含むすべての手順は、ゲノミクス研究所と統合生物学における制度的動物倫理委員会（IAEC）、ニューデリー（IGIB / AEC / 2013分の10）によって承認されています。このプロトコルは、具体的のmiR-29の脳とノックダウンでアンタゴ-29の標的化送達のために調整されています。
1.アンタゴデザイン戦略
- miRBase 11から成熟miRNA配列を取得する（http://www.mirbase.org/）。
- miRBaseレコードに「遺伝子ファミリー」リンクを使用して、関連するmiRNAファミリーメンバーの配列を取得します。
（http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009）。 - 逆シーケンスを補完：http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.htmlはに便利なツールを提供します相補配列を逆にします。
- 次のガイドラインを使用して、LNAによって変更される位置をマーク：
- LNAのピリミジンがプリン12よりも安定であるため、LNA修飾のために離れて3-4拠点を置いチミン残基を選択してください。
- 前の手順が5つ未満の変更を生成する場合3-4残基によって分離されたシトシン残基を選択してください。
- これはシード配列を回避するため、アンタゴの5 '末端に5変更に優先順位を付けます。
2.アンタゴ-神経ペプチド複合体の準備
注：これは、プロトコルの中で最も重要なステップであり、それは標準化が必要です。プロトコルを標準化するために、任意の蛍光標識されたオリゴヌクレオチド（FLO）は、アンタゴmir 9の代わりに使用することができます。ペプチドは、高純度であるべきである（HPLCグレード、98％純度）.Sequencesペプチドおよびアンタゴの電荷を表1に示します。
- MOの数を決定しますレアンタゴのマウスのアンタゴ、その毒性と重量のモル電荷に基づいて注入されます。ペプチド：アンタゴmirのモル電荷比に基づいて注入されるペプチドのモル数を計算します。
注：アンタゴのモル電荷比を標準化：毒性およびマウス脳における効果的な送達のためのペプチド。標準化のためのペプチド：蛍光標識オリゴヌクレオチドの異なるモル電荷比を使用してください。私たちは、アンタゴmir-29とコントロールがマウスの4microgram /グラムの体重では毒性の両方であることがわかりました。アンタゴmir-29および制御2microgram /グラム体重で使用したが、この効果的な濃度は、各マイクロRNAについて変化する可能性があります。 - ステップ1で計算されるような所望の最終濃度に滅菌10％のD-グルコースとストック溶液とは別のマイクロチューブ中のペプチドとアンタゴを希釈します。
- 適度なボルテックス速度で渦のペプチド溶液をマイクロチューブにしてください。
- Aの1/3を追加します。ペプチド溶液チューブにntagomirソリューション、ゆっくりと、それはボルテックスミキサーで完全に混合されている間、滴下。
- 次の1分間ボルテックスで溶液の混合を続行した後、混合物を1分間放置します。
- 同じマイクロチューブ中のペプチド溶液と残りのアンタゴ溶液を混合するために、ステップ4と5をさらに2回繰り返します。ゆっくりとした添加は、トランスフェクションに有効である単分散複合体の形成に重要です。急速な添加は、複合体とその降水量の凝集につながることができます。
- ボルテックスすることなく、RTで30分間、複合体をインキュベートします。インキュベーションのこの時間の間に、注射が行われる研究室にマウスを慣らします。
アンタゴ-神経ペプチド複合体の3尾静脈注射
- 動物を拘束するために、適切なサイズの拘束またはdecapiconeでマウスを置きます。
- PR綿棒を使用して、尾部の表面を清掃してください温水（約40℃）で電子浸しました。これは、血管拡張を促進し、静脈の可視性を向上します。
- 15〜20°の角度で - （1.0 CC 0.5）のインスリン注射器、小容量で尾アプローチ。シリンジ内に空気を導入しないように注意してください。尾の先端部で開始します。複合体を注入します。針を外して、任意の出血を止めるために注射部位（約5〜10秒）に直接消毒綿棒を適用します。
- 濃縮としてトウモロコシの穂軸やティッシュペーパーで、3-5のグループ内の個別換気ケージにマウスを交換してください。同じケージに注射していないし、注射したマウスを保管しないでください。
4.行動アッセイ
注：注射後の回復を可能にするために注入し、行動アッセイの間に3〜4時間の時間間隔をおいてください。静かな部屋にマウスを持参してください。順化のこの期間中に、動物を邪魔しないでください。
- にマウスを順応新しい部屋で30分間、その後、次の行動アッセイを開始します。それぞれの行動分析の間に10分の間隔をおいてください。
- 後肢留め：
注：このテストは、運動機能障害および神経学的障害を示しています。- クリアなバックグラウンドで尾の近くにベースを保持して静かにマウスを持ち上げます。
- 10〜15秒間後肢位置を確認してください。運動失調マウス腹部に向かって時間の50％以上が13を停止し 、一方または両方の後肢を引っ込める傾向にある一方で、野生型マウスは、腹部から離れた後肢をsplays。
- ケージにマウスを返します
- レッジ試験：
- 尾を保持することによって静かにマウスを持ち上げて、ケージの棚に保管してください。
- ケージの隅で特異的にマウスを観察します。野生型マウスは、恐怖とバランスを失うことなく、容易にコーナーを渡すことができます。ケージ棚に沿ってコーナーに歩きながら運動失調マウスは、そのバランス、フリーズや揺れを失います。
- 片手で静かにマウスを持って、ブラシで後肢にインクを適用します。
- 狭い滑走路の床に吸収シートを配置します。
- マウスはもう一方の端から滑走路に直線的に吸収シートを歩いたり、上で実行できるようにします。
- 新鮮な吸収シートを使用して、それぞれのマウスを使用してプロセスをさらに2回繰り返します。
- 前進中の2つの連続したステップ間の距離を測定します。動物はちょうどそれぞれ、その実行を開始し、仕上げされた最初と最後の数足跡を含めないでください。
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Representative Results
ここに提示された手順を用いて、蛍光標識されたオリゴヌクレオチド50microgram（FLO）と〜1：15のモル電荷比の850microgramのRVGペプチドの複合体（FLO：ペプチド）を調製し、尾静脈を介して一回だけ注入しました。非神経向性狂犬病ウイルスのマトリックス（RVM）ペプチドおよびFLOの複合体は、配信対照として使用しました。翌日、マウスの脳および肝臓を単離し、単一細胞懸濁液を調製しました。細胞は緑色の蛍光を顕微鏡で観察しました。 FLO-RVG複合体が正常ではなくRVMペプチドは肝臓にはなく、脳細胞にFLOを配信しながら、肝臓（図2B、2D）における（脳細胞における緑色蛍光として一日の最短時間で配信され、検出されました図2A、2C）。
miR-29に対するマウス脳アンタゴにおけるmiR-29をノックダウンするには、5 LNA修飾と設計されました。アンタゴ-CONとして使用スクランブル、非miRNAを標的化配列トロール。 50microgramアンタゴ制御またはアンタゴmir-29の最大のノックダウン効果を達成するために、図1に示すよう〜850microgramのRVGペプチドは、毎日の行動分析、続いて調製し、3日間の時間経過にわたって尾静脈を介して注射したとの、複合体であった複雑な3日間連続1日1回注射しました。 4日目に行動アッセイを注入せずに行きました。マウスのフットプリント分析は、マウス（ 図3A-3B）注射アンタゴ-29 RVGのステップ長の有意な減少を示しました。アンタゴ-29 RVGのアッセイを握りしめ後肢は明らかにマウスを注射し、腹部に向けて一方または両方の後肢を撤回する傾向に失調挙動を示しました。レッジテストでアンタゴ-29 RVGをマウスに注射凍結またはケージの隅にバランスを喪失した行動を振って示しました。マウスは、塩酸キシラジン（16milligram / kg）および4日目チオペントンナトリウム（80milligram / kg）の（複合体の最後の注射後24時間）の注入によって安楽死させました。脳サンプルは、分子および細胞の分析を実行するために使用されました。皮質、小脳および海馬から収集全RNA。定量的リアルタイムPCRアッセイは、アンタゴmir-29 RVGにマウスの脳の部分を注入明確なのmiR-29の両方のアイソフォームの発現レベルの低下、のmiR-29A（ 図4A）及びmiR-29B（ 図4B）を示しました 。
マウスの尾静脈注射や動作については、図1のスキーマ。
脳内でのmiR-29を標的とするために、RVGペプチドを有するアンタゴmir制御またはアンタゴmir-29は、尾静脈を介して3日間連続1日1回注射しました。行動アッセイは、マウスは、注射から回復できるようにするために、3時間の期間後に、毎日行いました。 4日目にのみ行動アッセイを実施し、マウスを安楽死させ、脳組織は、リアルタイムPCRや携帯のお尻のために回収しましたays。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. RVGペプチドは、具体的には、マウスの脳に蛍光標識したオリゴヌクレオチドを提供しています。
この資料に記載された方法を用いて、複合体の蛍光標識オリゴヌクレオチド（FLO）およびペプチドRVG / RVMを調製し、尾静脈を介して一度だけ注入しました。 FLO-RVGの複合体はではなく、肝臓（B、D）での脳細胞における緑色蛍光として検出されたRVMペプチドは、肝臓ではなく、脳（A、C）9。にFLOを配信しながら、 拡大表示するにはここをクリックしてくださいこの図のバージョン。
図3のmiR-29は、運動失調性行動にリードをノックダウン。
4日目のマウスのフットプリントアッセイ（A）は、アンタゴ-29（B）（**）は、p -値<0.001で処理されたマウス用の2連続工程の間の距離の明らかな減少を示しました。 n = 3の（9から変更図）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4.アンタゴ-29とRVG複合体は、マウス脳におけるmiR-29を下方制御します。
全RNAは、3脳の部分から収集しました。定量的リアルタイムPCRアッセイのmiR-29、のmiR-29A（A）およびmiR-29bの両方のアイソフォームの発現レベル（B）を推定するために実施しました9から変更。） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 名 | シーケンス | 電荷 | 長さ |
| RVGペプチド | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGK RASN-GGGG-RRRRRRRRR * | 11 + | 41 |
| RVMペプチド | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSSPASA PLD-GGGG-RRRRRRRRR * | 11 + | 40 |
| アンタゴ制御（スクランブル） | 5 'C CAA T CGAC C AAのC 3' | 14 - | 14 |
| アンタゴ-29 | 5 'C AC T GA T AAA T GG 3 TT C' | 16 - | 16 |
| *アルギニンRVGとRVMペプチドのC末端の残基はD型です。 | |||
| アンタゴ配列中のLNA修飾塩基は下線を付しています。 |
表1のペプチドの配列とアンタゴ
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Other | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
References
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