Introduction
MicroRNAs surgiram como novos alvos terapêuticos devido ao seu papel universal na regulação da expressão gênica e evidência direta para o envolvimento na doença. MiRNAs estão sendo ativamente explorados por seu potencial como fármaco atinge 1,2. Além disso, alterações na expressão de miARN estão associados com várias doenças e 3 simulação da variação por perturbação expressão artificial de miARN pode ser usado para estudar as vias celulares envolvidas na manifestação da doença. Entrega específica do tecido de miRNA drogas que alvejam é atualmente um grande desafio para o desenvolvimento de drogas com base miRNA. Antagomirs e imita miARN são agentes promissores para perturbar os níveis de miARN 4-6. No entanto, as características especiais que melhoram a sua especificidade e eficácia tem que ser incorporado no desenho de antagomirs antes que eles possam ser utilizados in vivo para a perturbação da expressão miARN.
Os microRNAs são especialmente relevantes como alvos em neurodegenerativa atualmente incurável e doenças neuro-desenvolvimento. A barreira hemato-encefálica coloca uma restrição para a entrega de antagomirs no cérebro. Injecções estereotáxicas são amplamente utilizados em modelos de roedores para entregar moléculas para locais específicos no cérebro 7. Ele requer habilidade, grandes investimentos na instrumentação e no tempo. Injecções estereotáxicas são invasivos, envolver cirurgia, causar pelo menos lesões menores e são restritas a entrega local. A utilização de péptidos de células de penetração com uma preferência para os neurónios de segmentação pode contrariar estas limitações, uma vez que podem ser entregues por via trans-vascular, mas romper a barreira hemato-encefálica. Tal péptido derivado da glicoproteína do vírus da raiva (RVG), foi previamente utilizado para entregar siRNA contra vírus de encefalite japonesa em ratinhos 8. Descobrimos que utilizando o péptido para antagomir entrega, miRNAs pode ser efetivamente derrubado no cérebro do rato 9.
ontent "> O segundo grande desafio de miRNA knock-down é oriundo da pequena dimensão dos miRNAs ea presença de isoformas de sequências estreitamente relacionadas. Tomamos o exemplo de mmu-miR-29 da família que consiste em três isoformas estreitamente relacionadas, miR-29a , b e c. antagomirs são também geralmente modificado ao longo da espinha dorsal para aumentar a sua estabilidade e torná-las resistentes ao ataque por nucleases. Locked Nucleic Acid (LNAs) oferecem uma vantagem adicional que eles melhoram a estabilidade térmica e mesmo conduzir a alvejar degradação ao longo e para além impedimento estérico 10. Introduzindo modificações ao longo de toda a coluna vertebral pode ser eficaz, mas dispendioso. Temos anteriormente visto que as modificações para além de um número óptimo pode não aumentar ainda mais a eficácia. O desenho do antagomir envolve, por conseguinte, a modificação óptima do antagomir.Para o complexo antagomir de forma não covalente com o péptido neurotrópico, um hepta- carregada para o ramal de nona-arginina é utilizada. D-Argininaresíduos são utilizados, uma vez que conferem uma maior estabilidade, que não são susceptíveis a clivagem por proteases. Hepta para trechos nona-arginina agir agentes celulares penetrante como eficientes, embora eles não conferem especificidade tipo de célula. Por ligação covalente do péptido ao ligante RVG nona-arginina, um neurotrópico, célula penetrando péptido foi gerado. Os resíduos carregados positivamente do péptido interagir com a estrutura de ácido nucleico carregado negativamente, para formar complexos. Estes complexos podem ser utilizados para transfectar eficazmente ADN ou ARN em células em cultura e in vivo para os tecidos.
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Protocol
Nota: Todo o processo, incluindo indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Institucional Animais (AICE) do Instituto de Genômica e Biologia Integrativa, Nova Deli (IGIB / AEC / 10/2013). Este protocolo é adaptado especificamente para entrega direccionada de antagomir-29 no cérebro e knockdown de miR-29.
1. antagomir Design Estratégia
- Recuperar a sequência madura miRNA de miRBase 11 (http://www.mirbase.org/).
- Recuperar as sequências dos membros da família relacionadas miRNA usando o link "Gene Família" no registro miRBase
(Http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009). - Inverta a sequência complementar: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html proporciona uma ferramenta conveniente parainverter sequências do complemento.
- Marcar as posições a serem modificados por LNA usando as seguintes diretrizes:
- Escolha resíduos timina colocados 3-4 bases com excepção para a modificação LNA, desde pirimidinas LNA são mais estáveis do que 12 purinas.
- Escolha resíduos de citosina separadas por 3-4 resíduos se o passo anterior produz menos do que cinco modificações.
- Dar prioridade às cinco alterações à extremidade 5 'do antagomir, uma vez que isto evita a sequência de semente.
Preparação Complexo 2. antagomir-neuropeptídeo
Nota: Este é o passo mais crítico no protocolo e que necessita de padronização. Para padronizar o protocolo qualquer oligonucleótido marcado por fluorescência (FLO) pode ser usado em lugar do antagomir 9. Os péptidos devem ser de elevada pureza (qualidade para HPLC, 98% de pureza) .Sequences e carga do péptido e antagomir são dadas na Tabela 1.
- Decida o número de moles de antagomir a ser injectado com base na carga molar em antagomir, a sua toxicidade e o peso do rato. Calcular o número de moles de péptido a ser injectado com base na razão molar de carga antagomir: péptido.
NOTA: Padronizar razão de carga molar de antagomir: peptídeo de toxicidade e entrega efetiva no cérebro do rato. Use diferentes razões de carga molar de oligonucleotídeo marcado por fluorescência: peptídeo para a normalização. Descobrimos que antagomir-29 e controle foram tóxicos em 4microgram / grama de peso corporal do rato. Antagomir-29 e controlo foram usadas em 2microgram / grama de peso corporal, mas esta concentração eficaz é susceptível de variar para cada microARN. - Dilui-se o péptido e antagomir em tubos de microcentrífuga separados a partir de soluções de reserva estéril com 10% de D-glicose para a concentração final desejada, como calculado no passo 1.
- Manter o tubo de microcentrifugação com a solução de péptido em um vórtice no vórtex a velocidade moderada.
- Adicione 1/3 do umntagomir solução para o tubo de solução de péptido, lentamente, gota a gota, ao mesmo tempo que é muito bem misturado em um misturador de vórtice.
- Continue a misturar de soluções no vortex durante 1 minuto e em seguida, em seguida, deixar a mistura repousar durante 1 min.
- Repetir o passo 4 e 5 mais duas vezes para misturar o restante antagomir solução com a solução de péptido no mesmo tubo de microcentrífuga. A adição lenta é crítico para a formação de complexos mono-dispersa que são eficazes na transfecção. Adição rápida pode conduzir a agregação dos complexos e a sua precipitação.
- Incubar o complexo durante 30 min à temperatura ambiente sem agitação em vórtice. Durante este tempo de incubação, aclimatar os ratos para o laboratório onde as injecções serão realizados.
3. Injecção da veia da cauda do Complexo antagomir-neuropeptídeo
- Para conter o animal, coloque o mouse em uma restrainer ou decapicone de tamanho adequado.
- Limpar a superfície da cauda usando cotonete PRem água morna (cerca de 40 ° C) embebido-e. Isto vai promover a vasodilatação e aumentar a visibilidade da veia.
- Abordagem a cauda com um pequeno volume (0,5 - 1.0 cc) seringa de insulina com um ângulo de 15-20 °. Tenha cuidado para não introduzir qualquer ar dentro da seringa. Comece na porção distal da cauda. Injectar o complexo. Remover a agulha e aplicar um toalhete anti-séptico directamente no local da injecção (aproximadamente 5-10 s) para parar qualquer sangramento.
- Substituir o rato em uma gaiola ventilado individualmente no grupo de 3-5, com o carolo de milho e papel de seda como o enriquecimento. Não manter os ratos não injectados e injetadas no mesmo gaiola.
4. Os ensaios comportamentais
Nota: Mantenha o intervalo de tempo de 3-4 horas entre injeção e comportamentais ensaios para permitir a recuperação após a injecção. Traga o mouse para uma tranqüila. Não perturbe os animais durante este período de aclimatação.
- Aclimatar o mouse para anovo ambiente durante 30 minutos e, em seguida, iniciar os seguintes ensaios comportamentais. Manter um intervalo de 10 minutos entre cada ensaio comportamental.
- Clasping hindlimb:
NOTA: Este teste indica disfunção motora e comprometimento neurológico.- Levante o mouse suavemente, segurando perto da base da cauda no fundo claro.
- Verifique a posição dos membros posteriores de 10-15 seg. Tipo selvagem do rato splays membros posteriores longe do abdómen, enquanto um rato atáxica tende a retrair ou ambos os membros posteriores um em direcção ao abdómen mais do que 50% do tempo de suspensão 13.
- Devolver o mouse para a gaiola
- Teste Ledge:
- Levante o mouse suavemente, segurando a cauda e mantê-lo na borda de uma gaiola.
- Observar o ratinho especificamente no canto da gaiola. Rato do tipo selvagem pode passar os cantos facilmente sem medo e perder o equilíbrio. Rato Ataxic perder seu equilíbrio, congelar ou treme enquanto caminhava ao longo da borda gaiola e nos cantos.
- Segure o mouse suavemente por um lado e aplicar tinta nas patas traseiras por uma escova.
- Coloque a folha absorvente sobre o chão de uma pista estreita.
- Permitir mouse para caminhar ou correr sobre uma folha absorvente em uma linha reta em uma pista de decolagem de uma ponta a outra.
- Repetir o processo mais duas vezes com cada rato utilizando folha absorvente fresco.
- Medir a distância entre duas etapas consecutivas no movimento para a frente. Não incluem primeiro e últimos pegadas onde o animal é apenas iniciar e terminar sua corrida, respectivamente.
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Representative Results
Usando o processo aqui apresentado, os complexos de oligonucleótido marcado por fluorescência 50microgram (FLO) e ~ 850microgram RVG péptido de 01:15 proporção molar de carga (FLO: péptido) foram preparados e injectados apenas uma vez através da veia da cauda. Complexo de não-neurotrópico Matrix VÍRUS DA RAIVA (RVM) e FLO péptido foi utilizado como um controlo de entrega. No dia seguinte, os ratos cérebro e fígado foram isoladas e suspensões de células isoladas foram preparadas. As células foram observadas ao microscópio de fluorescência para verde. Complexo FLO-RVG foi entregue com sucesso, com um menor tempo de um dia e detectado como uma fluorescência verde nas células do cérebro, mas não no fígado (Figura 2B, 2D) enquanto RVM péptido entregue FLO para o fígado, mas não nas células do cérebro ( A Figura 2A, 2C).
Para knockdown miR-29 no cérebro do rato antagomir contra miR-29 foram projetados com cinco modificações LNA. O ovos mexidos, não-miRNA seqüência de direcionamento usado como um antagomir-controlo. Complexo de 50microgram antagomir-controlo ou com antagomir-29 ~ 850microgram RVG péptido foi preparado e injectado através da veia da cauda ao longo de um curso de tempo de 3 dias, seguido por ensaios de comportamento diário, como mostrado na Figura 1. A fim de conseguir o efeito máximo knockdown, os complexos eram injectada uma vez por dia durante 3 dias consecutivos. No quarto dia ensaios de comportamento foram realizadas sem injeção. Análise da pegada do rato mostrou redução significativa no comprimento do passo de antagomir-29 RVG injetaram em ratos (Figura 3A-3B). Hindlimb apertando ensaio de antagomir-29 RVG injetaram em ratos mostrou claramente o comportamento ataxic com tendência para retrair um ou ambos os membros posteriores em direção ao abdômen. No teste de borda antagomir-29 RVG injetaram em ratos mostrou congelamento ou agitação comportamento com perda de equilíbrio no canto da gaiola. Os ratinhos foram sacrificados por injecção de cloridrato de xilazina (16milligram / kg) e tiopental de sódio (80milligram / kg) no quarto dia (24 horas após a última injecção de complexo).Amostras do cérebro foram usadas para realizar a análise molecular e celular. RNA total arrecadado a partir do córtex, cerebelo e hipocampo. Ensaio quantitativo PCR em tempo real mostraram clara redução nos níveis de expressão de ambas as isoformas de miR-29, miR-29a (Figura 4A) e miR-29b (Figura 4B), no antagomir-29 RVG injectados ratos partes do cérebro.
Figura 1. Esquema para injecção na veia da cauda do rato e comportamento.
A fim de direccionar o miR-29 no cérebro, antagomir-controlo ou antagomir-29 com péptido RVG foi injectado uma vez por dia durante 3 dias consecutivos, através da veia da cauda. Os ensaios comportamentais foram realizados diariamente, após um período de 3 h, para permitir que o rato para se recuperar a partir da injecção. No quarto dia apenas ensaios comportamentais foram realizados e os ratos foram submetidos à eutanásia e tecido cerebral foi recolhido por PCR em tempo real e burro celularays. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. RVG péptido marcado por fluorescência oligonucleótido proporciona especificamente para o cérebro do rato.
Utilizando o método descrito neste artigo, os oligonucleótidos marcados com fluorescência de complexos (FLO) e péptido RVG / RVM foram preparados e injectados apenas uma vez através da veia da cauda. Complexo FLO-RVG foi detectada como uma fluorescência verde nas células cerebrais, mas não no fígado (B, D) enquanto RVM peptídeo entregue FLO para o fígado, mas não o cérebro (A, C) 9. Por favor clique aqui para ver um maior versão desta figura.
Figura 3. miR-29 derrubar leva ao comportamento ataxic.
Os ensaios de rato pegada (A) no quarto dia mostrou clara redução na distância entre duas etapas consecutivas para o rato tratado com antagomir-29 (B) (**) valor p <0,001; n = 3 (Figura modificado a partir do 9.) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. antagomir-29 e RVG complexo down-regula miR-29 no cérebro do rato.
O ARN total recolhido de três partes do cérebro. Ensaio quantitativo PCR em tempo real foi realizado para avaliar os níveis de expressão de ambas as isoformas de miR-29, miR-29a (A) e miR-29b (B) 9.) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome | Seqüência | Carga | Comprimento |
| RVG-péptido | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGK RASN-GGGG-rrrrrrrrr * | 11 + | 41 |
| RVM-péptido | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSSPASA PLD-GGGG-rrrrrrrrr * | 11 + | 40 |
| Antagomir-control (mexidos) | 5 'Um C CAA T CGAC C AA C 3' | 14 - | 14 |
| Antagomir-29 | 5 'C AC T GA T TT C AAA T GG 3' | 16 - | 16 |
| * Argininaresíduos na extremidade C-terminal de RVG RVM e péptidos estão na forma D. | |||
| LNA bases modificadas nas sequências antagomir estão sublinhadas. |
Tabela 1. Sequências de péptido e antagomirs
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Other | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
References
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