Introduction
Les microARN ont émergé comme de nouvelles cibles thérapeutiques en raison de leur rôle universel dans la régulation de l'expression des gènes et de preuve directe de l'implication dans la maladie. MiRNAs sont activement explorées pour leur potentiel en tant que médicament cible 1,2. En outre, dans l'expression des miARN altérations sont associées à plusieurs maladies 3 et simulation de ces changements par une perturbation artificielle d'expression des miARN peuvent être utilisées pour étudier les voies cellulaires impliquées dans la manifestation de la maladie. Livraison spécifique tissulaire de médicaments ciblant miARN est actuellement un défi majeur pour le développement de médicaments à base de miARN. Antagomirs et imite miARN sont des agents prometteurs pour perturber les niveaux de miARN 4-6. Cependant, les caractéristiques spéciales qui améliorent leur spécificité et l'efficacité doivent être intégrées dans la conception des antagomirs avant qu'ils ne puissent être utilisés pour perturbation in vivo d'expression des miARN.
Les microARN sont particulièrement pertinentes comme cibles dans neurodégénérative actuellement incurable et les maladies neuro-développementale. La barrière hémato-encéphalique constitue une restriction à la fourniture de antagomirs dans le cerveau. Injections stéréotaxiques sont largement utilisés dans les modèles de rongeurs pour délivrer des molécules à des endroits précis dans le cerveau 7. Il exige des compétences, d'importants investissements dans l'instrumentation et de l'heure. Injections stéréotaxiques sont envahissantes, implique la chirurgie, provoquer au moins des blessures légères et sont limitées à la livraison locale. L'utilisation de peptides de pénétration de cellules avec une préférence pour les neurones de ciblage peut contrer ces limitations, car ils peuvent être livrés par la voie trans-vasculaire, mais franchir la barrière hémato-encéphalique. Un tel peptide dérivé de la glycoprotéine virus de la rage (RVG), a déjà été utilisé pour délivrer siRNA contre le virus de l'encéphalite japonaise chez des souris 8. Nous avons trouvé que l'utilisation du peptide pour antagomir livraison, miARN peut être efficacement éliminé dans le cerveau de souris 9.
ontenu "> Le deuxième défi majeur de miARN knock-down découle de la petite taille des miARN et la présence d'isoformes de séquences étroitement liés. Nous prenons l'exemple de la MMU-miR-29 famille qui se compose de trois isoformes étroitement liés, miR-29a , b et c. antagomirs sont aussi généralement modifié le long de l'épine dorsale d'augmenter leur stabilité et les rendre résistant à l'attaque par des nucléases. Verrouillé Nucleic Acids (LNA) offrent un autre avantage à ce qu'ils améliorent la stabilité thermique et même conduire à cibler la dégradation au cours et au-delà 10 encombrement stérique. Présentation des modifications tout le long du squelette peut être efficace mais coûteux. Nous avons vu précédemment que des modifications au-delà d'un nombre optimal ne peuvent pas améliorer encore l'efficacité. La conception de l'antagomir implique donc la modification de la antagomir optimale.Pour le complexe antagomir non covalente avec le peptide neurotrophique, un hepta chargé de l'extension de nona-arginine est utilisé. D-arginineles résidus sont utilisés car ils confèrent une meilleure stabilité car ils ne sont pas sensibles au clivage par des proteases. Hepta à tronçons de nona-arginine Loi sur les agents de pénétration de cellules comme efficaces, même si elles ne confèrent pas de spécificité de type cellulaire. Par liaison covalente du peptide RVG au lieur nona-arginine, un neurotrope, pénétrant dans les cellules peptide a été généré. Les résidus chargés positivement du peptide d'interagir avec le squelette d'acide nucléique chargé négativement, pour former des complexes. Ces complexes peuvent être utilisés pour transfecter efficacement ADN ou d'ARN dans des cellules en culture et in vivo dans les tissus.
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Protocol
Remarque: Tous les sujets y compris la procédure d'animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel Animaux éthique (AIVE) à l'Institut de Génomique et biologie intégrative, New Delhi (IGIB / AEC / 10/2013). Ce protocole est particulièrement adaptée pour l'administration ciblée de antagomir-29 dans le cerveau et knock-down de miR-29.
1. Stratégie de conception antagomir
- Récupérer la séquence miARN mature à partir miRBase 11 (http://www.mirbase.org/).
- Récupérez les séquences de membres de la famille liés miRNA en utilisant le lien "Gene famille" dans le dossier de miRBase
(Http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009). - Inverser compléter la séquence: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html fournit un outil pratique pourinverser séquences complément.
- Marquez les positions être modifiés par LNA en utilisant les lignes directrices suivantes:
- Choisissez résidus thymine placés 3-4 bases en dehors de la modification de LNA, depuis pyrimidines de LNA sont plus stables que les purines 12.
- Choisissez résidus cytosine séparés par 3-4 résidus si l'étape précédente produit moins de cinq modifications.
- Prioriser les cinq modifications à l'extrémité 5 'de la antagomir, puisque cela évite la séquence de semences.
Préparation Complexe 2. antagomir-neuropeptide
Note: Ceci est l'étape la plus critique dans le protocole et il a besoin de normalisation. Pour standardiser le protocole tout oligonucléotide marqué par fluorescence (FLO) peut être utilisé à la place du antagomir 9. Les peptides devraient être de haute pureté (qualité HPLC, 98% de pureté) et .Sequences charge de peptide et antagomir sont donnés dans le tableau 1.
- Déterminez le nombre de Mode les antagomir à injecter sur la base de la charge molaire de antagomir, sa toxicité et de poids de la souris. Calculer le nombre de moles de peptide à être injecté basée sur rapport de charge molaire de antagomir: peptide.
NOTE: Normaliser rapport de charge molaire de antagomir: peptide pour la toxicité et la prestation efficace dans le cerveau de la souris. Utilisez différents rapports de charge molaire de l'oligonucléotide marqué par fluorescence: peptide de normalisation. Nous avons constaté que antagomir-29 et de contrôle étaient à la fois toxique à 4microgram / gramme de poids corporel de souris. Antagomir-29 et de contrôle ont été utilisés au poids corporel 2microgram / gramme, mais cette concentration efficace est susceptible de varier pour chaque microARN. - Diluer le peptide et antagomir dans des tubes de microcentrifugation séparer les solutions mères avec le D-glucose stérile à 10% de la concentration finale souhaitée, tel que calculé à l'étape 1.
- Maintenir le tube de centrifugeuse avec la solution de peptide sur un vortex à la vitesse de tourbillonnement modéré.
- Ajouter 1/3 de l'unntagomir solution dans le tube de solution de peptide, lentement, goutte à goutte, pendant qu'il est bien mélangé sur un mélangeur vortex.
- Continuer de mélanger des solutions sur le vortex pendant 1 min suivantes, puis laisser le mélange reposer pendant 1 min.
- Répétez l'étape 4 et 5 deux fois de plus à mélanger la solution restante antagomir avec la solution de peptide dans le même tube de microcentrifugation. L'addition lente est critique pour la formation de complexes mono-dispersée qui sont efficaces pour la transfection. Plus rapide peut conduire à l'agrégation des complexes et leur précipitation.
- Incuber le complexe pendant 30 min à la température ambiante sans agitation au vortex. Pendant ce temps d'incubation, les souris s'acclimater au laboratoire où les injections seront réalisées.
3. L'injection de la veine caudale Complexe antagomir neuropeptide-
- Pour retenir l'animal, placer la souris dans un dispositif de retenue ou decapicone de la bonne taille.
- Nettoyer la surface de la queue en utilisant un coton-tige pre-imbibée d'eau tiède (environ 40 ° C). Cela permettra de promouvoir la vasodilatation et accroître la visibilité de la veine.
- Approchez la queue avec un petit volume (0,5 à 1,0 cc) seringue à insuline à un angle de 15-20 °. Veillez à ne pas introduire de l'air dans la seringue. Commencez par la partie distale de la queue. Injecter du complexe. Retirer l'aiguille et appliquer un tampon antiseptique directement au site d'injection (environ 5-10 sec) pour arrêter le saignement.
- Remplacer la souris dans une cage ventilée individuellement dans le groupe de 3-5, à l'épi de maïs et du papier de soie que l'enrichissement. Ne gardez pas les souris non-injecté et injectés dans la même cage.
4. comportementales Assays
Remarque: Conservez l'intervalle de temps de 3-4 heures entre injection et comportementaux tests pour permettre la récupération après l'injection. Apportez la souris dans une chambre calme. Ne pas déranger les animaux pendant cette période d'acclimatation.
- Acclimater la souris vers lanouvelle ambiante pendant 30 min, puis commencer les tests comportementaux suivants. Gardez un espace de 10 min entre chaque test de comportement.
- Accrochage postérieur:
NOTE: Ce test indique un dysfonctionnement du moteur et des troubles neurologiques.- Soulevez doucement la souris en maintenant près de la base de la queue dans le fond clair.
- Vérifiez la position des membres postérieurs pour 10-15 sec. Ébrasements de souris de type sauvage membres postérieurs loin de l'abdomen, alors qu'une souris ataxique tend à rétracter un ou les deux membres postérieurs en direction de l'abdomen de plus de 50% du temps mis en suspension 13.
- Retour de la souris à la cage
- Test de Ledge:
- Soulevez doucement la souris en maintenant la queue et le garder sur le rebord d'une cage.
- Observez la souris spécifiquement à l'angle de la cage. Souris de type sauvage peut passer facilement les coins sans peur et sans perdre l'équilibre. Souris Ataxique perdre son équilibre, gel ou secoue tout en marchant le long de la corniche de la cage et dans les coins.
- Maintenez la souris doucement une main et appliquer de l'encre sur les membres postérieurs par une brosse.
- Placez la feuille absorbante sur le plancher d'une piste étroite.
- Laisser la souris pour marcher ou courir sur une feuille absorbante en ligne droite dans une piste d'un bout à l'autre.
- Répétez le processus deux fois de plus avec l'aide de la souris feuille absorbante frais.
- Mesurer la distance entre deux étapes consécutives dans le mouvement vers l'avant. Ne pas inclure les premiers et derniers quelques empreintes où l'animal est tout simplement lancer et terminer sa course, respectivement.
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Representative Results
En utilisant la procédure présentée ici, des complexes d'oligonucléotide 50microgram marqué par fluorescence (FLO) et ~ 850microgram RVG peptide de 1:15 rapport de charge molaire (FLO: peptide) ont été préparés et injectés qu'une seule fois par veine de la queue. Complexe de non-neurotrope virus de la rage Matrix (RVM) peptide et FLO a été utilisé comme un contrôle de livraison. Le jour suivant, les souris cerveau et le foie ont été isolés et des suspensions cellulaires simples ont été préparées. Les cellules ont été observées au microscope pour la fluorescence verte. Complexe FLO-RVG a été remis avec succès avec un temps plus court d'une journée et détecté comme une fluorescence verte dans les cellules du cerveau mais pas dans le foie (Figure 2B, 2D) tandis que RVM peptide livré FLO pour le foie, mais pas dans les cellules du cerveau ( la figure 2A, 2C).
Pour knockdown miR-29 dans le cerveau de souris contre antagomir miR-29 ont été conçus avec cinq modifications de LNA. Le brouillés, non-miARN séquence de ciblage utilisé comme antagomir-concontrôle. Complexe de 50microgram antagomir-contrôle ou antagomir-29 avec ~ 850microgram RVG peptide a été préparé et injecté à travers veine de la queue sur un parcours de temps de 3 jours, suivie par des dosages quotidiens de comportement comme le montre la figure 1. Afin d'obtenir un effet maximal knockdown, complexes étaient injecté une fois par jour pendant 3 jours consécutifs. Le quatrième jour tests de comportement ont été réalisés sans injection. Analyse de l'empreinte de la souris ont montré une réduction significative de la durée de l'étape de antagomir RVG-29 injecté les souris (Figure 3A-3B). Hindlimb joignant dosage de antagomir-29 RVG injecté des souris a montré clairement le comportement ataxie avec une tendance à se rétracter un ou deux membres postérieurs vers l'abdomen. Dans le test de corniche antagomir-29 RVG injecté des souris a montré le gel ou en secouant le comportement avec perte d'équilibre, à l'angle de la cage. Les souris ont été euthanasiées par une injection de chlorhydrate de xylazine (16milligram / kg) et le thiopental sodique (80milligram / kg) sur le quatrième jour (24 heures après la dernière injection de complexe).Les échantillons de cervelle ont été utilisés pour effectuer l'analyse moléculaire et cellulaire. L'ARN total ont été recueillies à partir de cortex, le cervelet et de l'hippocampe. Dosage quantitatif de PCR en temps réel a montré nette réduction des niveaux d'expression des deux isoformes de miR-29, miR-29a (figure 4A) et miR-29b (figure 4B), dans le antagomir-29 RVG injecté parties du cerveau de souris.
Figure 1. Schéma pour injection dans la veine de la queue de la souris et le comportement.
Afin de cibler miR-29 dans le cerveau, antagomir-contrôle ou antagomir-29 avec RVG peptide a été injecté une fois par jour pendant 3 jours consécutifs par veine de la queue. Analyses comportementales ont été effectuées chaque jour, après une période de 3 heures, pour permettre à la souris pour récupérer de l'injection. Sur quatrième jour seulement tests comportementaux ont été effectués et les souris ont été euthanasiés et les tissus du cerveau ont été recueillies pour la PCR en temps réel et le cul cellulaireays. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. RVG délivre peptide marqué par fluorescence oligonucléotide spécifiquement dans le cerveau de la souris.
En utilisant la méthode décrite dans cet article, oligonucléotides complexes du marquées par fluorescence (FLO) et peptide RVG / RVM ont été préparés et injectés qu'une seule fois par veine de la queue. Complexe FLO-RVG a été détecté comme une fluorescence verte dans les cellules du cerveau, mais pas dans le foie (B, D), tandis que RVM peptide livré FLO pour le foie, mais pas le cerveau (A, C) 9. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.
Figure 3. miR-29 abattre conduit au comportement ataxie.
Analyses de l'empreinte de la souris (A) sur le quatrième jour ont montré une réduction nette distance entre deux étapes consécutives de la souris traitée avec antagomir-29 (B) (**) valeur p <0,001; n = 3 (Figure modifiée à partir de 9.) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. antagomir-29 et RVG complexe régule à la baisse miR-29 dans le cerveau de souris.
L'ARN total recueilli de trois parties du cerveau. Dosage quantitatif en temps réel a été réalisée pour PCR estimer les niveaux d'expression des deux isoformes de miR-29, miR-29a (A) et miR-29b (B) 9.) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| prénom | Séquence | Charger | Longueur |
| RVG-peptide | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGK RASN-GGGG-RRRRRRRRR * | 11 + | 41 |
| RVM-peptide | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSSPASA PLD-GGGG-RRRRRRRRR * | 11 + | 40 |
| Antagomir-commande (brouillés) | 5 'A C T CAA ACJC C AA C 3' | 14 - | 14 |
| Antagomir-29 | 5 'C AC T T TT GA C T AAA GG 3' | 16 - | 16 |
| * Argininerésidus à l'extrémité C-terminale de la RVG et RVM peptides sont en forme D. | |||
| Bases modifiées LNA dans les séquences antagomir sont soulignés. |
Tableau 1. Séquences des peptides et antagomirs
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Other | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
References
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