Introduction
ظهرت MicroRNAs كأهداف علاجية جديدة بسبب الدور العالمي في تنظيم التعبير الجيني وأدلة مباشرة للمشاركة في المرض. ويجري بحث MiRNAs بنشاط لإمكاناتهم كأهداف المخدرات 1،2. وعلاوة على ذلك، ترتبط التعديلات في التعبير ميرنا مع العديد من الأمراض 3 والمحاكاة من هذه التغييرات اضطراب الاصطناعي من ميرنا التعبير يمكن استخدامها لدراسة مسارات الخلوية المشاركة في مظاهر المرض. الأنسجة تسليم محددة من ميرنا المخدرات تستهدف حاليا تحديا كبيرا لتطوير الأدوية ميرنا القائمة. Antagomirs ويحاكي ميرنا وكلاء واعدة لاحداث بلبلة مستويات ميرنا 4-6. ومع ذلك، السمات الخاصة التي تعزز خصوصيتها والفعالية يجب أن تكون دمجها في تصميم antagomirs قبل أنها يمكن أن تستخدم في الجسم الحي اضطراب ميرنا التعبير.
MicroRNAs هي ذات الصلة خاصة كأهداف في الاعصاب غير قابل للشفاء حاليا والأمراض العصبية التطورية. حاجز الدم في الدماغ يشكل قيدا لتسليم antagomirs في الدماغ. يتم استخدام الحقن المجسم على نطاق واسع في نماذج القوارض لتسليم الجزيئات في مواقع محددة في الدماغ 7. فهو يتطلب مهارة والاستثمار المكثف في الأجهزة والوقت. حقن المجسم هي الغازية، تنطوي عملية جراحية، تسبب ما لا يقل عن قاصر الإصابة وتقتصر على التسليم المحلي. استخدام الخلايا اختراق الببتيدات مع تفضيل الخلايا العصبية التي تستهدف يمكن مواجهة هذه القيود لأنها يمكن أن يتم تسليمها عبر الطريق عبر الأوعية الدموية ولكن اختراق حاجز الدم في الدماغ. هذا الببتيد المستمدة من فيروس داء الكلب البروتين السكري (RVG)، وكان يستخدم في السابق لتسليم سيرنا ضد فيروس التهاب الدماغ الياباني في الفئران 8. لقد وجدنا أن استخدام الببتيد لantagomir التسليم، miRNAs يمكن أن تكون فعالة ترسيتها في مخ الفأر 9.
ontent "> إن التحدي الرئيسي الثاني للميرنا تدق إلى أسفل ينشأ من صغر حجم miRNAs وجود إيسفورمس تسلسل ارتباطا وثيقا. نحن نأخذ مثال MMU-مير 29 عائلة التي تتكون من ثلاثة إيسفورمس ترتبط ارتباطا وثيقا، مير-29A و b و c. كما المعدلة Antagomirs عموما على طول العمود الفقري لزيادة استقرارها وجعلها مقاومة للهجوم من قبل nucleases. مغلق الأحماض النووية (LNAs) توفر ميزة أخرى أنها تعزز الاستقرار الحراري وتؤدي إلى استهداف تدهور أكثر وخارجها عائق الفراغية 10. تقديم تعديلات على طول العمود الفقري يمكن أن تكون فعالة ولكنها مكلفة. لقد رأينا في وقت سابق أن التعديلات يتجاوز العدد الأمثل قد لا تزيد من تعزيز فعالية. وبالتالي، فإن تصميم antagomir ينطوي على تعديل الأمثل للantagomir.لمجمع antagomir غير تساهمي مع الببتيد موجه للعصب، واتهم سباعي لتمديد NONA أرجينين يستخدم. D-ارجينينوتستخدم المخلفات لأنها تمنح أعلى الاستقرار لأنها ليست عرضة للانشقاق من قبل البروتياز. سباعي إلى NONA أرجينين مساحات العمل خلية اختراق كلاء فعالة قدر، على الرغم من أنها لا تضفي نوع من الخلايا خصوصية. من خلال ربط تساهمي الببتيد RVG إلى رابط NONA أرجينين، وهو موجه للعصب، تم إنشاء خلية اختراق الببتيد. بقايا موجبة الشحنة من الببتيد تتفاعل مع الشحنة السالبة العمود الفقري الحمض النووي، لتشكيل المجمعات. هذه المجمعات يمكن استخدامها ل transfect فعال DNA أو RNA في الخلايا المستزرعة والحية في الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات بما في ذلك المواد الحيوانية جنة المؤسسي الحيوانات الأخلاقيات (هيئة الطاقة الذرية) في معهد علم الجينوم والبيولوجيا التكاملية، نيودلهي (IGIB / AEC / 10/2013). ويتم تعديل هذا البروتوكول خصيصا لاستهداف تسليم Antagomir-29 في الدماغ وضربة قاضية من مير-29.
1. استراتيجية تصميم Antagomir
- استرداد تسلسل ميرنا ناضجة من miRBase 11 (http://www.mirbase.org/).
- استرداد متواليات من أفراد الأسرة ميرنا المتعلقة باستخدام الرابط "جين العائلة" في السجل miRBase
(http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl؟fam=MIPF0000009). - عكس تكمل التسلسل: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html يوفر أداة ملائمة لعكس تسلسل المتممة.
- بمناسبة المواقف التي يمكن تعديلها من قبل LNA باستخدام الإرشادات التالية:
- اختيار بقايا ثايمين وضعت 3-4 قواعد بصرف النظر عن تعديل LNA، منذ البريميدينات LNA هي أكثر استقرارا من البيورينات 12.
- اختيار بقايا السيتوزين مفصولة 3-4 بقايا إذا الخطوة السابقة تنتج أقل من خمسة تعديلات.
- أولويات التعديلات الخمسة إلى 5 'نهاية antagomir، لأن هذا يتجنب تسلسل البذور.
2. Antagomir-نيوروبيبتيدي إعداد مجمع
ملاحظة: هذه هي الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول ويحتاج التوحيد. لتوحيد بروتوكول أي قليل النوكليوتيد fluorescently المسمى (FLO) يمكن استخدامها في مكان antagomir 9. يجب أن يكون الببتيدات عالية النقاء (HPLC الصف، 98٪ نقاء) وترد .Sequences والمسؤول عن الببتيد وantagomir في الجدول 1.
- قرر عدد من موليه من antagomir ليتم حقنه على أساس تهمة المولي على antagomir، سميتها والوزن من الفأرة. احسب عدد مولات الببتيد ليتم حقنه على أساس نسبة تهمة المولي من antagomir: الببتيد.
ملاحظة: توحيد نسبة تهمة المولي من antagomir: الببتيد لسمية والتسليم الفعال في دماغ الفأر. استخدام نسب مختلفة تهمة المولي من قليل النوكليوتيد fluorescently المسمى: الببتيد لتوحيد. وجدنا أن Antagomir-29 و الرقابة سواء كانت سامة في 4microgram / غرام من وزن الجسم من الماوس. واستخدمت Antagomir-29 والسيطرة على 2microgram / غرام من وزن الجسم، ولكن من المرجح أن تختلف عن كل الرنا الميكروي هذا التركيز الفعال. - تمييع الببتيد وantagomir في أنابيب microfuge منفصلة عن الحلول الأسهم العقيمة مع 10٪ D-الجلوكوز إلى التركيز النهائي على النحو المرغوب فيه المحسوبة في الخطوة 1.
- الحفاظ على microfuge أنبوب مع حل الببتيد في دوامة في معتدلة السرعة vortexing ل.
- إضافة 1/3 الثالثة من لحل ntagomir إلى أنبوب حل الببتيد، ببطء، وانخفاض الحكمة، في حين يتم مزجه جيدا في خلاط دوامة.
- مواصلة خلط الحلول على دوامة لمدة 1 دقيقة المقبل ومن ثم السماح للخليط الوقوف لمدة 1 دقيقة.
- كرر الخطوة 4 و 5 مرتين أكثر لمزج ما تبقى من antagomir الحل مع حل الببتيد في نفس microfuge أنبوب. إضافة بطيئة أمر بالغ الأهمية لتشكيل المجمعات أحادية تفريق تكون فعالة في ترنسفكأيشن. السريعة بالإضافة إلى ذلك يمكن أن يؤدي إلى تجميع المجمعات وهطول الأمطار بهم.
- احتضان المجمع لمدة 30 دقيقة في RT دون vortexing ل. خلال هذا الوقت من الحضانة، والتأقلم الفئران إلى المختبر حيث سيتم إجراء الحقن.
3. الذيل الوريد حقن مجمع Antagomir-نيوروبيبتيدي
- لكبح جماح الحيوان، ضع الماوس في رادع أو decapicone من الحجم المناسب.
- تنظيف السطح من الذيل باستخدام مسحة القطن العلاقات العامةفي ماء دافئ (حوالي 40 درجة مئوية) غارقة ه. وهذا تشجيع توسع الأوعية وزيادة وضوح الوريد.
- الاقتراب من الذيل مع حجم صغير (0،5-1،0 سم مكعب) حقنة الانسولين في زاوية 15-20 درجة. يجب الحرص على عدم إدخال أي الهواء في حقنة. تبدأ في الجزء الأعلى من الذيل. حقن المجمع. إزالة الإبرة وتطبيق مسحة مطهر مباشرة إلى موقع الحقن (حوالي 5-10 ثانية) لوقف أي نزيف.
- استبدال الماوس في قفص التهوية بشكل فردي في مجموعة من 3-5، مع كوز الذره والمناديل الورقية كما تخصيب اليورانيوم. لا تبقي الفئران uninjected وحقن في نفس القفص.
4. السلوكي فحوصات
ملاحظة: الحفاظ على الفاصل الزمني من 3-4 ساعة في المقايسات بين الحقن والسلوكية للسماح للانتعاش بعد الحقن. جلب الماوس إلى غرفة هادئة. لا تخل هذه الحيوانات خلال هذه الفترة من التأقلم.
- التأقلم الماوس إلىغرفة جديدة لمدة 30 دقيقة ثم بدء فحوصات السلوكية التالية. الحفاظ على فجوة من 10 دقيقة بين كل فحص السلوكي.
- الشبك Hindlimb:
ملاحظة: هذا الاختبار يبين ضعف الحركية وإعاقة للجهاز العصبي.- رفع الماوس بلطف من خلال عقد بالقرب من قاعدة الذيل في الخلفية واضحة.
- التحقق من موقف hindlimb لمدة 10-15 ثانية. النوع البري splays الماوس hindlimbs بعيدا عن البطن، في حين أن الماوس رنحي يميل إلى التراجع واحد أو كلا hindlimbs نحو البطن أكثر من 50٪ من وقت علقت 13.
- عودة الماوس إلى القفص
- الحافة الاختبار:
- رفع الماوس برفق عن طريق الضغط على الذيل ويبقيه على الحافة من القفص.
- مراقبة الماوس على وجه التحديد في ركن من أركان القفص. النوع البري الماوس يمكن أن تمر زوايا بسهولة دون خوف وفقدان التوازن. الماوس رنحي يفقد توازنه، تجميد أو يهز في حين أن المشي على طول الحافة القفص وعند الزوايا.
- عقد الماوس بلطف بواسطة يد واحدة وتطبيق حبر على أطرافه الخلفية بواسطة فرشاة.
- وضع ورقة ماصة على أرضية مدرج ضيق.
- السماح الماوس على المشي أو الجري على ورقة ماصة في خط مستقيم في المدرج واحدة من نهاية إلى أخرى.
- تكرار هذه العملية مرتين أخريين مع كل فأر باستخدام ورقة ماصة جديدة.
- قياس المسافة بين خطوتين متتاليتين في حركة إلى الأمام. لا تشمل آثار أقدام القليلة الأولى والأخيرة حيث الحيوان هو مجرد بدء والانتهاء من شوطه، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام الإجراء المقدمة هنا والمجمعات من قليل النوكليوتيد 50microgram fluorescently المسمى (FLO) و ~ 850microgram RVG الببتيد من 1:15 المولي نسبة المسؤول: تم إعداد (FLO الببتيد) وحقنه مرة واحدة فقط خلال الوريد الذيل. وقد استخدم المجمع من غير موجه للعصب مصفوفة فيروس داء الكلب (RVM) الببتيد وFLO كعنصر تحكم التسليم. وفي اليوم التالي، الفئران الدماغ والكبد وقد تم عزل وأعدت تعليق خلية واحدة. وقد لوحظت الخلايا تحت المجهر لمخضر. تم تسليم مجمع FLO-RVG بنجاح مع أقصر وقت يوم واحد والكشف عن مضان أخضر في خلايا المخ ولكن ليس في الكبد (الشكل 2B، 2D)، في حين RVM الببتيد تسليم FLO إلى الكبد ولكن ليس في خلايا الدماغ ( الشكل 2A، 2C).
ضربة قاضية مير-29 في antagomir دماغ الفأر ضد صممت مير-29 مع خمسة تعديلات LNA. وسارعت وعدم ميرنا استهداف تسلسل استخدامها بوصفها Antagomir الاشتراكاتالمحول المتعدد العادي. مجمع 50microgram Antagomir السيطرة أو Antagomir-29 مع ~ أعد 850microgram RVG الببتيد وحقن عن طريق الوريد الذيل خلال دورة زمنية لمدة 3 أيام، تليها المقايسات السلوك اليومية كما هو مبين في الشكل 1. من أجل تحقيق أكبر قدر من التأثير ضربة قاضية، كانت المجمعات حقن مرة واحدة في اليوم لمدة 3 أيام متواصلة. وفي اليوم الرابع تم إجراء فحوصات السلوك بدون حقن. وأظهر تحليل البصمة الماوس تخفيض كبير في طول الخطوة من Antagomir-29 RVG حقن الفئران (الشكل 3A-3B). Hindlimb الشبك فحص من Antagomir-29 RVG حقن الفئران أظهرت بوضوح السلوك رنحي مع ميل للتراجع عن واحد أو كلا hindlimbs نحو البطن. في اختبار الحافة حقن Antagomir-29 RVG الفئران أظهرت تجميد أو تهز السلوك مع فقدان التوازن في ركن من أركان القفص. الموت الرحيم كانت الفئران عن طريق الحقن من هيدروكلوريد زيلازين (16milligram / كلغ) وثيوبينتون الصوديوم (80milligram / كغم) في اليوم الرابع (24 ساعة بعد الحقن الأخير من مجمع).استخدمت عينات الدماغ لأداء التحليل الجزيئي والخلوي. مجموع RNA التي تم جمعها من القشرة، المخيخ والحصين. أظهر الكمي في الوقت الحقيقي PCR مقايسة انخفاض واضح في مستويات التعبير عن كل من إيسفورمس مير-29، مير-29A (الشكل 4A) ومير 29B (الشكل 4B)، في Antagomir-29 RVG حقن أجزاء الدماغ الفئران.
الشكل 1. مخطط لذيل الماوس الوريد الحقن والسلوك.
من أجل استهداف مير-29 في الدماغ، تم حقن Antagomir السيطرة أو Antagomir-29 مع RVG الببتيد مرة واحدة في اليوم لمدة 3 أيام متتالية من خلال الوريد الذيل. وأجريت فحوصات السلوكية يوميا، وبعد فترة 3 ساعات، للسماح الماوس للتعافي من الحقن. أجريت يوم الرابع المقايسات السلوكية فقط والموت الرحيم كانت الفئران وجمعت أنسجة المخ في الوقت الحقيقي PCR والحمار الخلوي آيس. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. RVG الببتيد يسلم fluorescently المسمى قليل النوكليوتيد خصيصا لمخ الفأر.
باستخدام الطريقة الموصوفة في هذه المقالة، تم إعداد أليغنوكليوتيد معقدة من fluorescently المسمى (FLO) والببتيد RVG / RVM وحقنه مرة واحدة فقط خلال الوريد الذيل. تم الكشف عن مجمع FLO-RVG باعتباره مخضر في خلايا المخ ولكن ليس في الكبد (B، D)، في حين RVM الببتيد تسليم FLO إلى الكبد ولكن ليس الدماغ (A، C) 9. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر نسخة من هذا الرقم.
her.within صفحة = "1"> 
الشكل 3. مير 29 نهدم يؤدي إلى سلوك رنحي.
وأظهرت فحوصات البصمة الماوس (A) في اليوم الرابع انخفاض واضح في المسافة بين اثنين من خطوات متتالية للماوس تعامل مع Antagomir-29 (B) (**) ص -value <0.001؛ ن = 3 (الشكل المعدل من 9.) يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. Antagomir-29 و RVG مجمع أسفل ينظم مير-29 في مخ الفأر.
مجموع RNA جمع من ثلاثة أجزاء الدماغ. تم تنفيذ الكمي في الوقت الحقيقي PCR مقايسة لتقدير مستويات التعبير عن كل من إيسفورمس مير-29، مير-29A (A) ومير 29B (B) 9.) يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم | تسلسل | تهمة | الطول |
| RVG الببتيد | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGK RASN-GGGG-RRRRRRRRR * | 11 + | 41 |
| RVM الببتيد | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSSPASA PLD-GGGG-RRRRRRRRR * | 11 + | 40 |
| Antagomir السيطرة (مجاهد) | 5 'A C CAA T CGAC C AA C 3 " | 14 - | 14 |
| Antagomir-29 | 5 'C AC T GA T TT C AAA T GG 3' | 16 - | 16 |
| * ارجينينبقايا في نهاية C-الطرفية من RVG وRVM الببتيدات هي في D-النموذج. | |||
| وأكد LNA القواعد المعدلة في تسلسل Antagomir. |
الجدول 1. متواليات الببتيد وAntagomirs
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Other | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
References
- Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases. Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).
- Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease and other Human CNS Disorders. Current Genomics. 10, 154-168 (2009).
- Soifer, H. S., Rossi, J. J., Saetrom, P. MicroRNAs in Disease and Potential Therapeutic Applications. Mol Ther. 15, 2070-2079 (2007).
- Bader, A. G., Brown, D., Winkler, M. The Promise of MicroRNA Replacement Therapy. Cancer research. 70, 7027-7030 (2010).
- Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3, 1-17 (2012).
- Trang, P., et al. Systemic Delivery of Tumor Suppressor microRNA Mimics Using a Neutral Lipid Emulsion Inhibits Lung Tumors in Mice. Molecular Therapy. 19, 1116-1122 (2011).
- Barbash, S., Hanin, G., Soreq, H. Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome. J Vis Exp. (76), e50170 (2013).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Roshan, R., et al. Brain-specific knockdown of miR-29 results in neuronal cell death and ataxia in mice. RNA. 20, 1287-1297 (2014).
- Kaur, H., Wengel, J., Maiti, S. Thermodynamics of DNA−RNA Heteroduplex Formation: Effects of Locked Nucleic Acid Nucleotides Incorporated into the DNA Strand. Biochemistry. 47, 1218-1227 (2008).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, D140-D144 (2006).
- Kaur, H., Babu, B. R., Maiti, S. Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked Nucleic Acid (LNA). Chemical Reviews. 107, 4672-4697 (2007).
- Guyenet, S. J., et al. A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia. J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Bergen, J. M., Park, I. -K., Horner, P. J., Pun, S. H. Nonviral Approaches for Neuronal Delivery of Nucleic Acids. Pharmaceutical Research. 25, 983-998 (2008).
- Zou, L. -L., Ma, J. -L., Wang, T., Yang, T. -B., Liu, C. -B. Cell-Penetrating Peptide-Mediated Therapeutic Molecule Delivery into the Central Nervous System. Current Neuropharmacology. 11, 197-208 (2013).
- Hwang, D. W., et al. A brain-targeted rabies virus glycoprotein-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of neurogenic microRNA. Biomaterials. 32, 4968-4975 (2011).
