Introduction
MikroRNA'er er dukket op som hidtil ukendte terapeutiske mål på grund af deres universelle rolle i reguleringen af genekspression og direkte beviser for involvering i sygdom. MiRNA bliver aktivt udforsket for deres potentiale som lægemiddel rettet mod 1,2. Endvidere er ændringer i miRNA ekspression er forbundet med adskillige sygdomme 3 og simulering af disse ændringer ved kunstig forstyrrelse af miRNA ekspression kan anvendes til at studere cellulære veje, der er involveret i sygdommen manifestation. Vævsspecifik levering af miRNA målretning narkotika er i øjeblikket en stor udfordring for miRNA baseret lægemiddeludvikling. Antagomirs og miRNA efterligner er lovende midler til forstyrrende miRNA niveauer 4-6. Særlige funktioner, der forbedrer deres specificitet og effekt har dog skal indarbejdes i udformningen af antagomirs, før de kan bruges til in vivo forstyrrelse af miRNA udtryk.
MikroRNA'er er særligt relevante som mål i øjeblikket uhelbredelige neurodegenerative og neuro-udviklingsmæssige sygdomme. Blod-hjerne-barrieren udgør en begrænsning af leveringen af antagomirs i hjernen. Stereotaktiske injektioner er meget udbredt i gnavermodeller at levere molekyler til bestemte steder i hjernen 7. Det kræver dygtighed, omfattende investeringer i instrumentering og tid. Stereotaktiske injektioner er invasive, indebærer kirurgi, forårsager mindst mindre skade, og er begrænset til lokal levering. Anvendelsen af cellepenetrerende peptider med en præference for målretning neuroner kan imødegå disse begrænsninger, da de kan leveres gennem trans-kar rute, men bryde blod-hjerne-barrieren. Et sådant peptid afledt af rabiesvirus glycoprotein (RVG), er tidligere blevet anvendt til at levere siRNA mod japansk encephalitis virus i mus 8. Vi fandt, at bruge peptid til antagomir levering, kan miRNA være effektivt slået ned i musen hjernen 9.
Indholdsproduktion "> Den anden store udfordring af miRNA knock-down skyldes den lille størrelse af miRNA og tilstedeværelsen af nært beslægtede sekvens isoformer. Vi tager eksemplet med MMU-miR-29 familie, som består af tre nært beslægtede isoformer, miR-29a , b og c. Antagomirs generelt også ændres langs rygraden til at øge deres stabilitet og gøre dem modstandsdygtige over for angreb fra nukleaser. Locked Nucleic Acids (LNA) tilbyder en yderligere fordel, at de forbedrer termisk stabilitet og endda føre til at målrette nedbrydning over og ud sterisk hindring 10. Introduktion modifikationer langs rygraden kan være effektiv, men dyrere. Vi har tidligere set, at modifikationer udover et optimalt antal ikke yderligere at forbedre effektiviteten. Udformningen af antagomir involverer derfor den optimale ændring af antagomir.Til kompleks antagomir ikke-kovalent med neurotropisk peptid, en ladet hepta- til nona-arginin forlængelse er brugt. D-argininrester anvendes, da de medfører højere stabilitet, da de ikke er modtagelige for spaltning med proteaser. Hepta- til Nona-arginin strækninger fungere som effektive cellepenetrerende midler, selv om de ikke giver celletypespecificitet. Ved kovalent binding RVG peptidet til nona-arginin linker, neurotropisk, cellepenetrerende peptid blev genereret. De positivt ladede rester af peptidet interagerer med negativt ladet nukleinsyre rygrad, til dannelse af komplekser. Disse komplekser kan anvendes til effektivt at transficere DNA eller RNA i dyrkede celler og in vivo i væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Alt proceduren herunder animalske emner er blevet godkendt af Institutional Dyr etiske komité (IAEC) på Institut for Genomforskning og Integrativ Biologi, New Delhi (IGIB / AEC / 10/2013). Denne protokol er specielt tilpasset til målrettet levering af Antagomir-29 i hjernen og knockdown af MIR-29.
1. Antagomir Design Strategy
- Hent den modne miRNA sekvensen fra miRBase 11 (http://www.mirbase.org/).
- Hent sekvenserne af beslægtede miRNA familiemedlemmer ved hjælp af "Gene Familie" linket i miRBase rekord
(Http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009). - Reverse supplerer sekvensen: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html giver et praktisk værktøj tilreverse komplement sekvenser.
- Markere de holdninger, der skal ændres af LNA hjælp af følgende retningslinjer:
- Vælg thymin-rester placeret 3-4 baser fra hinanden for LNA ændring, eftersom LNA pyrimidiner er mere stabile end puriner 12.
- Vælg cytosinrester adskilt af 3-4 rester, hvis forrige trin producerer mindre end fem ændringer.
- Prioritere de fem ændringer til 5 'enden af antagomir, da dette undgår frøet sekvens.
2. Antagomir-neuropeptid Complex Forberedelse
Bemærk: Dette er det mest kritiske trin i protokollen, og den har brug for standardisering. At standardisere protokollen helst fluorescensmærket oligonukleotid (FLO) kan anvendes i stedet for antagomir 9. Peptiderne bør være af høj renhed (HPLC-kvalitet, 98% renhed) .Sequences og ladningen af peptid og antagomir er angivet i tabel 1.
- Beslut antallet af moles af antagomir skal injiceres baseret på molære ladning på antagomir, dets toksicitet og vægt af musen. Beregne antallet af mol peptid, der skal injiceres baseret på molære ladningsforhold på antagomir: peptid.
BEMÆRK: Standardiser molære ladning forhold mellem antagomir: peptid for toksicitet og effektiv levering i musen hjernen. Brug forskellige molære ladningsforhold af fluorescerende mærket oligonukleotid: peptid til standardisering. Vi fandt, at Antagomir-29 og kontrol var begge toksiske ved 4microgram / gram legemsvægt mus. Antagomir-29 og kontrol blev brugt ved 2microgram / g kropsvægt, men denne effektive koncentration kan variere for hver microRNA. - Peptidet og antagomir i separate mikrofugerør fra stamopløsninger med sterilt 10% D-glucose til den ønskede slutkoncentration fortyndes som beregnet i trin 1.
- Hold mikrofugerøret med peptidet løsning på en hvirvel ved moderat omhvirvling hastighed.
- Tilføj 1/3 rd af enntagomir løsning til peptidet glasset, langsomt, dråbevis, mens den blandes grundigt på en vortex-blander.
- Fortsæt opblanding af løsninger på vortex for næste 1 min og lad blandingen stå i 1 min.
- Gentag trin 4 og 5 to gange for at blande de resterende antagomir opløsningen med peptidet opløsning i den samme mikrofugerør. Langsom tilsætning er kritisk for dannelsen af mono-disperse komplekser, der er effektive i transfektion. Hurtig tilsætning kan føre til aggregering af komplekser og deres udfældning.
- Inkubér komplekset i 30 minutter ved stuetemperatur uden hvirvelbehandling. I løbet af denne inkubationstid, akklimatisere musene til laboratoriet, hvor injektioner vil blive udført.
3. haleveneinjektion af Antagomir-neuropeptid Complex
- At begrænse dyret, skal du placere musen i en fastholdelsesanlæg eller decapicone på ordentlig størrelse.
- Rengør overfladen af halen ved hjælp vatpind pre-dyppet i varmt vand (ca. 40 ° C). Dette vil fremme vasodilatation og øge synligheden af venen.
- Nærmer halen med et lille volumen (0,5 - 1,0 cc) insulinsprøjte i en 15-20 ° vinkel. Vær forsigtig med ikke at indføre nogen luft ind i sprøjten. Start ved den distale del af halen. Injicere komplekset. Fjern kanylen og anvende en antiseptisk vatpind direkte til injektionsstedet (ca. 5-10 sek) for at stoppe blødning.
- Udskift musen i en individuelt ventilerede bur i gruppen af 3-5, med majskolbe og silkepapir som berigelse. Må ikke holde uinjicerede og injicerede mus i samme bur.
4. Adfærdsmæssige Analyser
Bemærk: Hold tidsinterval på 3-4 timer mellem injektion og adfærdsmæssige analyser for at tillade genvinding efter injektion. Bring musen til et stille rum. Forstyr ikke dyrene i denne periode af akklimatisering.
- Akklimatisere musen tilnyt rum i 30 min og derefter starte følgende adfærdsmæssige analyser. Hold en afstand på 10 minutter i mellem hver adfærdsmæssige analyse.
- Bagben Lukning:
BEMÆRK: Denne test viser motorisk dysfunktion og neurologisk svækkelse.- Løft musen forsigtigt ved at holde nær haleroden i klar baggrund.
- Kontroller bagbenet stilling til 10-15 sek. Vildtypemusen splays bagben væk fra maven, mens en ataxiske mus har tendens til at trække den ene eller begge bagben mod maven mere end 50% af tiden suspenderet 13.
- Retur musen til buret
- Ledge test:
- Løft musen forsigtigt ved at holde halen og holde det på afsatsen af et bur.
- Overhold musen specifikt på hjørnet af buret. Vildtypemusen kan passere hjørner let uden frygt og miste balancen. Ataxic mus miste sin balance, fryse eller ryster, mens du går langs buret afsats og i hjørnerne.
- Hold musen forsigtigt med én hånd og anvende blæk på bagbenene af en pensel.
- Placer absorberende ark på gulvet i en smal bane.
- Tillad musen til at gå eller køre over et absorberende lag i en lige linje i en bane fra den ene ende til anden.
- Gentag processen to gange mere med hver mus med friske absorberende ark.
- Måle afstanden mellem to på hinanden følgende trin i fremadgående bevægelse. Medtag ikke første og sidste par fodspor hvor dyret bare indlede og efterbehandling dens løb, hhv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under anvendelse af fremgangsmåden, der præsenteres her, komplekser af 50microgram fluorescensmærket oligonukleotid (FLO) og ~ 850microgram RVG peptid 1:15 molært ladningsforhold: blev (FLO peptid) fremstilles og injiceres én gang gennem halevenen. Kompleks af ikke-neurotropisk rabiesvirus Matrix (RVM) peptid og FLO blev anvendt som en levering kontrol. Næste dag blev mus hjerne og lever isoleret og enkeltcelle-suspensioner blev fremstillet. Celler blev observeret under mikroskop for grøn fluorescens. FLO-RVG kompleks blev succes leveret med en korteste én dag og detekteret som en grøn fluorescens i hjerneceller, men ikke i leveren (figur 2B, 2D), mens RVM peptid leveret FLO til leveren, men ikke i hjerneceller ( Figur 2A, 2C).
At knockdown miR-29 i musehjernen antagomir mod miR-29 er designet med fem LNA modifikationer. Scrambled, ikke-miRNA målsekvens anvendes som Antagomir-conkontrol. Kompleks af 50microgram Antagomir-styring eller Antagomir-29 med ~ 850microgram RVG peptid blev fremstillet og injiceret via halevenen i en 3 dages tidsforløb, efterfulgt af daglige adfærd assays som vist i figur 1. For at opnå maksimal virkning knockdown, var komplekser injiceres en gang om dagen i 3 sammenhængende dage. På fjerde dag adfærd blev udført uden injektion. Mus footprint-analyse viste signifikant reduktion i trin længde Antagomir-29 RVG injicerede mus (figur 3A-3B). Bagben knugede assay af Antagomir-29 RVG injicerede mus viste klart ataxic adfærd med tendens til at trække den ene eller begge bagben mod maven. I afsats testen Antagomir-29 RVG injicerede mus viste frysning eller ryster adfærd med tab af balance på hjørnet af buret. Mus blev aflivet ved injektion af xylazin-hydrochlorid (16milligram / kg) og natrium-thiopenton (80milligram / kg) på fjerde dag (24 timer efter den sidste injektion af komplekset).Hjerneprøver blev anvendt til at udføre molekylær og cellulær analyse. Total RNA opsamlet fra cortex, cerebellum og hippocampus. Kvantitativ real time PCR assay viste tydelig reduktion i ekspressionsniveauerne af både isoformer af MIR-29, MIR-29a (figur 4A) og MIR-29b (figur 4B), i Antagomir-29 RVG injicerede mus hjerne dele.
Figur 1. Skema for muse haleveneinjektion og adfærd.
For at målrette miR-29 i hjernen, blev Antagomir-styring eller Antagomir-29 med RVG peptid injiceres en gang om dagen i 3 dage i træk gennem halevenen. Adfærdsmæssige assays blev udført dagligt, efter en 3 timers periode, for at tillade musen at komme sig efter injektion. På fjerde dag kun adfærdsmæssige analyser blev udført, og musene blev aflivet og hjernevæv blev indsamlet til real time PCR og cellulære røvays. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. RVG peptid leverer fluorescensmærket oligonukleotid specifikt til musehjernen.
Anvendelse af fremgangsmåden beskrevet i denne artikel fremgangsmåde blev kompleks af fluorescensmærkede oligonukleotider (FLO) og peptid RVG / RVM fremstillet og injiceret én gang gennem halevenen. FLO-RVG kompleks blev opdaget som en grøn fluorescens i hjernecellerne, men ikke i leveren (B, D), mens RVM peptid leveret FLO til leveren, men ikke hjernen (A, C) 9. Klik her for at se et større version af denne figur.
Figur 3. miR-29 banke ned fører til den ataxic adfærd.
Mus footprint assays (A) på fjerde dag viste tydelig reduktion i afstanden mellem to på hinanden følgende trin for behandlet med Antagomir-29 (B) mus (**) p-værdi <0,001; n = 3 (figur modificeret fra 9.) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Antagomir-29 og RVG kompleks nedregulerer miR-29 i mus hjerne.
Total RNA opsamlet fra tre hjerne dele. Kvantitativ real time PCR assay blev udført for at estimere ekspressionsniveauer af begge isoformer af MIR-29, MIR-29a (A) og MIR-29b (B) 9.) Klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn | Sekvens | Oplade | Længde |
| RVG-peptid | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGK RASN-GGGG-RRRRRRRRR * | 11 + | 41 |
| RVM-peptid | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSSPASA PLD-GGGG-RRRRRRRRR * | 11 + | 40 |
| Antagomir-kontrol (krypteret) | 5 'En C CAA T CGAC C AA C 3' | 14 - | 14 |
| Antagomir-29 | 5 'C AC T GA T TT C AAA T GG 3' | 16 - | 16 |
| * Argininrester i den C-terminale ende af RVG og RVM peptider er i D-form. | |||
| LNA modificerede baser i Antagomir sekvenser er understreget. |
Tabel 1. Sekvenser af peptid og Antagomirs
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Other | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
References
- Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases. Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).
- Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease and other Human CNS Disorders. Current Genomics. 10, 154-168 (2009).
- Soifer, H. S., Rossi, J. J., Saetrom, P. MicroRNAs in Disease and Potential Therapeutic Applications. Mol Ther. 15, 2070-2079 (2007).
- Bader, A. G., Brown, D., Winkler, M. The Promise of MicroRNA Replacement Therapy. Cancer research. 70, 7027-7030 (2010).
- Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3, 1-17 (2012).
- Trang, P., et al. Systemic Delivery of Tumor Suppressor microRNA Mimics Using a Neutral Lipid Emulsion Inhibits Lung Tumors in Mice. Molecular Therapy. 19, 1116-1122 (2011).
- Barbash, S., Hanin, G., Soreq, H. Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome. J Vis Exp. (76), e50170 (2013).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Roshan, R., et al. Brain-specific knockdown of miR-29 results in neuronal cell death and ataxia in mice. RNA. 20, 1287-1297 (2014).
- Kaur, H., Wengel, J., Maiti, S. Thermodynamics of DNA−RNA Heteroduplex Formation: Effects of Locked Nucleic Acid Nucleotides Incorporated into the DNA Strand. Biochemistry. 47, 1218-1227 (2008).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, D140-D144 (2006).
- Kaur, H., Babu, B. R., Maiti, S. Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked Nucleic Acid (LNA). Chemical Reviews. 107, 4672-4697 (2007).
- Guyenet, S. J., et al. A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia. J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Bergen, J. M., Park, I. -K., Horner, P. J., Pun, S. H. Nonviral Approaches for Neuronal Delivery of Nucleic Acids. Pharmaceutical Research. 25, 983-998 (2008).
- Zou, L. -L., Ma, J. -L., Wang, T., Yang, T. -B., Liu, C. -B. Cell-Penetrating Peptide-Mediated Therapeutic Molecule Delivery into the Central Nervous System. Current Neuropharmacology. 11, 197-208 (2013).
- Hwang, D. W., et al. A brain-targeted rabies virus glycoprotein-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of neurogenic microRNA. Biomaterials. 32, 4968-4975 (2011).
