Summary
淀粉样蛋白β(Aβ)-injected动物模型能够确定的数量和Aβ片段的物种的管理,并降低每个研究组内的个体差异。本协议描述Aβ的脑室(ICV)注射立体定向仪,使生产正常小鼠老年痴呆样行为异常。
Introduction
鉴于淀粉样蛋白β(Aβ)是阿尔茨海默氏病(AD)的一个病理标志,AD动物模型的发展集中于Aβ的神经过度表达。因为在淀粉样前体蛋白(APP)或早老(PS)的突变导致Aβ的平衡的干扰,并最终以家族性AD 1的发病机制,涉及APP或PS基因突变的小鼠模型已被普遍接受。之间的宽范围的转基因小鼠的,典型的小鼠模型包括如下:的Tg2576,PDAPP,APP / PS1和APP23。在大脑中,这些小鼠通常显示出Aβ凝聚并最终老年斑;噬菌斑形成后跟显著认知障碍,使得它们显示在学习和记忆的行为测试性能不佳。利用转基因小鼠自然地模仿人类的AD病理的产生使我们能够监测迪的发展也由此促成了AD研究会sease。但是,使用转基因小鼠是不经济的和费时的,因为它需要几个月的小鼠发展的Aβ斑块和甚至更长的时间才能显示Aβ诱导的突触或行为异常2,3。最初开发作为替代克服转基因小鼠模型的缺点,非转基因模型通常也由于其独特的优点使用。病原体诱导的AD模型可以通过直接注射的Aβ进入大脑产生,而AD样认知缺陷也可以通过其它化学和物理触发装置 - 如注射如东莨菪碱的神经毒性的化合物,病变的感应在认知相关的领域,如海马,或皮质伤害4。然而,所述非致病性的诱导的认知损害不能准确反映AD的根本病理生理学;相反,它只是模仿其症状的结果。相反,病原体诱导AD模型中,A46; -injected小鼠模型,不仅可以显示AD样行为异常也可以表现出Aβ病理,由家族性和散发AD共享的公共功能。
尽管以可视化的Aβ斑块在脑组织中的困难,这使得它对于AD调查吸引力Aβ注射模型的最大好处是它的可控制性。研究人员可以淘汰在小鼠模型中的个体差异,可能导致错误的数据与毒品有关的研究。及时的药物治疗是根据所述候选药物的机制使能;阐述,Aβ聚集抑制剂可以Aβ注射前被应用。此外,研究人员可以假定致病变换Aβ注射后产生从Aβ的曝光衍生,因为其它因素严格控制,包括个体差异。
在这个协议中,H生动的描述流诱导Aβ经脑室(ICV)注射正常小鼠的AD样表型立体定向仪呈现。减少到脑组织插入挑起损伤是至关重要的,以防止结构损坏和损伤诱导的炎症的可能性。缺乏在鼠标操作技能导致意想不到的神经元损伤。此外,技术,使相应的角度和深度的注射过程来实现是规避失误频频尤其重要。除了ICV注射的详细,生动的说明中,通过以下方案所产生的模型的可靠性在下面的章节也示出。下面的协议可能是一个可靠的,易于理解的工具,有助于AD的研究,从而提供一个跳板,可能最终导致一个有意义的发现为AD的社会。
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Protocol
所有的动物实验均按照健康指南实验动物的护理和使用的国家机构进行(NIH出版物号8023,修订1978),并与机构的动物护理和使用委员会的动物护理和使用委员会KIST(韩国首尔)。
1.动物的制备
- 准备一组7周龄雄性ICR小鼠(或C57BL / 6)。
- 让老鼠经过驯化过程3-7天运输后恢复动态平衡。在一般情况下,把一组4-5只在每个笼子并予以保持在22-23℃和40%湿度,用12/12小时亮/暗循环。提供的水和食物随意 。
注:驯化过程中是至关重要的,以允许从航运和适应新的住房,食物,水的压力恢复,嗅觉以及一个新的笼子和光照周期。在该实验中,小鼠被安置在位于所述的Spe独立通气笼(IVCS)cific病原(SPF)设施-grade - 称量每只小鼠和排除受试者的重量从平均偏离±10%。
- 划分受试者分为两组:一媒介物注射组(Aβ( - ))和Aβ注射组(Aβ(+))。如果该实验是测试特定候选药物的疗效,划分小鼠分成四组:(1)将Aβ( - )/药物( - ),(2)将Aβ( - )/药物(+),(3) Aβ(+)/药物( - ),和(4)将Aβ(+)/药物(+)。
2.Aβ肽制剂
- 治疗的Aβ肽,通过化学合成5或从商业来源得到,与预冷的1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)以溶解任何聚集体和使均匀6的肽。
- 超声处理在水浴超声波仪的Aβ/ HFIP溶液中5分钟(RT),轻轻涡旋,并在室温下孵育30分钟的溶液中。通过完全用氮气蒸发取出HFIP并在-80℃储存均匀的Aβ直到使用。
- 制备Aβ单体:(100μM的Aβ,10%DMSO,90%的PBS)使1毫Aβ二甲基亚砜(DMSO)储备和稀释10倍的磷酸盐缓冲盐水(PBS)
- 准备Aβ寡聚体。
- 在37℃下孵育的Aβ单体溶液(含有Aβ(1-42)或Aβ(1-40))(步骤2.2)。3或7天,分别。
- 放置在含有湿纸巾,以提供加湿环境,以防止在潜伏期水蒸发拉链袋在密封管中的Aβ溶液。
- 确认通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),用未修饰的蛋白6的光致交联制备的Aβ寡聚体。
- 制备含有10%DMSO的用于车辆的ICV注射对照PBS溶液。
3.注射器制剂
注意:封口膜的压缩将导致在注射超过3.6毫米腹侧的深度。为了防止封口膜的针插入过程中被压缩,密裹针多次。
4.Aβ注入小鼠模型的制备方法
注意:用消毒以保持无菌条件和消毒使用70%的乙醇和UV曝光ICV注射所有手术器械清洁操作场。
- 由甲苯噻嗪(20毫克/千克)和替来他明的混合物腹膜内注射麻醉小鼠·HCl的/唑拉西泮·HCl的(80毫克/千克)在ICV注射之前。放置在一个温暖的垫鼠标,以保持体温,而麻醉,通过评估脚捏响应确认足够的麻醉。
- 应用无菌PBS下降到双眼,以防止该过程( 图1B)中的角膜干。
- 在difficu的情况下,提请他们表面上的多个直线的垂直线准备两个镜子LTY垂直注入注射器。
- 放置一个反射镜(M1),在头部的前端旁边的小鼠的身体和其他(M2)。保持M1平行于鼠标的两只眼睛之间的假想中线和安排M2垂直于M1,从而使两个平面形成一个90°角( 图1C)。放置在鼠标的左侧M1如果研究人员是右撇子。将M1鼠标的右侧,如果研究人员是左撇子。
- 喷70%乙醇到鼠标的额头中间,并用干棉签擦。不要弄湿太大前额的区域的,以避免降低体温由于醇的蒸发。
- 使用一块干净棉签用2%洗必泰溶液的额头上同一地区。与酒精和氯己定总量的各三次重复洗涤才能。
注意:如果需要,为了尽量减少possi剃鼠标的前额上发污染的相容性 - 找到前囟门。
- 用拇指和食指紧紧按住前额的皮肤,直接在上面两只眼睛到双眼突出的程度。皮肤拖回使前额绷紧,尽量减少皮肤下的头骨动作。
- 通过分配三个顶点形成一种无形的三角形:鼠标的两只眼的地步拇指和食指相遇,前囟门。 ( 图 1B,红色箭头:前囟门)
- 找到注射点用卷尺:-1.0±0.06毫米后到前囟,1.8±0.1毫米外侧矢状缝,和2.4毫米的深度( 图1D,蓝色恒星:注射点在每个半球)。 (对于B6小鼠:-0.9毫米后,1.7毫米的横向和2.2毫米深)
- 填用10微升的Aβ溶液或车辆用过量溶液注射器,以避免意外的空气喷射。
- 发生在第注射器Ë注入点(4.7协议所述)。使注射器垂直于注射点的平面。对齐反映在从一个固定的角度( 图1C)上的反射镜画线这两个镜像注射器的图像。
- 开始直到封口膜包裹到达皮肤插入针。
- 保持手拿着注射器稳定,用另一只手注资50微升的Aβ溶液或车辆,慢慢地在5秒内没有暂停。确保注射器保持垂直贯穿始终。在完成注射后,对扩散除去注射器之前等待3到5秒。
- 假设原三角形的位置,施加适度的压力,以保护头骨从任何多余的动作。无需倾斜取下注射器。
- 放置在暖垫Aβ注入鼠标恢复并保持胸骨斜卧。不要让鼠标无人看管,直到它恢复意识,并不会返回并购乌斯含非手术小鼠,直到它已经完全康复笼。
- 按照步骤3.3-3.6洗注射器。
- 术后监测小鼠的流动性,并在小鼠中检查感染或疾病的任何迹象为5-7天。
图1.Aβ注射入ICV区域 (A)封口膜包裹的注射器针头相比未改良的注射器针头。 (B)PBS滴到眼睛,防止干燥;形成了鼠标的拇指,食指额头上的三角形和鼠标的两只眼睛以及虚中线从每只眼睛的距离相等; (C)的两个反射镜(M1和M2)的表面上绘制的,以协助垂直注射器针头的注射多个垂直线; (D)的与所述注入点的三角形,印度语ated为蓝色恒星(前囟从-1.0±0.06毫米和1.8矢状位±0.1 mm)公鼠的每个半球;绿箭:封口膜,红色箭头:前囟门请点击此处查看该图的放大版本。
5.确认Aβ注射液的Y型迷宫,脑分析
- 评估通过Y迷宫测试3,7,8Aβ注射小鼠的工作记忆
- 等待3天注射记忆障碍发病后。
- 执行使用黑色塑料迷宫与三个相同的臂的Y-迷宫测试标记为A,B和C,其中每个分支出来从迷宫的中心的120°的角度(宽×长×高为10厘米×40厘米×12厘米)。
- 放置在启动臂(臂A)的小鼠,并允许受自由地探索迷宫8分钟。
- 测量条目的数量到每个臂并计算altern每个主题3,9的通货膨胀率。
- 直接检查死后的大脑,以检查是否注入适当的目标区域ICV。
- 麻醉由相同的步骤以小鼠为4.1节所述。然后牺牲颈椎脱位鼠标。
- 斩首鼠标和去除皮肤用手术剪,露出头骨。从头骨移除组织和肌肉。
- 就在人字缝(之间的顶和interparietal骨)切口不损坏大脑。取出后枕部和interparietal骨头,然后是顶叶和额叶的骨头。使用镊子除去颅骨和通过抬起脑膜隔离从头骨大脑。
- 洗冷却无菌盐水脑和切脑的侧脑室区域中用手术刀( 图2)的冠方向。
- 确认基于所述针插入对跟踪注射区域脑组织( 图2)。检查针迹已达到心室之一。如果针迹不符合或穿过心室,从实验结果的分析排除受验者的数据。
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Representative Results
此部分示出了可以由Aβ聚集和记忆障碍的Y-迷宫评估确认来得到的结果的例子。使用全长Aβ制作(1-42)的42个氨基酸,Aβ单体,低聚物的混合物,和原纤维( 图3)的肽。通过HFIP诱导monomerization步骤,获得相对均匀的单体(泳道B)。 7天孵化后,Aβ聚集体(泳道C)的不同尺寸的发展。三聚体和四聚体Aβ的寡聚形式中的主导品种。空间工作记忆经由在Y迷宫测试交替在Aβ注射小鼠评估。而每个鼠被允许自由地探索迷宫的臂的选择顺序和总臂条目的数量的记录。更完好的认知能力,更多的鼠标应该有进入较少最近访问了手臂,阿尔特趋势rnating其手臂的选择。该Aβ注射组小鼠表现出显著低利率交替,表明认知缺陷( 图4)的发展。
图2. ICV注射 ( 一 )冠向脑切片较前囟门10和可接受的注射范围(从囟-1.0±0.06毫米和1.8±0.1毫米矢状位)的位置示意图的例子 。 (B - C)成功ICV注射的情况下(A:全脑,C的顶视图:冠状断面示出填充有蓝染料侧脑室); (D - E)的不成功ICV注射(D 的情况:在整个脑部的顶视图中,E:冠状部分示出在第三和第四已经ntricles充满蓝色染料)蓝色圆圈和方向:注射部位,蓝星:潜在注入点请点击此处查看该图的放大版本。
图3.制备 通过SDS-PAGE 一个 β物种 的确定 。Aβ肽通过SDS-PAGE分离与未修饰的蛋白质的光诱导的交联。肽条带通过银染色观察;车道(A)的蛋白质标记物,泳道(B)Aβ单体(孵化前)和莱恩(C)孵育Aβ种类。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4. Y-迷宫行为测试。所述Aβ-百分比交替或媒介物注射的小鼠组在Y迷宫测试。白色固体图:车辆(Aβ( - ),N = 10)。条纹图:Aβ注射(Aβ(+),N = 9)。统计分析用单向ANOVA随后的Bonferroni的事后比较进行(* P <0.05,** P <0.01,*** P <0.001)。误差条代表了中小企业。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在这个协议中最重要的步骤是Aβ的ICV注射。该协议被设计为注射的Aβ到小鼠ICV区而不立体定向仪11,12。在开始实验之前,实践注射用蓝色染料代替Aβ初步期间应该发生达到足够灵巧。注射后立即,有必要检查颜料喷射是否正确执行。小心取出大脑,并检查相应的区域是否被染成蓝色。着色线应达到,但不超过,该ICV区域的深度。 90%的成功率,这是经过50以上的ICV注射一般能达到的最低限度,建议。在ICV注射,避免通过注入矢状窦(接近前囟零点)损伤血管。
Aβ注射后,统计学显著记忆损伤观察在Aβ注射组,并使用Y型迷宫行为测试对照组D之间。不同类型的行为实验可以适用于测试认知障碍,如Morris水的程度迷宫13,目标识别和被动回避测试以及恐惧条件。 Morris水迷宫被用来检查海马空间记忆障碍,而恐惧条件用于测试海马依赖的联想学习和杏仁核,海马通信。一个特定对象的对象识别是适合的AD相关的认知缺损的测量,和被动回避可用于测试动物的记的厌恶刺激3的能力。以制备类似体重和年龄的小鼠,如果他们将经受利用电击,如恐惧条件和被动回避试验行为测试是非常重要的。建议在上述的试验是要进行在记忆障碍发病10天。由于它证实了Aβ是在海马后ICV注射14发现,进一步研究是必要的,以找到涉及与ICV注射的Aβ的亲和力其他脑区行为测试。
所述Aβ肽的制备和侧脑室注射的时间应取决于实验目的精心设计,并应考虑:(1)将Aβ(单体,低聚物,原纤维,或它们的混合物)的物种; (2)将Aβ(Aβ40,Aβ42,截断Aβ25-35,及其他)15-18的同种型; (3)将Aβ注射的时间点;和(4)的Aβ曝光后的延迟时间。例如,建议使用Aβ单体的注入,如果将小鼠进行的抑制Aβ单体,如聚合的异常活动的药物的施用。可溶性Aβ寡聚体的注射是suggested。如果研究的目的是评估神经毒性或炎症所引起的低聚物。如果调查旨在研究不溶性的Aβ和相关病理7,19建议高度综合的Aβ种类的注入。如果实验旨在测试的Aβ聚集抑制剂的效力,所述化合物一般应之前施加或与Aβ的沿,而Aβ清剂或抗炎化合物应当Aβ注射后给药。
相比于转基因或AD的慢性模型中,Aβ注入小鼠模型使研究人员能够控制Aβ的浓度,AD样表型的发作,并有大量疯狂老鼠的同步发展。这些优势提供自由相对于实验设计和广泛的机会去研究。考虑AD的发病机制更加密切相关的慢性暴露,而不是在A&突然飙升#946;大脑中的浓度,使用转基因模型更多的试验,建议从加强利用Aβ注射的小鼠模型中得出的结论。此外,由于tau蛋白是AD的另一个重要原因,tau蛋白和Aβ注射小鼠模型的发展可以进一步推进AD研究会。
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Acknowledgments
这项研究是由通过韩国保健产业振兴院(KHIDI),由卫生部和福利,韩国(:H14C04660000授权号)资助的韩国保健技术研发项目的资助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
ICR mouse | Orientbio | male, 6-8 weeks, 27-29 g of body weight | |
C57BL/6 mouse | Orientbio | male, 6-8 weeks, 21-23 g of body weight | |
Amyloid-beta1-42 | in house synthesis | stock concentration: 1 mM/DMSO, injected concentration: 100 μM/10% DMSO and 90% PBS | |
ICV injection syringe (26s gauge) | Hamilton | 80308 | |
Evans blue dye (EBD) | abcamBIochemicals | ab120869 | 1% EBD in PBS |
DMSO | Sigma | D2650 | |
PBS | gibco | 10010-023 | |
Gradi-GelTM II Gradient PAGE Analysis Kit | ELPiS Biotech | EBS-1056 | 15% Gel |
Precision Plus ProteinTM Dual Xtra Standards | Bio-Rad | 161-0377 | |
Silver-Staining Kit | GE-Healthcare | 17-1150-01 | |
LabDiet | Orientbio | 5053 |
References
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