Summary
Le amyloïde-β (Aß) -injected modèle animal permet à l'administration d'une quantité et d'espèces de fragments Aß défini et réduit les différences individuelles au sein de chaque groupe d'étude. Ce protocole décrit l'injection intracérébroventriculaire (ICV) de Aß sans instrument stéréotaxique, ce qui permet la production d'anomalies du comportement de type Alzheimer chez les souris normales.
Introduction
Étant donné que l'amyloïde-β (Aß) est une caractéristique pathologique de la maladie d'Alzheimer (AD), le développement de modèles animaux AD a mis l'accent sur la surexpression neuronal de Aß. Parce que les mutations dans la protéine précurseur de l' amyloïde (APP) ou de la préséniline (PS) , conduisent à des perturbations de l' équilibre Aß et , finalement , à la pathogenèse de la MA familiale 1, les modèles de souris portant les mutations du gène APP ou PS ont été généralement accepté. Parmi le large éventail de souris transgéniques, des modèles de souris prototypiques sont les suivants: Tg2576, PDAPP, APP / PS1 et APP23. Dans le cerveau, ces souris présentent généralement une agrégation Aß et éventuellement des plaques séniles; la formation de plaque est suivie par des troubles cognitifs importants tels qu'ils montrent une faible performance dans les tests comportementaux de l'apprentissage et de la mémoire. La génération de l'utilisation de souris transgéniques qui imitent naturellement la pathologie AD humaine a ainsi contribué à la société de recherche de AD en nous permettant de suivre la progression de la diSease. Cependant, en utilisant des souris transgéniques est peu rentable et prend du temps car il faut plusieurs mois pour les souris pour développer des plaques d' Aß et plus encore pour montrer synaptique induite par Aß ou des anomalies comportementales 2,3. Développé à l'origine comme une alternative à surmonter les inconvénients des modèles de souris transgéniques, les modèles non transgéniques sont également couramment utilisés en raison de leurs avantages distincts. modèles AD induite par Pathogen-peuvent être produits par l'injection directe de Aß dans le cerveau, alors que les déficits cognitifs AD-like peuvent également être déclenchées par d'autres produits chimiques et physiques des moyens tels que l'injection de composés neurotoxiques tels que la scopolamine, l'induction des lésions dans les domaines liés cognition tels que l'hippocampe, ou par lésions corticales 4. Cependant, l'induction non pathogène de la déficience cognitive ne reflète pas fidèlement la physiopathologie fondamentale de la MA; à la place, il n'imite ses résultats symptomatiques. En revanche, un modèle de AD induite par un agent pathogène, l'A46; modèle de souris -injected, non seulement peut montrer des anomalies comportementales AD-like, mais peut également présenter une pathologie Aß, la caractéristique commune partagée par AD familiale et sporadique.
Malgré la difficulté à visualiser les plaques Aß dans le tissu cérébral, le plus grand avantage du modèle de Aß injecté qui le rend attrayant pour une enquête antidumping est sa contrôlabilité. Les chercheurs peuvent éliminer les différences individuelles dans les modèles de souris qui peuvent conduire à des données erronées dans les études liées à la drogue. le traitement médicamenteux est activé en temps voulu en fonction du mécanisme du médicament candidat; d'élaborer, un inhibiteur de l'agrégation Aß peut être appliqué avant l'injection de Aß. En outre, les enquêteurs peuvent supposer que la transformation pathogène qui se pose après l'injection Aß est dérivée de l'exposition Aß parce que les autres facteurs sont étroitement contrôlés, y compris les différences individuelles.
Dans ce protocole, une description vivante de how pour induire un phénotype de type AD chez des souris normales par Aß intracérébroventriculaire (ICV) injection sans instruments stéréotaxiques est présenté. Minimiser dégâts d'insertion provoqué aux tissus du cerveau est essentielle pour prévenir la possibilité de dommages structuraux et l'inflammation induite par lésion. Un manque de compétences dans la manipulation de la souris conduit à une lésion neuronale inattendue. En outre, les techniques qui permettent à l'angle et la profondeur appropriée à atteindre lors de l'injection sont particulièrement importants pour contourner les erreurs fréquentes. En plus, une explication vive détaillée de l'injection ICV, la fiabilité du modèle produit par le protocole suivant est également illustré dans les sections suivantes. Le protocole suivant pourrait être un outil fiable et facile à comprendre, qui contribue à la recherche de AD, fournissant ainsi un tremplin qui pourrait finalement conduire à une découverte significative pour la société AD.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (NIH Publications n ° 8023, révisée 1978) et avec le soin et l'utilisation Comité des animaux du soin et l'utilisation Commission institutionnelle animale de KIST (Séoul, Corée).
1. Préparation d'un animal
- Préparer un groupe de 7 semaines d'âge des souris ICR mâles (ou C57BL / 6).
- Que les souris passent par un processus d'acclimatation pendant 3-7 jours après le transport pour restaurer l'homéostasie. D'une manière générale, placer un groupe de 4-5 souris dans chaque cage et les maintenir à 22-23 ° C et 40% d'humidité, avec un cycle 12.12 h lumière / obscurité. Fournir de l' eau et de la nourriture ad libitum.
Remarque: Le processus d'acclimatation est essentiel pour permettre la récupération du stress de l'expédition et de l'adaptation à un nouveau logement, la nourriture, l'eau, et l'odeur ainsi qu'une nouvelle cage et un cycle de lumière. Dans cette expérience, les souris ont été logées dans des Cages individuellement ventilées (IVC) situés dans le Specifique Pathogen gratuit (SPF) installation de pentatonique - Peser chaque souris et exclure les sujets dont le poids écarte ± 10% par rapport à la moyenne.
- Diviser les sujets en deux groupes: un groupe de véhicules à injection (Aß (-)) et un groupe Aß-injecté (Aß (+)). Si l'expérience est de tester l'efficacité d'un médicament candidat particulier, diviser les souris en quatre groupes: (1) Aß (-) / médicament (-), (2) Aß (-) / médicament (+), (3) Aß (+) / médicament (-), et (4) Aß (+) / médicament (+).
2. Préparation de peptides Aß
- Traiter les peptides Aß dérivés par synthèse chimique 5 ou à partir de sources commerciales, avec pré-refroidie 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) pour dissoudre tous les agrégats et de rendre les peptides homogènes 6 .
- Soniquer la solution Aß / HFIP dans un sonicateur bain-marie pendant 5 min (à température ambiante), doucement vortex et incuber la solution pendant 30 min à température ambiante. Retirez le HFIP complètement par évaporation avec de l'azoteet stocker l'Aß homogène à -80 ° C jusqu'à utilisation.
- Préparer les monomères Aß: (. 100 uM Aß, 10% de DMSO, 90% PBS) faire 1 mM Aß diméthylsulfoxyde (DMSO) stock et diluer 10 fois dans un tampon phosphate salin (PBS)
- Préparer des oligomères de Aß.
- Incuber la solution de monomère d'Aß (contenant Aß (1-42) ou d'Aß (1-40)) (étape 2.2.) À 37 ° C pendant 3 ou 7 jours, respectivement.
- Placer la solution Aß dans un tube scellé dans un sac à fermeture à glissière contenant une serviette en papier humide pour fournir un environnement humidifié pour éviter l'évaporation de l'eau pendant la période d'incubation.
- Confirmer les oligomères préparés par Aß de sodium dodécyl sulfate électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) avec photoinduit reticulation des protéines non modifiées 6.
- Préparer la solution PBS de contrôle contenant 10% de DMSO pour l'injection ICV de véhicule.
3. Seringue Préparation
Remarque: La compression du Parafilm conduira à la profondeur de l'injection dépassant 3,6 mm ventral. Pour éviter que le Parafilm d'être comprimé lors de l'insertion de l'aiguille, envelopper densément l'aiguille plusieurs fois.
4. Aß injecté modèle murin Préparation
Remarque: nettoyer le champ opératoire avec un désinfectant pour maintenir des conditions stériles et stériliser les instruments chirurgicaux pour l'injection ICV en utilisant 70% d'éthanol et de l'exposition aux UV.
- Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale d'un mélange de xylazine (20 mg / kg) et tiletamine .HCl / zolazépam HCl (80 mg / kg) avant l'injection ICV. Placez la souris sur un tapis chaud pour maintenir sa température corporelle tout anesthésié et confirmer une anesthésie adéquate en évaluant la réponse pied-pincement.
- Appliquer des gouttes de PBS stérile pour les deux yeux pour prévenir le dessèchement de la cornée pendant la procédure (figure 1B).
- Préparer deux miroirs en tirant plusieurs lignes droites verticales sur leurs surfaces en cas de difficulty injection de la seringue perpendiculairement.
- Placer un miroir (M1), juste à côté du corps de la souris et l'autre (M2) en face de la tête. Maintenir M1 parallèle à la ligne médiane imaginaire entre les deux yeux de la souris et disposer M2 perpendiculaire à M1, de sorte que les deux plans forment un angle de 90 ° (figure 1C). Placez M1 sur le côté gauche de la souris si le chercheur est droitier. Placez M1 sur le côté droit de la souris si le chercheur est gaucher.
- Vaporiser éthanol à 70% sur le milieu du front de la souris et le frotter avec des cotons-tiges sèches. Ne pas mouiller trop grande d'une zone du front afin d'éviter la diminution de la température corporelle due à l'évaporation de l'alcool.
- Essuyez la même zone sur le front avec une solution de chlorhexidine à 2% en utilisant un nettoyage des cotons-tiges. Répéter les lavages avec de l'alcool et de la chlorhexidine pour un total de trois fois chacun.
Remarque: Si nécessaire, raser les poils sur le front de la souris afin de minimiser la possibilité de contamination - Localiser bregma.
- Avec le pouce et l'index, tenir fermement vers le bas la peau du front, directement au-dessus des deux yeux dans la mesure où les deux yeux font saillie. Faites glisser la peau du dos pour faire le front tendu et de minimiser les mouvements du crâne sous la peau.
- Former un triangle invisible en affectant trois sommets: les deux yeux de la souris et le point où le pouce et l'index se rencontrent, le bregma. (Figures 1B, flèche rouge: bregma)
- Localisez le point d'injection avec un ruban à mesurer: -1,0 ± 0,06 mm en arrière bregma, 1,8 ± 0,1 mm latéralement à la suture sagittale, et 2,4 mm de profondeur (figure 1D, étoiles bleues: points d'injection dans chaque hémisphère). (Pour les souris B6: -0.9 mm postérieur, 1,7 mm latérales, et 2,2 mm de profondeur)
- Remplir la seringue avec une solution d'Aß de 10 ul avec une solution ou d'un véhicule en excès, afin d'éviter l'injection d'air accidentelle.
- Placez la seringue à thle point e d'injection (décrit dans le protocole 4.7). Faire la seringue perpendiculairement au plan du point d'injection. Aligner images réfléchies de la seringue dans les deux miroirs avec les lignes tracées sur les miroirs d'un point de vue fixe (figure 1C).
- Commencez d'insérer l'aiguille jusqu'à ce que l'emballage de parafilm atteint la peau.
- Conserver la seringue de maintien de main ferme et utiliser d'autre part pour injecter 5 pi de la solution Aß ou d'un véhicule, lentement pendant 5 secondes sans interruption. Assurez-vous que la seringue reste perpendiculaire partout. Après avoir terminé l'injection, attendez 3 à 5 secondes avant de retirer la seringue pour la diffusion.
- En supposant que la position du triangle d'origine, exercer une pression modérée pour protéger le crâne de tous les mouvements inutiles. Retirez la seringue sans inclinaison.
- Placez la souris Aß-injecté sur le pavé chaud pour la récupération et de maintenir sa position sternale. Ne laissez pas la souris sans surveillance jusqu'à ce qu'elle reprenne conscience et ne pas retourner le mOuse à une cage contenant des souris non-chirurgicale jusqu'à ce qu'il ait complètement récupéré.
- Laver la seringue selon les étapes 3,3-3,6.
- surveiller la mobilité postopératoire des souris et vérifier tout signe d'infection ou de maladie chez les souris pendant 5-7 jours.
La figure 1. L' injection de Aß dans la région de ICV (A) de l' aiguille de la seringue Parafilm gainés par rapport à une aiguille de seringue non modifiée. (B) PBS tombe sur les yeux pour prévenir la sécheresse; le triangle formé sur le front de la souris avec le pouce, l'index, et les deux yeux de souris, ainsi que la ligne médiane imaginaire à égale distance de chaque oeil; (C) deux miroirs (M1 et M2) avec de multiples lignes verticales tracées sur les surfaces perpendiculaires à aider l' injection de l'aiguille de seringue; (D) le triangle avec les points d'injection, indicATED comme des étoiles bleues (-1,0 ± 0,06 mm de bregma et 1,8 ± 0,1 mm sagittale) sur chaque hémisphère de la souris; Flèche verte: parafilm, flèche rouge: bregma S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
5. Confirmation de Aß Injection par Y-labyrinthe et analyses du cerveau
- Évaluer la mémoire de travail de souris Aß-injectées par des tests Y-maze 3,7,8
- Attendre 3 jours après l'injection de l'apparition des déficits de la mémoire.
- Effectuer les tests Y-labyrinthe en utilisant un labyrinthe en plastique noir avec trois bras identiques étiquetés A, B et C, dont chacune des branches à un angle de 120 ° par rapport au centre du labyrinthe (largeur x longueur x hauteur, 10 cm x 40 cm x 12 cm).
- Placez une souris au niveau du bras de démarrage (bras A) et permettre au sujet d'explorer librement le labyrinthe pendant 8 min.
- Mesurer le nombre d'entrées dans chaque bras et calculer le alterntaux de ation de chaque sujet 3,9.
- examiner directement le cerveau post-mortem pour vérifier si l'injection ciblé la région ICV appropriée.
- Anesthetize la souris par la même procédure que celle décrite dans la section 4.1. Puis sacrifier la souris par dislocation cervicale.
- Décapitez la souris et enlever la peau pour exposer le crâne à l'aide des ciseaux chirurgicaux. Retirer les tissus et les muscles du crâne.
- Faire des coupes sur la suture lambdoïde (entre le pariétal et interpariétales) sans endommager le cerveau. Retirer l'occipital et les os interpariétales, le pariétal et os frontaux. Retirer l'os du crâne en utilisant une pince et d'isoler le cerveau du crâne en soulevant les méninges.
- Laver le cerveau dans une solution saline stérile refroidi et coupé la région du cerveau ICV dans la direction coronale avec un couteau chirurgical (figure 2).
- Confirmer la région d'injection par rapport à la trace de l'insertion de l'aiguille sur letissu cérébral (Figure 2). Vérifiez si la trace de l'aiguille a atteint l'un des ventricules. Si la trace de l'aiguille ne répond pas ou passer à travers les ventricules, exclure les données de ce sujet de l'analyse des résultats expérimentaux.
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Representative Results
Cette section illustre des exemples de résultats qui peuvent être obtenus par une confirmation de l'agrégation Aß et l'évaluation labyrinthe en Y des déficits de la mémoire. En utilisant la pleine longueur Aß (1-42) peptide de 42 acides aminés, le mélange de monomères, oligomères Aß et de fibrilles (figure 3) a été produite. Par l'étape de monomérisation induite HFIP, les monomères relativement homogènes (voie B) ont été obtenus. Après l'incubation de 7 jours, différentes tailles d'agrégats de Aß (voie C), mis au point. Trimères et tétramères étaient les espèces dominantes parmi les formes oligomériques de Aß. La mémoire de travail spatiale a été évaluée chez les souris par injection de Aß alternances dans le test de labyrinthe en Y. La séquence de choix de bras et le nombre d'entrées dans les branches au total ont été enregistrées alors que chaque souris a été autorisé à explorer librement le labyrinthe. Plus intacte la capacité cognitive, plus la souris devrait avoir tendance à entrer dans le bras inférieur a récemment visité, alternating son choix de bras. Le groupe de souris injectées Aß a montré des taux d'alternance significativement plus faibles, ce qui indique le développement de déficits cognitifs (figure 4).
Figure 2 : Exemples d'injections ICV (A) Illustration de coupes cérébrales coronales dans la direction représentant l'emplacement du bregma 10 et la plage acceptable d'injection (-1,0 ± 0,06 mm à partir du bregma et à 1,8 ± 0,1 mm sagittal). (B - C) un cas d'injection de ICV réussie (B: vue de dessus de l'ensemble du cerveau, C: coupe coronale montrant ventricules latéraux remplis de colorant bleu); (D - E) un cas d'injection ICV échoué (D: vue de dessus de l'ensemble du cerveau, E: coupe coronale montrant les troisième et quatrième ventricles remplis de colorant bleu) Cercle bleu et flèche: injecté site, Blue star:. point d'injection potentiel S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Confirmation de la ß a préparé une espèce par SDS-PAGE. Peptides Aß ont été séparés par SDS-PAGE avec une photo-induit la réticulation de protéines non modifiées. Peptide bandes ont été visualisées par coloration à l'argent; voie (A) marqueur protéique, la voie (B) Aß monomère (avant l'incubation), et la piste (C) des espèces Aß incubés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Y-maze tests comportementaux. Pourcentage alternance du Aβ- ou des groupes de souris véhicule-injecté sur le test Y-labyrinthe. Blanc graphique solide: véhicule (Aß (-), n = 10). graphique rayé: Aß-injecté (Aß (+), n = 9). Les analyses statistiques ont été réalisées avec une ANOVA suivie par les comparaisons post-hoc de Bonferroni (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001). Les barres d'erreur représentent les MEB. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
L'étape la plus importante dans ce protocole est l'injection ICV de Aß. Ce protocole est conçu pour injecter Aß dans la région ICV de souris sans instruments stéréotaxiques 11,12. Avant de commencer une expérience, une période préliminaire d'injections de pratique avec un colorant bleu au lieu de Aß devrait avoir lieu pour obtenir une dextérité suffisante. Immédiatement après l'injection, il est nécessaire de vérifier si l'injection de pigment a été effectuée correctement. Sortez soigneusement le cerveau et vérifier si la région appropriée a été teint en bleu. La ligne pigmentée devrait atteindre, mais ne dépasse pas, la profondeur de la région ICV. Un minimum d'un taux de réussite de 90%, ce qui est généralement atteint au bout de 50 ou plusieurs injections ICV, est suggérée. Lors de l'injection de ICV, éviter d'endommager les vaisseaux sanguins en injectant le sinus sagittal (à proximité du point zéro bregma).
Après l'injection de Aß, statistiquement significative altération de la mémoire a été observéd entre le groupe Aß injecté et le groupe témoin en utilisant Y-maze tests comportementaux. Différents types d'expériences comportementales peuvent être appliquées pour tester le degré de déficience cognitive, comme l'eau Morris labyrinthe 13, reconnaissance d' objets, et les tests d'évitement passif ainsi que conditionnement de la peur. Le labyrinthe d'eau de Morris est utilisé pour examiner hippocampiques déficits de mémoire spatiale, alors que conditionnement de la peur est utilisée pour tester l'apprentissage associatif hippocampique dépendant et de la communication de l'amygdale-hippocampique. Reconnaissance d'objets d'un objet particulier est adapté à la mesure de la déficience cognitive liée AD, et l' évitement passif peut être utilisé pour tester la capacité d'un animal de se rappeler le 3 stimulus aversif. Il est important de préparer les souris d'un poids et d'âge similaires si elles seront soumises à des tests de comportement en utilisant des décharges électriques, comme la peur conditionné et tests d'évitement passif. Il est recommandé que les essais mentionnés ci-dessus doivent être exécutéesdans les 10 jours suivant l'apparition des déficits de la mémoire. Comme il est confirmé que Aß se trouve dans l'injection hippocampe post-ICV 14, d' autres investigations sont nécessaires pour trouver des tests comportementaux impliquant d' autres régions du cerveau avec une affinité de ICV-injecté Aß.
La préparation des peptides Aß et le moment de l'injection de ICV doivent être soigneusement conçus en fonction du but expérimental, et doivent prendre en considération: (1) les espèces de Aß (monomères, oligomères, fibrilles, ou un mélange); (2) l'isoforme de Aß (Aß40, Aß42, tronqué Aβ25-35 et autres) 15-18; (3) les points de temps d'injection Aß; et (4) le temps de latence après l'exposition Aß. Par exemple, l'injection de monomères Aß est recommandé si les souris sont soumises à l'administration de médicaments qui inhibent les activités anormales de monomères d'Aß, tels que l'agrégation. L'injection d'oligomères Aß solubles est suggested si l'étude vise à évaluer la neurotoxicité ou l'inflammation induite par des oligomères. L'injection d'espèces Aß hautement agrégées est recommandée si l'enquête vise à étudier insoluble Aß et la pathologie associée 7,19. Si un essai a pour but de tester l'activité des inhibiteurs de l'agrégation Aß, le composé doit généralement être appliqué avant ou en même temps, le Aß, alors que les agents de nettoyage de Aß ou des composés anti-inflammatoires doivent être administrés après l'injection Aß.
Par rapport aux modèles transgéniques ou chroniques de AD, le modèle de la souris Aß-injecté permet aux chercheurs de contrôler la concentration de Aß, l'apparition de phénotypes AD-like, et le développement simultané d'un grand nombre de souris atteintes de démence. Ces avantages offrent la liberté par rapport à la conception expérimentale et un large éventail de possibilités pour les chercheurs. Compte tenu de la pathogenèse de la MA se rapporte plus étroitement à une exposition chronique plutôt que d'une hausse soudaine de A &# 946; la concentration dans le cerveau, des expériences supplémentaires utilisant des modèles transgéniques est recommandé de renforcer les conclusions tirées de l'utilisation de modèles de souris injectées par Aß. En outre, étant donné que la protéine tau est une autre cause majeure de la MA, le développement de la protéine tau et des modèles de souris d'injection Aß peut encore progresser la société de recherche de AD.
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Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par une subvention de la Korea Health Technology R & D Project par l'Institut coréen de l'industrie de la santé pour le développement (KHIDI), financé par le ministère de la Santé et Bien-être, République de Corée (numéro de subvention: H14C04660000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICR mouse | Orientbio | male, 6-8 weeks, 27-29 g of body weight | |
| C57BL/6 mouse | Orientbio | male, 6-8 weeks, 21-23 g of body weight | |
| Amyloid-beta1-42 | in house synthesis | stock concentration: 1 mM/DMSO, injected concentration: 100 μM/10% DMSO and 90% PBS | |
| ICV injection syringe (26s gauge) | Hamilton | 80308 | |
| Evans blue dye (EBD) | abcamBIochemicals | ab120869 | 1% EBD in PBS |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| PBS | gibco | 10010-023 | |
| Gradi-GelTM II Gradient PAGE Analysis Kit | ELPiS Biotech | EBS-1056 | 15% Gel |
| Precision Plus ProteinTM Dual Xtra Standards | Bio-Rad | 161-0377 | |
| Silver-Staining Kit | GE-Healthcare | 17-1150-01 | |
| LabDiet | Orientbio | 5053 |
References
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