Summary
El amiloide-β (Aß): se inyecta modelo animal permite la administración de una cantidad y especies de fragmentos Aß definido y reduce las diferencias individuales dentro de cada grupo de estudio. Este protocolo describe la inyección intracerebroventricular (ICV) de Aß sin instrumentos de estereotaxia, permitiendo la producción de anomalías en el comportamiento de Alzheimer como en ratones normales.
Introduction
Dado que el amiloide-β (Aß) es una característica patológica de la enfermedad de Alzheimer (EA), el desarrollo de modelos animales de AD se ha centrado en la sobreexpresión neuronal de Aß. Debido a que las mutaciones en la proteína precursora amiloide (APP) o la presenilina (PS) conducen a la perturbación del equilibrio Aß y en última instancia a la patogénesis de la EA familiar 1, los modelos de ratón que implican APP o PS mutaciones genéticas han sido generalmente aceptada. Entre la amplia gama de ratones transgénicos, los modelos prototípicos de ratón incluyen los siguientes: Tg2576, PDAPP, APP / PS1 y APP23. En el cerebro, estos ratones exhiben generalmente la agregación de Aß y placas seniles con el tiempo; la formación de placa es seguida por deterioro cognitivo significativo de tal manera que muestran bajo rendimiento en las pruebas de comportamiento de aprendizaje y memoria. La generación de la utilización de ratones transgénicos que, naturalmente, imitar AD patología humana ha contribuido tanto a la sociedad de investigación dC por lo que nos permite controlar la progresión de la diSease. Sin embargo, el uso de ratones transgénicos no es económico y requiere mucho tiempo, ya que toma meses para los ratones para desarrollar placas de Aß y aún más para mostrar sináptica Aß inducida o anormalidades de comportamiento 2,3. Originalmente desarrollado como una alternativa para superar las deficiencias de los modelos de ratones transgénicos, los modelos no transgénicos también se utilizan comúnmente debido a sus ventajas. modelos AD inducida por patógenos pueden ser producidos por la inyección directa de Aß en el cerebro, mientras que los déficits cognitivos-AD similares también pueden ser provocados por otros químicos y físicos medios, tales como la inyección de compuestos neurotóxicos, como la escopolamina, la inducción de lesiones en áreas relacionadas con la cognición, como el hipocampo, o por el daño cortical 4. Sin embargo, la inducción no patógena de deterioro cognitivo no refleja con precisión la fisiopatología de la EA fundamental; en su lugar, que sólo imita sus resultados sintomáticos. Por el contrario, un modelo de AD inducida por patógenos, la A46; modelo de ratón inyectados, no sólo puede mostrar anomalías de comportamiento similar a AD, pero también puede exhibir patología Aß, la característica común compartida por EA familiar y esporádica.
A pesar de la dificultad para visualizar las placas de Aß en el tejido cerebral, el mayor beneficio del modelo de Aß-inyectado que lo hace atractivo para la investigación AD es su capacidad de control. Los investigadores pueden eliminar a las diferencias individuales en los modelos de ratón que pueden conducir a datos erróneos en los estudios relacionados con las drogas. tratamiento de drogas oportuna es activado dependiendo del mecanismo del fármaco candidato; para elaborar, un inhibidor de la agregación de Aß se puede aplicar antes de la inyección de Aß. Además, los investigadores pueden asumir que la transformación patógena que surge después de la inyección de Aß se deriva de la exposición Aß porque los otros factores están estrechamente controlados, incluyendo las diferencias individuales.
En este protocolo, una vívida descripción de how para inducir un fenotipo similar a AD en ratones normales a través de la inyección de Aß intracerebroventricular (ICV) sin instrumentos estereotáxica se presenta. Reducir al mínimo el daño provocado inserción en el tejido cerebral es esencial para evitar la posibilidad de daños estructurales y la inflamación inducida por la lesión. A falta de habilidad en el manejo del ratón conduce a la lesión neuronal inesperado. Además, las técnicas que permiten que el ángulo y la profundidad apropiada para ser alcanzado durante la inyección son especialmente importantes para eludir errores frecuentes. Además de una explicación detallada, vivo de la inyección ICV, la fiabilidad del modelo producido por el siguiente protocolo también se ilustra en las siguientes secciones. El siguiente protocolo podría ser una herramienta fiable y de fácil comprensión que contribuye a la investigación AD, proporcionando así un peldaño que en última instancia podría conducir a un descubrimiento significativo para la sociedad AD.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NIH Publications No. 8023, revisada 1978) y con el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de KIST (Seúl, Corea).
1. Preparación de los animales
- Preparar un grupo de ratones ICR macho de 7 semanas de edad (o C57BL / 6).
- Deje que los ratones se someten a un proceso de aclimatación durante 3-7 días después del transporte para restaurar la homeostasis. En general, colocar un grupo de 4-5 ratones en cada jaula y mantenerlas a 22-23 ° C y 40% de humedad, con un ciclo de 12/12 horas de luz / oscuridad. Proporcionar agua y alimento ad libitum.
Nota: El proceso de aclimatación es fundamental para permitir la recuperación de la tensión de la navegación y la adaptación a las nuevas viviendas, alimentos, agua, y el olor, así como una nueva jaula y el ciclo de luz. En este experimento, los animales fueron alojados en jaulas ventiladas individualmente (IVC), ubicado en la Speespe- instalaciones libres de patógenos -Grado (SPF) - Pesar cada ratón y excluir a los sujetos cuyo peso se desvía ± 10% de la media.
- Divida a los sujetos en dos grupos: un grupo de vehículo de inyección (Aß (-)) y un grupo inyectado-beta (beta (+)). Si el experimento es poner a prueba la eficacia de un fármaco candidato en particular, dividir los ratones en cuatro grupos: (1) beta (-) / fármaco (-), (2) beta (-) / fármaco (+), (3) Aß (+) / drogas (-) y (4) Aß (+) / drogas (+).
2. Preparación de péptidos Aß
- Tratar los péptidos Aß, derivados por síntesis química 5 o de fuentes comerciales, con pre-refrigerada 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) para disolver cualquier agregado y para hacer que los péptidos homogéneos 6 .
- Sonicar la solución Aß / HFIP en un sonicador de baño de María durante 5 min (a temperatura ambiente), suavemente vórtice, e incubar la solución durante 30 min a TA. Retire el HFIP por completo a través de la evaporación con nitrógenoy almacenar el homogénea Aß a -80 ° C hasta su uso.
- Preparar los monómeros Aß: (. 100 M Aß, DMSO al 10%, 90% PBS) que Aß 1 mM dimetilsulfóxido (DMSO) stock y se diluye 10 veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS)
- Preparar oligómeros de Aß.
- Incubar la solución de monómero beta (que contiene beta (1-42) o beta (1-40)) (etapa 2.2.) A 37 ° C durante 3 ó 7 días, respectivamente.
- Coloque la solución Aß en un tubo sellado en una bolsa con cremallera que contiene una toalla de papel húmeda para proporcionar un ambiente humidificado para impedir la evaporación de agua durante el período de incubación.
- Confirmar oligómeros Aß preparados a través de electroforesis en dodecilsulfato de sodio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) con el foto-inducida por el entrecruzamiento de las proteínas no modificadas 6.
- Preparar la solución de PBS de control que contiene 10% de DMSO para la inyección ICV vehículo.
3. Preparación de la jeringuilla
Nota: La compresión de la Parafilm dará lugar a la profundidad de la inyección superior a 3,6 mm ventral. Para evitar que el Parafilm se comprima durante la inserción de la aguja, la aguja densamente envolver varias veces.
4. Aß-inyectada modelo de ratón Preparación
Nota: Limpiar el campo de operación con un desinfectante para mantener las condiciones estériles y esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos para la inyección ICV utilizando 70% de etanol y la exposición UV.
- Anestesiar al ratón por inyección intraperitoneal de una mezcla de xilazina (20 mg / kg) y tiletamina · HCl / zolazepam · HCl (80 mg / kg) antes de la inyección ICV. Coloca el ratón sobre una estera cálido para mantener su temperatura corporal mientras anestesiado y confirme una anestesia adecuada mediante la evaluación de la respuesta pies pellizco.
- Aplicar PBS estéril se reduce a ambos ojos para evitar la sequedad de la córnea durante el procedimiento (Figura 1B).
- Preparar dos espejos dibujando varias líneas rectas verticales en sus superficies en caso de difficuLTY la inyección de la jeringa perpendicularmente.
- Coloque un espejo (M1) justo al lado del cuerpo del ratón y el otro (M2) delante de la cabeza. Mantenga M1 paralelamente a la línea imaginaria entre los dos ojos del ratón y organizar M2 perpendicular a M1, de modo que los dos planos forman un ángulo de 90 ° (Figura 1C). Coloque M1 en el lado izquierdo del ratón, si el investigador es diestro. Coloque M1 en el lado derecho del ratón, si el investigador es zurdo.
- Pulverizar 70% de etanol en el medio de la frente del ratón y lo frota con hisopos de algodón seco. No moje demasiado grande de un área de la frente para evitar la disminución de la temperatura corporal debido a la evaporación del alcohol.
- Limpie la misma zona en la frente con una solución de clorhexidina al 2% utilizando un trozo de algodón limpio. Repita los fregados con el alcohol y clorhexidina para un total de tres veces cada uno.
Nota: Si es necesario, afeitar el pelo en la frente del ratón con el fin de reducir al mínimo la posibilidad de contaminación - Localiza bregma.
- Usando el dedo pulgar y el dedo índice, sujeta fuertemente por la piel de la frente, justo encima de los dos ojos en la medida en que sobresalen los dos ojos. Arrastre la piel de la espalda para hacer la frente tensa y reducir al mínimo los movimientos del cráneo debajo de la piel.
- Formar un triángulo invisible mediante la asignación de tres vértices: los dos ojos del ratón y el punto en el pulgar y el dedo índice se encuentran, al bregma. (Figuras 1B, la flecha roja: bregma)
- Localizar el punto de la inyección con la cinta de medición: -1,0 ± 0,06 mm posterior al bregma, 1,8 ± 0,1 mm lateral a la sutura sagital, y 2,4 mm de profundidad (Figura 1D, estrellas azules: puntos de inyección en cada hemisferio). (Para ratones B6: -0,9 mm posterior, 1,7 mm lateral y 2,2 mm de profundidad)
- Llene la jeringa con 10 l solución Aß o vehículo con el exceso de solución con el fin de evitar la inyección de aire accidental.
- Coloque la jeringa en el thletra e inyección (que se describe en el protocolo 4.7). Hacer la jeringa perpendicular al plano del punto de inyección. Align refleja imágenes de la jeringa en ambos espejos con las líneas dibujadas en los espejos desde un punto de vista fijo (Figura 1C).
- Comenzar a insertar la aguja hasta que la envoltura de parafina llega a la piel.
- Mantener la jeringa de la mano firme y utilizar la otra mano para inyectar 5 l de la solución de Aß o vehículo, lentamente durante 5 segundos sin detenerse. Asegúrese de que la jeringa se mantiene perpendicular a lo largo. Después de completar la inyección, espere de 3 a 5 segundos antes de retirar la jeringa para la difusión.
- Suponiendo que la posición de triángulo original, ejerciendo una presión moderada para proteger el cráneo de todos los movimientos innecesarios. Retire la jeringa sin inclinar.
- Coloque el ratón inyectado-Aß en la pista de calentamiento para la recuperación y mantener su posición de decúbito esternal. No deje desatendido el ratón hasta que recupera la conciencia y no devolver el mOuse a una jaula que contiene los ratones no quirúrgico hasta que se haya recuperado por completo.
- Lavar la jeringa de acuerdo a los pasos 3.3-3.6.
- Después de la operación seguimiento de la movilidad de los ratones y comprobar si hay cualquier signo de infección o enfermedad en los ratones durante 5-7 días.
Figura 1. Inyección Aß en la región de ICV (A) de aguja de jeringuilla envuelto-Parafilm en comparación con una aguja de la jeringa sin modificar.; (B) PBS cae sobre los ojos para evitar la sequedad; el triángulo formado en la frente de ratón con el pulgar, el dedo índice, y los dos ojos del ratón, así como la línea media imaginaria equidistante de cada ojo; (C) dos espejos (M1 y M2) con múltiples líneas verticales dibujadas en las superficies para ayudar perpendicular inyección de la aguja de la jeringa; (D) el triángulo con los puntos de inyección, indicado como estrellas azules (-1,0 ± 0,06 mm del bregma y 1,8 ± 0,1 mm sagital) en cada hemisferio del ratón; Flecha verde: parafina, flecha roja: bregma Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
5. Confirmación de Aß Injection por el laberinto Y y análisis del cerebro
- Evaluar la memoria de trabajo de los ratones inyectados con Aß por las pruebas del laberinto en 3,7,8
- Espere 3 días después de la inyección de la aparición de déficits de memoria.
- Realizar las pruebas del laberinto en que utilizan un laberinto de plástico negro con tres brazos idénticos denominados A, B, y C, cada una de las cuales se ramifica en un ángulo desde el centro del laberinto 120 ° (ancho x largo x 10 cm x 40 cm x 12 cm).
- Coloque un ratón en el brazo de partida (grupo A) y permitir que el objeto de explorar libremente el laberinto durante 8 minutos.
- Medir el número de entradas en cada brazo y calcular la alterntasa de inflación de cada sujeto 3,9.
- Directamente examinar los cerebros postmortem para comprobar si la inyección dirigida la región ICV adecuadamente.
- Anestesiar el ratón por el mismo procedimiento que se describe en la sección 4.1. A continuación, sacrificar el ratón por dislocación cervical.
- Decapitar al ratón y quitar la piel para exponer el cráneo utilizando tijeras quirúrgicas. Retire los tejidos y los músculos del cráneo.
- Hacer cortes en esta sutura (entre los huesos parietal y interparietales) sin dañar el cerebro. Retire el interparietales huesos occipital y, a continuación, los huesos parietal y frontal. Quitar el hueso del cráneo con unas pinzas y aislar el cerebro del cráneo levantando las meninges.
- Lavar el cerebro en solución salina estéril enfriada y cortar la región ICV del cerebro en la dirección coronal con un cuchillo quirúrgico (Figura 2).
- Confirmar la región de inyección basado en la traza de la inserción de la aguja en eltejido cerebral (Figura 2). Compruebe si la traza de la aguja ha alcanzado uno de los ventrículos. Si la traza de la aguja no cumple o pasan a través de los ventrículos, excluir los datos de sujetos que a partir del análisis de los resultados experimentales.
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Representative Results
Esta sección ilustra ejemplos de los resultados que se pueden obtener por la confirmación de la agregación de Aß y evaluación Y-laberinto de los déficits de memoria. Uso de la longitud completa de Aß se produjo (1-42) péptido de 42 aminoácidos, mezcla de monómeros Aß, oligómeros y fibrillas (Figura 3). A través de la etapa de monomerización HFIP inducida, se obtuvieron monómeros relativamente homogéneos (carril B). Después de la incubación de 7 días, diversos tamaños de agregados Aß (carril C) desarrollaron. Trímeros y tetrámeros fueron las especies dominantes entre las formas oligoméricas de Aß. memoria de trabajo espacial se evaluó en los ratones inyectados con Aß a través de alteraciones en la prueba del laberinto en. La secuencia de opciones de brazo y el número de entradas totales de brazo mientras que se registraron cada ratón se le permitió explorar libremente el laberinto. El más intacta la capacidad cognitiva, más el ratón debe tener una tendencia a entrar en el brazo menos visitado recientemente, alternating su elección brazo. El grupo de ratones con inyección de Aß mostró tasas de alternancia significativamente más bajos, lo que indica el desarrollo de déficits cognitivos (Figura 4).
Figura 2. Ejemplos de inyecciones ICV (A) Ilustración de las secciones del cerebro en dirección coronal que representan la ubicación de bregma 10 y el rango aceptable de inyección (-1,0 ± 0,06 mm del bregma y 1,8 ± 0,1 mm sagital). (B - C) un caso de inyección ICV éxito (B: vista superior de todo el cerebro, C: corte coronal muestra los ventrículos laterales llenas de colorante azul); (D - E) un caso de la inyección ICV éxito (D: vista desde arriba de todo el cerebro, E: sección coronal que muestra la tercera y cuarta cincontricles llenas de colorante azul) azul del círculo y la flecha: se inyecta sitio, estrella azul:. potencial punto de inyección Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Confirmación de preparado una especie beta a través de SDS-PAGE. Péptidos Aß fueron separadas por SDS-PAGE con foto-inducida por el entrecruzamiento de las proteínas sin modificar. bandas de péptidos se visualizaron por tinción con plata; carril (A) marcador de proteína, carril (B) monómero Aß (antes de la incubación), y el carril (C) las especies de Aß incubados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. laberinto Y las pruebas de comportamiento. Porcentaje de alternancia de la Aβ- o grupos de ratones inyectados con vehículo en la prueba del laberinto en. Blanco gráfico sólido: vehículo (Aß (-), n = 10). gráfico de rayas: Aß inyectado (Aß (+), n = 9). Los análisis estadísticos se realizaron con ANOVA de un factor seguido de comparaciones post-hoc de Bonferroni (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001). Las barras de error representan el SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El paso más importante en este protocolo es la inyección ICV de Aß. Este protocolo está diseñado para inyectar Aß en la región de ICV de los ratones sin instrumentos estereotácticas 11,12. Antes de iniciar un experimento, un período preliminar de las inyecciones de práctica con un tinte azul en lugar de Aß debe llevarse a cabo para alcanzar la suficiente destreza. Inmediatamente después de la inyección, es necesario comprobar si la inyección de pigmento se lleva a cabo correctamente. Retire cuidadosamente el cerebro y comprobar si la región apropiada fue teñido de azul. La línea pigmentada debe llegar a, pero no exceder, la profundidad de la región ICV. Un mínimo de una tasa de éxito del 90%, que se logra generalmente después de 50 o más inyecciones de ICV, se sugiere. Durante la inyección ICV, evitar dañar los vasos sanguíneos mediante la inyección del seno sagital (cerca del punto cero bregma).
Después de la inyección de Aß, deterioro de la memoria estadísticamente significativa fue observard entre el grupo inyectado-Aß y el grupo de control utilizando laberinto Y las pruebas de comportamiento. Los diferentes tipos de experimentos de comportamiento pueden aplicarse para probar el grado de deterioro cognitivo, tal como el agua de Morris laberinto 13, reconocimiento de objetos, y las pruebas de evitación pasiva, así como el condicionamiento del miedo. El laberinto de agua de Morris se utiliza para examinar los déficit de memoria espacial del hipocampo, mientras que el condicionamiento del miedo se utiliza para probar el aprendizaje asociativo dependiente del hipocampo y la amígdala-hipocampo comunicación. Reconocimiento de objetos de un objeto en particular es adecuado para la medición del deterioro cognitivo relacionado con la AD, y de evitación pasiva se puede utilizar para probar la capacidad de un animal para recordar el estímulo aversivo 3. Es importante preparar a los ratones de un peso y edad similar si van a ser sometidos a pruebas de comportamiento que utilizan descargas eléctricas, tales como el condicionamiento del miedo y las pruebas de evitación pasiva. Se recomienda que las pruebas antes mencionadas se han de realizardentro de los 10 días del inicio de los déficits de memoria. Dado que se confirma que Aß se encuentra en el hipocampo de inyección post-ICV 14, nuevas investigaciones están garantizados para encontrar pruebas de comportamiento que implican otras regiones del cerebro con afinidad de Aß inyectado-ICV.
La preparación de los péptidos Aß y el momento de la inyección ICV deben ser cuidadosamente diseñadas en función de la finalidad experimental, y debe incluir la consideración de: (1) las especies de Aß (monómeros, oligómeros, fibrillas, o una mezcla); (2) la isoforma de Aß (Aß40, Aß42, truncado Aβ25-35, y otros) 15-18; (3) los puntos de tiempo de inyección de Aß; y (4) el lapso de tiempo después de la exposición Aß. Por ejemplo, se recomienda la inyección de monómeros Aß si los ratones se sometieron a la administración de fármacos que inhiben las actividades anormales de monómeros Aß, tales como la agregación. La inyección de oligómeros Aß solubles es suggested si el estudio tiene como objetivo evaluar la neurotoxicidad inducida por la inflamación o oligómeros. Se recomienda la inyección de especies altamente agregados Aß si la investigación tiene como objetivo estudiar insolubles Aß y la patología relacionada 7,19. Si un experimento tiene como objetivo poner a prueba la potencia de los inhibidores de agregación de Aß, el compuesto en general se debe aplicar antes de, o junto con, el Aß, mientras que los agentes de limpieza y eliminación de Aß o compuestos anti-inflamatorios se debe administrar después de la inyección de Aß.
En comparación con transgénica o modelos crónicos de AD, el modelo de ratón Aß de inyección permite a los investigadores para controlar la concentración de Aß, la aparición de fenotipos-AD similares, y el desarrollo simultáneo de un gran número de ratones con demencia. Estos beneficios proporcionan la libertad con respecto al diseño experimental y una amplia gama de oportunidades para los investigadores. Teniendo en cuenta la patogénesis de la EA más estrechamente relacionada con la exposición crónica en lugar de un aumento repentino de A &# 946; concentración en el cerebro, se recomienda experimentos adicionales usando modelos transgénicos para fortalecer las conclusiones derivadas de la utilización de modelos de ratones inyectados con Aß. Además, puesto que la proteína tau es otra causa importante de la EA, el desarrollo de modelos de ratones de inyección de Aß tau y puede avanzar aún más la sociedad de investigación AD.
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Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por una beca de la Tecnología de Corea I + D Proyecto de Salud a través del Instituto Coreano de Desarrollo Industria de la Salud (KHIDI), financiado por el Ministerio de Salud y Bienestar Social, República de Corea (número de concesión: H14C04660000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICR mouse | Orientbio | male, 6-8 weeks, 27-29 g of body weight | |
| C57BL/6 mouse | Orientbio | male, 6-8 weeks, 21-23 g of body weight | |
| Amyloid-beta1-42 | in house synthesis | stock concentration: 1 mM/DMSO, injected concentration: 100 μM/10% DMSO and 90% PBS | |
| ICV injection syringe (26s gauge) | Hamilton | 80308 | |
| Evans blue dye (EBD) | abcamBIochemicals | ab120869 | 1% EBD in PBS |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| PBS | gibco | 10010-023 | |
| Gradi-GelTM II Gradient PAGE Analysis Kit | ELPiS Biotech | EBS-1056 | 15% Gel |
| Precision Plus ProteinTM Dual Xtra Standards | Bio-Rad | 161-0377 | |
| Silver-Staining Kit | GE-Healthcare | 17-1150-01 | |
| LabDiet | Orientbio | 5053 |
References
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