Introduction
condicionamiento del parpadeo es una forma de condicionamiento pavloviano y un sistema modelo para investigar los mecanismos neurales de aprendizaje asociativo y la memoria. Se ha investigado en diversas especies, incluyendo seres humanos, conejos, gatos, ratas y ratones. El paradigma implica la presentación de dos estímulos pareados: un estímulo neutro condicionado (CS; por ejemplo, un tono, un destello de luz, o la estimulación de la barba), y un estímulo no condicionado saliente (Estados Unidos, por ejemplo, un soplo de aire en el ojo, o choque periorbital). Los EE.UU. provoca una respuesta de parpadeo reflejo condicionado (es decir, UR). Finalmente, después de varias presentaciones del emparejado CS-Estados Unidos, el sujeto aprende a asociar el CS con los EE.UU.. Este aprendizaje se manifiesta en forma de una respuesta condicionada (CR), un parpadeo provocado por el CS solo que precede a la presentación de los EE.UU..
condicionamiento del parpadeo en la forma de seguimiento incluye un intervalo libre de estímulo de unos pocos hmilisegundos undred que separa el CS y los EE.UU. (Figura 1). Condicionamiento de huella es una forma de aprendizaje declarativo, ya que requiere el conocimiento de las contingencias de estímulo 1. La brecha temporal requiere que el animal para mantener una neuronal "traza" de la CS en las regiones del cerebro anterior, tales como el hipocampo a fin de que los EE.UU. y el CS en quedar al 1-6. Junto con las regiones del cerebro anterior, vestigios acondicionado también depende del cerebelo 7.
acondicionado Eyeblink es, por lo tanto, un paradigma útil para la investigación de las múltiples facetas de la memoria, incluyendo la adquisición, consolidación y recuperación. Durante condicionamiento del parpadeo, un grupo de control de animales se presenta con estímulos no apareados en orden aleatorio para probar pseudoconditioning o sensibilizados respuestas a la CS que pueden ser causados por la presentación Estados Unidos solamente en lugar de una asociación EC-EI aprendido.
A appara comúnmente utilizadoTus para la investigación de condicionamiento del parpadeo en los roedores es una cámara en la que se permite que los roedores de moverse libremente durante el proceso de formación de 8-10. Con este tipo de aparato, un dispositivo de amarre está normalmente unida a una pieza de cabeza que se fija al cráneo del roedor. La correa de sujeción permite la entrega de los EE.UU. (y a veces el CS) y para transmitir la respuesta del animal a esos estímulos (es decir, la respuesta de parpadeo) 10. La correa de sujeción en sí mismo puede ser modificado en función del tipo de estímulos entregados y cómo se registra la respuesta de parpadeo.
La razón para el uso "de libre movimiento" ratones atados de condicionamiento del parpadeo es que los ratones que luchan contra la restricción. Aunque otras especies pueden ser más susceptibles a la restricción, la principal ventaja del uso de ratones en experimentos de condicionamiento del parpadeo es que la mayoría de los disponibles cepas mutantes genéticamente modificados son cepas de ratón. Además de que luchan, res completosTraint de los ratones se traduce en angustia aguda. Una preparación de ratón de cabeza fija, que minimice el estrés incrementaría la información fisiológica que se puede obtener durante el condicionamiento del parpadeo. Por ejemplo, este sistema permitiría formación de imágenes de las neuronas corticales con 2 fotones microscopía 11.
Preparaciones Head-fija se han utilizado en los experimentos anteriores para formación de imágenes ópticas de la corteza a través de implantes craneales extraíbles, in vivo grabaciones electrofisiológicas del cerebro de roedores con arrays tetrodo, imágenes de calcio de dos fotones en, y también como una plataforma para el condicionamiento del parpadeo en ratones 11 -16.
En el sistema de frente fijo, estimulación y grabaciones fiables se garantizan sin restricción completa del ratón (Figura 2). Un casco como el usado en el sistema de movimiento libre se fija al cráneo del ratón. Durante el entrenamiento, la pieza de cabeza está fijada a un conector que se une a más de baresuna cinta de correr cilíndrica con el fin de estabilizar la cabeza del roedor (Figura 2A). La cinta cilíndrica permite que el ratón para descansar cómodamente, pero si el ratón así lo desea, también permite que se ejecute o caminar. Con el uso de este sistema, los ratones pueden ser entrenados con una vibración bigote como el CS y una descarga eléctrica leve periorbital como los EE.UU. (Figura 1). Los EE.UU. se entrega a través alambres colocados quirúrgicamente debajo de la piel lateral a la vista. El CS se entrega a través de un peine que está unido a un accionador de flexión rectangular de 2 capas (Figura 2B). El peine y el accionador de flexión se unen entonces a una base magnética que se mueve a la posición correcta durante el entrenamiento y se ajusta para la entrega óptima para cada animal individual. El peine se coloca a horcajadas los bigotes seleccionados. Durante la entrega de la CS, se envía una señal al accionador de flexión que desplaza el peine y conduce a la vibración de las patillas 17.
16,18,19. La estimulación de la barba razón se elige para el CS en este paradigma experimental es la dependencia de los animales murinos en su vibrisas para la entrada de información somatosensorial durante la exploración. La estimulación de la barba se ha demostrado que es un CS fiable y eficaz 20. Por otra parte, dado el sustrato cortical bien establecida y organizada del sistema de vibrisas (es decir, la corteza barril), la estimulación de la barba como el CS proporciona una herramienta elegante para el mapeo de los cambios corticales y la plasticidad asociada con el aprendizaje parpadeo acondicionado 20,21. Un sistema de cabezal fijo permite la estimulación precisa de los bigotes seleccionados para comparar las respuestas entre las neuronas y las neuronas que reciben entradas de los bigotes no estimulados estimulados. Por último, muchas cepas de ratones muestran la pérdida de audición relacionada con la edad como adultos relativamente jóvenes
Aquí se presentan son modificaciones únicas e importantes sobre otras preparaciones de cabeza-fijo para condicionamiento del parpadeo, incluyendo procedimientos para la administración de CS y Estados Unidos, y la adquisición de la respuesta de parpadeo. La fiabilidad de este aparato y el paradigma de la formación en el condicionamiento del parpadeo se demuestra por las curvas de ratones con aire acondicionado y una curva de aprendizaje relativamente plana de los animales de control pseudoconditioned (Figura 7A) el aprendizaje.
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Protocol
Todos los procedimientos se llevaron a cabo con ratones, de acuerdo con los protocolos aprobados por Institucional Cuidado de Animales de la Universidad Northwestern y el empleo basado en las directrices emitidas por el Instituto Nacional de Salud.
1. El cilindro (Figura 2A)
- Construir el cilindro como se describe por Chettih et al., Y Heiney et al. A partir de un largo cilindro de espuma 14-15. Cortar una longitud de 10 cm de cilindro y perforar un agujero en el centro para encajar el eje, un metal varilla de 12,7 mm (0,5 in.) De diámetro. Montar el cilindro con su eje sobre una mesa óptica de metal como se describe por Heiney et al., O otro soporte (por ejemplo, plexiglás) 15.
- Erigir dos varillas metálicas verticales de 12,7 mm de diámetro en cada lado del cilindro.
- Coloque dos soportes en ángulo recto en las varillas de metal.
- Asegurar dos barras más (5 cm de largo, 12,7 mm de diámetro) a través de los soportes en ángulo recto. bisel THe los extremos de estas barras y el nivel de sus extremos por encima del centro del cilindro (Figura 2G).
- Taladrar y taladrar un agujero a través de los extremos de las barras niveladas para encajar dos tornillos 4-40 que llevarán a cabo las alas del conector en su lugar (Figura 2G).
2. Montaje del sistema de estimulación de la barba (Figura 2B)
- Cortar un segmento de 10 dientes del peine de un peine regular.
- Haga un corte alrededor de 2-3 mm de ancho y unos 5 mm de profundidad en la parte superior del peine para aceptar un accionador de flexión rectangular 2-capa.
- Soldar un cable a cada superficie del accionador de flexión. Utilice la soldadura y el flujo proporcionado por el fabricante. Cubrir el actuador y la soldadura con cinta aislante para proteger el ratón y el usuario de la corriente eléctrica.
- Slip la tira del actuador en la ranura cortada en el peine de manera que la tira del actuador de flexión se encuentra perpendicular al plano del peine. Ángulo del peine de modo que está inclinada en 45 ° y más naturalmente sigue la curva de la cara del ratón.
- Asegurar el extremo de la tira del actuador a la parte superior del peine con epoxi de fraguado rápido.
Nota: Los cables soldados a la tira actuador flexión deben conectarse a un reóstato que proporciona 40 voltios al actuador. Los experimentos anteriores han demostrado que 40 voltios es eficaz para el acondicionamiento, pero no evoca ningún respuestas de sobresalto. - Coloque el accionador de flexión y el peine en un montaje móvil. Un soporte de pipeta unida a una base magnética que se utiliza normalmente para las plataformas de electrofisiología in vitro funciona bien.
3. Montaje del conector que se monta en Rods por encima del cilindro (Figura 2C, 2E)
Nota: El conector es un 3-D impreso tira 7 hoyos modelada a partir de la tira de nylon 221 Amphenol serie utilizado para la correa de sujeción por Weiss y Disterhoft y Gálvez et al 10,17.
- Toque en el primer agujero en la tira para un x-1 0-80"Tornillo de la máquina. Esto servirá como un tornillo de bloqueo para fijar la pieza de cabeza para el conector. Colocar una tuerca 0-80 a la cabeza del tornillo de bloqueo con el pegamento cianoacrílico con el fin de facilitar el giro del tornillo con la mano.
- Deja un agujero vacío después de que el agujero roscado (para dejar espacio para la tuerca 0-80 máquina) y empujar cinco basas de confi-tac chapados en oro a través de los cinco orificios restantes.
- Pelar el recubrimiento de cinco largos cables (cables obtenidos a partir de un cable Ethernet) y la soldadura de los extremos de los zócalos.
Nota: Los dos primeros alambres se utilizan para registrar las señales electromiográficas (EMG) que detectan una respuesta parpadeo siguiente filtrado de la señal y amplificación de un amplificador. Los dos segundos entregará la señal de choque de un aislador de estímulo. El último alambre servirá como una conexión a tierra. Estos cables se conectan a los sistemas utilizados para la entrega oportuna EC-EI. - Garantizar la conectividad eléctrica entre los cables y las tomas con un multiMeter. Ponga el multímetro en la configuración de la continuidad y mantenga una de las sondas a la clavija y la otra sonda a los extremos pelados del cable. Los pasadores y los cables están conectados eléctricamente cuando la resistencia es baja y el multímetro emite un tono.
- Alternativamente, si el multímetro no tiene un parámetro de continuidad, medir la resistencia entre los pines y los cables. Hay una continuidad eléctrica si hay muy poca resistencia medida.
- Preparar las alas del conector de dos a-220 transistores de estilo. Cortar los cables de emisor, base y colector del transistor y nivelar la superficie para que pueda ser colocada en el conector.
- Corte el borde de la pestaña de montaje para romper el agujero de modo que la pestaña se deslice por debajo de la cabeza del tornillo.
- EPOXY los transistores para el conector. El agujero de la lengüeta de montaje se utiliza para fijar el conector a las barras por encima del cilindro.
- Aplicar epoxi a la base de los alambres de protruding de las tomas de corriente y permitir que el epoxi se seque. El epoxi se aislar y proteger las conexiones.
4. Preparación del casco (Figura 2D, 2E)
Nota: La tira es una pieza de cabeza 3-D impreso tira 7 hoyos modelada a partir de la tira de nylon serie Amphenol 221 utilizado para la pieza de cabeza por Weiss y Disterhoft y Gálvez et al 10,17.. Esta pieza ya no se fabrica comercialmente. El archivo de impresora se puede descargar desde la página web de esta revista.
- Toque en el primer agujero en la tira para un tornillo de máquina de 0-80 x 1 "y dejar un hueco vacío después del primer agujero.
- Empuje cinco pines chapados en oro a través de la parte inferior de los cinco orificios restantes (a través de los extremos más estrechos). Utilice un tornillo de banco para facilitar el empuje las clavijas en la tira de manera uniforme.
- El uso de un separador térmico, eliminar aproximadamente 0,5 cm de recubrimiento de poliimida del extremo de un alambre de acero inoxidable (0,005 pulg. De diámetro), soldar el extremo pelado del wire a la apertura de una de las clavijas y se corta el alambre de 0,6-0,7 cm.
- Franja de unos 0,2 cm del extremo del cable para permitir que la corriente pase al animal.
- Repita los pasos 4.3-4.4 para los tres cables restantes.
Nota: Los dos primeros alambres registrar las respuestas EMG mientras que el segundo de dos servirán para aplicar una descarga al animal. - Como la última (quinta) de alambre servirá como un cable de tierra, cortar unos 5 cm de alambre de acero inoxidable sin revestir (0,005 pulg. De diámetro), y la soldadura de la clavija restante.
- Asegurar la continuidad entre los cables y los pines con un multímetro. (En el caso del cable de tierra, que es sin recubrimiento, la sonda multímetro puede colocarse en cualquier lugar a lo largo del alambre.)
5. Preparación quirúrgica (Figura 2F)
- Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos, incluyendo la pieza de cabeza. Esterilizar la pieza de cabeza al sumergirlo en alcohol y después de enjuagar con solución salina estéril.
- Anestesiar el ratón en una cámara de inducción con 3-4% vaporized isoflurano mezclado con una velocidad de flujo de 1 a 2 L de oxígeno por minuto.
- Comprobar que el animal está totalmente anestesiado con una pizca dedo del pie. El ratón es totalmente anestesiado cuando no responde por reflejo a la pizca dedo del pie.
- Una vez que el animal ha sido totalmente anestesiado, inyectar una dosis de clorhidrato de buprenorfina como analgésico (0,05-2 mg / kg, sc), afeitarse la parte superior de la cabeza del animal, lo coloca en una almohadilla eléctrica cubierta en la base de la estructura estereotáxica , determinar que el animal está totalmente anestesiado, y seguro de la cabeza para el marco. Mantener el flujo de isoflurano vaporizado al animal, el cambio a 2% a una velocidad de flujo de 1 a 2 L de oxígeno por minuto. Aplique una pequeña cantidad de pomada oftálmica de las córneas.
- Desinfectar el cuero cabelludo con povidona yodada y alcohol tres veces cada uno, alternando entre los dos.
- Con una hoja de número 10 o 15 bisturí, hacer una incisión a lo largo de la línea media del cuero cabelludo, exponer el cráneo de la parte delantera de tque a los ojos más allá del hueso interparietal (~ 1,5-2 cm).
- Contener las aletas de la piel con pinzas de micro. Colocar un clip sobre el ojo, una a lo largo de la mitad del eje rostral-caudal, y uno en la parte posterior del cráneo bilateralmente (es decir, utilizar seis clips en total). Con el fin de evitar la avulsión del casco, exponer tanto del cráneo como sea posible, incluyendo los lados y hacia atrás. Esto aumentará el área de superficie para la aplicación del cemento de fijación adhesiva.
- Utilizando el bisturí, raspar a lo largo de la parte superior del cráneo para eliminar el periostio y asegurar una superficie de trabajo limpia y seca. Limpiar la parte superior del cráneo con 3% de peróxido de hidrógeno tres veces.
- Perforar dos agujeros en el cráneo con una fresa de cono invertido tamaño 34 o un cortador de grabado broca de 1,6 mm para aceptar tornillos 00-90 (0,0625 pulg. De largo). Los tornillos se facilita la conexión eléctrica a tierra. Coloque un agujero en frente de bregma, y el otro frente a Lambda, izquierda de la línea media cuando acondicionado right ojo. Coloque un tornillo en cada agujero. Bajar el tornillo de 0,28 mm en el cráneo por cada vuelta completa; dos vueltas completas es suficiente.
- Crear varias pequeñas divots de aproximadamente 0,75 mm de diámetro en el cráneo con el fin de aumentar el área superficial y la fuerza de agarre para el cemento.
- Tome la pieza de cabeza completado y enrollar el cable de tierra en una configuración en forma de ocho alrededor de los dos tornillos. Permitir un poco de holgura (~ 1,5 cm entre el casco y el tornillo) en el cable de tierra por lo que la pieza de cabeza pueden estar debidamente colocadas más tarde.
Nota: La figura de ocho lo general se asegura una buena conexión eléctrica entre el alambre y los tornillos de tierra. El cable también puede ser soldado al tornillo para asegurar una conexión eléctrica. - Aplique el cemento de fijación adhesiva. Siga las instrucciones del fabricante para mezclar el cemento de fijación adhesiva o mezclar 4 cucharadas de la mezcla en polvo, L-8 gotas de la base, y 2 gotas de catalizador en un plato de cerámica de mezcla en frío (temperatura de garantizar la tira on el disco de mezcla es completamente negro.) La temperatura fría se prolonga el tiempo de trabajo del cemento.
- Escudo del cráneo y los tornillos abundantemente con el cemento de fijación y permitir que el cemento se seque. Esto debería tomar sólo unos minutos.
- Después de que el cemento se haya secado, coloque el casco en posición vertical, con los pasadores de pie, por encima del cráneo. Mantenga la pieza de cabeza en su lugar con un soporte similar al conector
Nota: Consulte "3. Montaje del conector" -El titular tiene por qué ser sólo una franja de cinco orificios con los zócalos chapados en oro con el fin de recibir los pasadores de la pieza de cabeza. El soporte está conectado a un brazo en el marco estereotáxico. El uso del soporte y el brazo facilita el posicionamiento de la pieza de cabeza y los cables. - Después de que el casco ha sido posicionado, pelar la piel alrededor de la zona periorbital y la posición de los dos cables de choque para permitir que los 0,2 cm extremo pelado para descansar debajo de la piel y de aproximadamente 2-4 mm directamente caudal a la eymi. No permita que los extremos de los dos cables se toquen entre sí. Coloque los dos cables de EMG en el músculo orbicular del ojo muscular por encima de la cuenca del ojo.
- Si es necesario, cortar los extremos de los cables si son demasiado largos y parecen como si ellos pueden rayar directamente la órbita y provocar una infección. Si cortando los extremos del cable, asegúrese de que haya suficiente cable desnudo expuesto. Alternativamente, si los cables parecen demasiado tiempo, doblar el alambre de vuelta en la base, donde se extienden fuera de la pieza de cabeza.
- Cimentar la base de los alambres (es decir, el extremo más cercano al casco) en su lugar en el cráneo con una pequeña extensión superficial del cemento adhesivo y dejar secar (uso la mitad de la porción descrito anteriormente).
- Retire los clips de micro y tapa con cuidado los pliegues de piel atrás sobre el cemento. Dejar que la piel se asiente de forma natural para prevenir la tensión en cualquier parte de la piel con el fin de evitar la distorsión del párpado, la prevención de la respuesta de parpadeo,y trastornos a los animales.
- Sellar el área expuesta con cemento dental, que abarca desde la piel una incisión en el borde de la parte superior de la pieza de cabeza con cemento. Tener un cuidado especial para evitar el goteo de cemento en los ojos o los pasadores de la pieza de cabeza. Parcialmente cemento curado se puede alisar y manipulado con un paño de algodón humedecido con disolvente cemento dental. Deje que el cemento se seque por completo antes de retirar el soporte de casco.
- Deje que el animal se recupere de la anestesia en una superficie calentada antes de reemplazar el animal de nuevo en su jaula. Administrar Metacam (1 mg / kg, SQ) y luego colocar al animal en su jaula.
- Permitir que el animal 5-7 días de recuperación antes de la prueba o entrenamiento. Mantener la atención post-operatorio estándar para el animal de acuerdo con las directrices de su institución. El animal debe ser revisado al menos una vez al día después de que se ha recuperado de la cirugía. Esté atento a los signos de mala alimentación y / o beber y el comportamiento apático. Si el dolorse sospecha, proporcionar Metacam cada 24 horas (misma dosis que al final del post-cirugía) hasta aliviado. La lidocaína se puede aplicar localmente en la herida si el animal se rasca o muestra signos de malestar.
6. Colocar el ratón sobre el cilindro y Formación (Figura 2G)
- Para colocar el puntero del ratón sobre el cilindro, restringir el ratón con una mano brevemente sujetándolo por la cola con una mano y luego agarrar el ratón detrás de los hombros con índice y el pulgar con el otro. Envolver los dedos restantes alrededor del abdomen y el torso del ratón.
- Con la mano no restringir el ratón, coloque el conector en el casco sobre la cabeza del ratón y girar el tornillo de bloqueo.
- Coloque el ratón suavemente en el cilindro y mantenerlo en su lugar mientras se coloca el conector en el bastidor. Usa los dos tornillos para fijar el conector a las barras por encima del cilindro.
- Una vez que el conector se ha fijado al bastidor del cilindro, release el asimiento en el ratón. Dar el ratón de un solo día de dos sesiones de habituación al cilindro. Permitir que cada sesión de habituación la misma duración que cada sesión de condicionamiento.
- Record velocidad de parpadeo espontánea durante la habituación y la pre-exponer los ratones a la vibración de la barba CS con el fin de minimizar la aparición de respuestas de sobresalto. Aplicar el CS como ocurre durante una sesión de condicionamiento real, pero sin la descarga eléctrica de Estados Unidos.
- Aplicar la estimulación whisker CS colocando el sistema Piezo cerca (alrededor de 0,5 cm) en el lado acondicionado (el lado derecho) del ratón, mientras que el deslizamiento de los dientes del peine sobre barbas individuales. Asegúrese de que los mismos bigotes se estimulan día a día mediante la colocación del sistema piezoeléctrico en la misma posición en el día a día.
- Comenzar a entrenar con el ratón sobre el condicionamiento clásico. Entregar dos sesiones de entrenamiento por día durante cinco días. Dejar dos horas entre cada sesión de entrenamiento.
- Para el grupo, charcutería acondicionadover treinta ensayos por sesión de una vibración barba 250 ms larga CS (60 Hz) se combina con un 100 ms largo pulso eléctrico de Estados Unidos (0,3 mA - 3 mA, entregados a partir de un estímulo WPI A385R aislador). Separar el CS y los EE.UU., con un intervalo libre de estímulo a largo mseg 250 de seguimiento para hacer depender la tarea en el hipocampo (Figura 1) 23.
- Ajustar la intensidad de la descarga eléctrica para cada animal para que se evoca un abrir y cerrar. ensayos por separado con un intervalo entre ensayos aleatorios de 30-60 segundos (promedio de 45 segundos, la duración total de 30 minutos por sesión.)
- Entregar treinta desapareado CS solo y ensayos por sí solo nos cada uno (para un total de sesenta y ensayos) con el grupo pseudoconditioned, usando los mismos parámetros del estímulo como se ha indicado para el grupo de acondicionado. Asegúrese de que sólo el EC y el EI ensayos solo se pseudorandomized de tal manera que ningún estímulo se presenta más de dos veces en una fila. Separar cada ensayo con un intervalo entre ensayos promedio de 22,5 seg.
- Delawarehígado ruido de fondo en 65 dB a lo largo de la habituación y la formación con el fin de enmascarar el ruido de la vibración generada por el estimulador de la barba.
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Representative Results
viejo macho C57BL6 / J ratones 8-10 semanas fueron entrenados en el trazado del parpadeo acondicionado en el aparato de cinta cilíndrica cabeza fija. 8 ratones fueron entrenados con pareadas presentaciones CS-US (grupo acondicionado) y 9 ratones fueron entrenados con las presentaciones no apareados EC y el EI (grupo pseudoconditioned).
Grabaciones Ejemplo EMG de una respuesta condicionada de un ratón condicionado se muestran en las figuras 3 y 4. Registros de EMG para cada ensayo se rectificaron y se integran con una constante de tiempo de 10 ms. La figura 5 muestra la rectifica y se integraron los rastros de respuesta EMG promedio a través de todos los ensayos para cada uno de 10 sesiones, tanto para un acondicionado (A) y un ratón pseudoconditioned (B). La evolución de respuestas condicionadas se puede ver en la Figura 5A, con respuestas cada vez más grande más cerca del inicio de los EE.UU.. Esta evolución no se ve in las respuestas en la figura 5B pseudoconditioned.
La evolución de oportuno, y respuestas condicionadas por lo tanto, bien aprendidas también se puede ver en la Figura 6. La Figura 6 muestra los histogramas de tiempo para el pico de la respuesta después de CS inicio. Hay un pico inicial en el gráfico entre 0 - 150 ms después del inicio CS. Este pico inicial se puede ver ya en sesión 1. Con más sesiones de formación, no es el desarrollo de un segundo pico en el gráfico de entre 400 a 500 mseg entre los animales acondicionado, lo que indica el desarrollo de respuestas condicionadas en mejor momento.
La figura 7A muestra las respuestas de adaptación condicionado por ciento promediados registrados a partir de ratones condicionados y pseudoconditioned. Las respuestas de adaptación acondicionado se considera que tienen una actividad significativa que está presente al menos 20 mseg befinicio mineral de los Estados Unidos (es decir, al menos 4 SD mayor que la actividad media presentes 250 mseg antes de CS inicio). Durante las sesiones de entrenamiento, los ratones mostraron acondicionado de aprendizaje gradual del paradigma de condicionamiento por exhibir respuestas adaptativas más condicionados con cada sesión de entrenamiento para que los ratones condicionada exhibió significativamente mayor de respuestas adaptativas acondicionado que los ratones pseudoconditioned (grupos, F (1,15) = 20.62, p <.0005; sesiones, F (1,9) = 9,987, p <.0001; grupos * sesiones, F (1,9) = 5.977, p <0,0001). Tenga en cuenta que el grupo pseudoconditioned típicamente exhibe seudo CRs con menos de 20% de los ensayos.
La Figura 7B muestra el área promedio de acondicionado de respuesta (el área bajo la curva de la respuesta EMG rectificada e integrada) para ambos ratones acondicionado y pseudoconditioned más de las diez sesiones de entrenamiento. Planificación de las comparaciones con un ANOVA de medidas repetidas sobre el Last cuatro sesiones (es decir, sesiones de 7-10, una vez que el grupo acondicionado había alcanzado un criterio de aprendizaje de 60% CR) muestran un importante efecto principal de grupo, lo que indica que el área de CR fue mayor en el grupo que en el aprendizaje condicionado grupo post pseudoconditioned El criterio (grupos, F (1,14) = 5,733, p <0,05; sesión, F (1,3) = 0,486, ns; grupos * sesión, F (1,3) = 0,432, ns).
La figura 7C muestra las respuestas de sobresalto (alfa), como promedio por ciento registrados a partir de los ratones acondicionado y pseudoconditioned. respuestas alfa son la actividad dentro de los 50 m de CS inicio que eran al menos 4SD por encima de la actividad basal media. Durante las sesiones de entrenamiento, condicionado y pseudoconditioned ratones normalmente exhiben respuestas alfa con menos de 25% de los ensayos, sin diferencias significativas entre ratones condicionados y pseudoconditioned (grupos, F (1,15) = 2,502, ns). The medidas repetidas ANOVA embargo, no revelan una interacción significativa de los grupos y sesiones debido a la disminución en las respuestas pseudoconditioned y el mantenimiento de las respuestas de alfa a aproximadamente 25% para los ratones condicionado (grupos * sesiones, F (1,9) = 2,074, p <0,05). El aumento en las respuestas alfa durante la sesión de 10 es probablemente debido a la corta latencia del comienzo de la CR bien desarrollado.
La Figura 7D muestra el porcentaje promedio de respuesta corto latencia registrado de ambos grupos de ratones. respuestas de latencia corta reflejan la actividad entre 50-70 ms después de la aparición de CS que era 4SD por encima de la actividad basal media. Un ANOVA de medidas repetidas revelaron que los animales exhiben respuestas condicionadas de latencia más cortos que los animales pseudoconditioned lo largo de los diez sesiones de entrenamiento (grupos, F (1,15) = 5,377, p <0,05; sesión, F (1,9) = 3.920, p <.0005; grupos * sesión, F (1,9) = 3.158, p <0.005). Ta su vez puede reflejar un inicio más temprano de la CR, ya que el grupo CR acondicionado exhibió más grandes con cada sesión de entrenamiento.
Figura 1:. La traza Eyeblink acondicionado paradigma en la traza del parpadeo acondicionado, un estímulo condicionado inocuo (CS) está emparejado con un estímulo no condicionado ligeramente nocivo (EE.UU.) destinado a inducir una respuesta de parpadeo. El EC y están separados por una brecha temporal libre de estímulo, por lo que el paradigma dependiente del hipocampo 23. En el paradigma descrito aquí, un 250 mseg vibraciones bigote largo CS se empareja con un 100 ms larga periorbital choque de Estados Unidos. El EC y están separados por una brecha de 250 mseg temporal. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. El Head-fijo Preparación A, la puesta a punto fijo de cabeza para el condicionamiento del parpadeo con el cilindro, el estimulador de la barba, y el conector indicado B, El estimulador de la barba con el accionador de flexión de dos capas y el peine se indica.. C, el conector con las partes individuales se indica: el tornillo de bloqueo, la tira 7 hoyos, los cables soldados a las tomas y epoxi para preservar los alambres, las alas convertidas de un a-220 transistor estilo D, la pieza de cabeza con el individuo. partes indicadas: la tira 7 hoyos, los pasadores y los cables soldados en los pernos, incluyendo el cable de tierra de acero inoxidable sin recubrimiento, y el choque individual y alambres de acero inoxidable de EMG, con 0.2 cm de recubrimiento de poliamida se quitó el extremo e. , la configuración para cada agujero en la tira 7-agujero para el conector y en elcasco. M, un ratón con un casco implantado quirúrgicamente. G, Se coloca un ratón en el cilindro, listo para ser entrenado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. Ejemplo EMG grabación Las líneas azules delinean la presentación CS (250 mseg). Las líneas rojas delinean la presentación de EE.UU., que muestra el artefacto que proviene de la descarga eléctrica (100 ms). El EC y están separados por un intervalo libre de estímulos de 250 ms. Dentro de este intervalo libre de estímulo es la actividad EMG mayor amplitud (en relación con la admisión) que delimita una remisión completa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. </ A>
Figura 4:. Ejemplo EMG y grabaciones de reflexión de infrarrojos ópticos correspondientes El registro EMG es tan preciso como el sensor óptico de infrarrojos de reflexión en la detección de la aparición respuesta condicionada (línea azul), la latencia a pico de respuesta (línea roja), y el inicio de respuesta de parpadeo no condicionado ( línea rosa). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5:. Promediado Traces parpadeo promediados rectificadas y trazas integrados de la respuesta de parpadeo para un ratón acondicionado (A) y un ratón pseudoconditioned (B). Cada traza representa la mediala respuesta del ratón para todos los ensayos más de una sola sesión. La sección azul representa la respuesta de vibración durante la presentación de la barba CS. La sección roja representa la respuesta durante el intervalo de traza libre de estímulo. En A, el choque de EE.UU. indujo un artefacto que está presente en el área gris oscuro después del intervalo de traza. B muestra las respuestas a la vibración de la barba CS solamente. Presentación del CS mismos y que nos ensayos solo se pseudorandomized en pseudoconditioning. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
. Figura 6: Los histogramas de la Respuesta Horas pico histogramas del tiempo para el pico de respuesta para todos los condicionada (n = 8; barras azules) y 8 pseudoconditioned (barras rojas) para todos los animales trmate- a través de todas las sesiones (datos de un ratón pseudoconditioned fue excluido para permitir una comparación directa de la cantidad de respuestas entre los grupos). barras de color púrpura indican donde se superponen los animales acondicionado y pseudoconditioned. Las horas pico de respuesta se calculan como el momento del pico más alto del registro EMG rectificada e integrada entre la EC y el inicio. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Curvas de respuesta de los animales condicionado (n = 8; curvas de color azul) y animales pseudoconditioned (n = 9; curvas rojas). A Porcentaje de respuestas de adaptación promediada acondicionado (± SEM) para los animales condicionados y pseudoconditioned lo largo de 10 sesiones de entrenamiento. B, zona promediados (± SEM) de la CR para condicionaday los animales pseudoconditioned lo largo de 10 sesiones de entrenamiento. C, Porcentaje promediada Alfa Respuesta (± SEM) para los animales condicionados y pseudoconditioned más de 10 sesiones de entrenamiento. D, porcentaje promediada Las respuestas de latencia corta (± SEM) para acondicionado y pseudoconditioned lo largo de 10 sesiones. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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parpadeo acondicionado clásica es una forma de aprendizaje asociativo que es una herramienta útil para la comprensión de los sustratos neurales aprendizaje y la memoria subyacentes. Los métodos anteriores utilizados para el acondicionamiento del parpadeo en roedores como ratones involucrados una cámara que permitió que el animal se mueva libremente. Una preparación de cabeza fija para el acondicionamiento del parpadeo en ratones, utilizando el aparato descrito por Chettih et al., Y Heiney et al., Y más recientemente utilizado en parpadeo acondicionado traza luz evocado en Siegel et al. Ofrece varias ventajas, tales como permitir a ciencia cierta procedimientos y experimentos que se llevaron a cabo durante el condicionamiento del parpadeo que no había sido posible o se había limitado en el pasado (por ejemplo, imágenes de calcio de dos fotones en vivo) 14-16. Este tipo de preparación también facilita el uso de otras técnicas tales como la electrofisiología in vivo con matrices de tetrodo. Como los ratones parecen ser Distressed de la restricción, esta preparación de frente fijo fue desarrollado para mantener las cabezas segura al tiempo que reduce la cantidad de restricción requerido. Si bien esta preparación permite que los ratones deambular en una cinta cilíndrica, otros también han recogido correctamente los datos de comportamiento de la cabeza de ratones fijo en una plataforma estable 24.
Hay, sin embargo, ciertos problemas que surgen con el uso del sistema de cilindro-cabeza fija. Una preocupación es que cuando uno se coloca inicialmente un ratón sin entrenamiento en el cilindro, puede ser necesario algún tiempo para aprender a descansar, caminar o correr en el nuevo aparato. La mayoría de los ratones aprenden rápidamente a descansar, caminar o correr en el cilindro cómodamente. Dos sesiones de habituación ayudan a acostumbrar a los ratones al cilindro y por medio de la segunda sesión, la mayoría de los ratones son cómodas en el cilindro. Otra preocupación que surge es la avulsión casco. Ha habido algún problema con esto en el pasado durante las sesiones de entrenamiento de varios días, pero el uso de la cementación adhesiva cele- ha mejorado problemas con avulsión del casco. El uso del cemento de fijación adhesiva se ha traducido en 0% avulsiones headpiece de más de 50 cirugías ya que con esta técnica. Con el uso correcto y dispersión suficiente del cemento en el cráneo, los investigadores deben encontrar ningún problema con avulsión del casco. Por último, mediante la presentación de la CS durante las sesiones de habituación, puede haber cierta preocupación por la inhibición latente. Está claro, sin embargo, que los ratones se acondicionaron con éxito (véase la Figura 7). Tenga en cuenta que la intensidad de la vibración de la barba se puede modificar cambiando la cantidad de voltaje que se pasa por el reostato. Si los ratones no son capaces de aprender, la tensión se puede aumentar para apoyar acondicionado éxito, mientras que se minimizan las respuestas de sobresalto. Los investigadores también pueden cambiar el tipo de descarga eléctrica de Estados Unidos que se administra al animal. La descarga eléctrica de Estados Unidos puede ser un solo pulso eléctrico que dura 100 ms como se informó aquí. Alternativamente, como THe estímulo aislador utilizado en este protocolo es capaz de transmitir impulsos bifásicos, los investigadores también pueden emplear 120 Hz 6 pares de impulsos bifásicos de 1 ms por impulso de una descarga eléctrica efectiva de Estados Unidos también.
Boele et al. Indica la probabilidad de que ciertas "respuestas condicionadas" pueden surgir de sobresalto (alfa) respuestas a la CS o respuestas de latencia corta (SLR) 25. respuestas alfa son considerados como los cierres rápidos dentro del párpado una latencia mseg después de 50 CS inicio. Los ratones a menudo mantienen sus ojos cerrados durante la duración del ensayo, a raíz de esta respuesta alfa. SLR, por el contrario, tienen una latencia de 50-70 milisegundos desde el inicio CS y por lo general surgen después de sólo unos pocos emparejamientos CS-estadounidenses. La latencia corta al inicio de la alfa y las SLR y el hecho de que las SLR pueden surgir después de sólo unos pocos emparejamientos CS-Estados Unidos indican que es probable que no se rige por los circuitos del hipocampo-cerebelosa. Estas observaciones revisadas por Boele et al. Tor lo tanto pedir la cuestión de si los CR grabadas aquí se aprenden las respuestas. Como muestra la Figura 7C y 7D muestran, ni respuestas ni alfa SLR representan la mayoría de los CR grabadas, lo que sugiere que los CR adaptativos están mediadas por el cerebro anterior y el cerebelo. Los histogramas en la Figura 6 que muestran la latencia para el pico de la respuesta del parpadeo siguiente CS inicio también indica que mientras que ciertos ensayos pueden incluir un alfa aparición temprana o latencia de respuesta corto, con más ensayos de entrenamiento, el pico de la respuesta de parpadeo se produce realmente más tarde y más cerca de la aparición de los EE.UU., lo que indica el desarrollo de respuestas condicionadas bien la acción. Como se mencionó anteriormente, la estimulación de la barba y la intensidad de choque fueron atenuadas a un nivel que no era sorprendente o demasiado aversivo, pero seguía siendo eficaz en la producción de respuestas de adaptación acondicionado. Por último, como muestra la figura 7B, el tamaño de la CR (medida como el área bajo lacurva en la respuesta rectificada e integrada, como en la figura 5) es mayor en el grupo de acondicionado que en el grupo pseudoconditioned una vez que el grupo acondicionado alcanzó un criterio de aprendizaje de 60%, lo que significa que estas respuestas requieren varias sesiones para aprender, a diferencia de las SLR y alfa respuestas.
Boele et al., También señaló que las mediciones EMG, mientras que un método preciso de detección de parpadeo en los animales más grandes como conejos, no son tan prácticos en pequeños roedores como ratones 25. Ellos recomiendan el uso de la técnica de medición de la distancia magnética (MDMT) para evitar la detección de falsas señales positivas que la grabación de EMG puede indicar. La técnica MDMT, mientras que impresionante en su sensibilidad y calidad de detección de parpadeo, también presenta el inconveniente de tener que anestesiar al animal cada día de entrenamiento con el fin de colocar el chip 26. Esto en sí mismo puede confundir a las tasas de aprendizaje. Nos encontramos con que las señales de EMGgrabado con los procedimientos descritos aquí se obtienen fácilmente, de alta resolución temporal, fiable y relativamente fácil de medir y analizar.
La Figura 4 muestra una señal de EMG representante detectar parpadea con una señal correspondiente de un sensor óptico reflexivo infrarrojo colocado cerca de los ojos del ratón durante el entrenamiento. Existe una clara correlación en la detección de parpadeo entre la señal de EMG y el sensor óptico, que denota la precisión de la detección de parpadeo utilizando registros de EMG. Una ventaja de registros de EMG es que permite a la mayor resolución temporal. Aunque la resolución se degrada mediante la integración de más de una constante de tiempo 10 ms, también se puede analizar los datos de la EMG primas para detectar la actividad parpadeo. Recuento de Spike es un parámetro que puede ser utilizado para detectar CRs 18. Una desventaja con registros de EMG es que las señales, sin duda, ser contaminados por el artefacto eléctrico procedente de la descarga eléctrica de Estados Unidos (véase
La preparación de frente fijo descrito aquí es similar a la presentada por Heiney et al. 15 Hay, sin embargo, algunas diferencias notables de su sistema elegante. Por ejemplo, el método descrito aquí para registrar las respuestas de parpadeo son alambres colocados por vía subdérmica por encima del ojo para registrar la actividad EMG. Esta técnica permite grabaciones fiable y estable de la actividad de párpado y, por tanto, de la respuesta de parpadeo. La colocación correcta y la fijación de estos cables asegura grabaciones de calidad que duran al menos dos semanas, la duración del experimento. Una ventaja de utilizar cables EMG en lugar de un alto-speed cámara como el usado por Heiney et al., es que tienen registros de EMG extremadamente alta resolución temporal, y no requieren la colocación diaria y calibración que requiere una cámara 15. La cámara, sin embargo, ofrecen determinación visual directa de cierre de los párpados.
Otra diferencia entre los dos sistemas es el método para la entrega de CS. Esta preparación ratón de cabeza fija particular utiliza la estimulación de la barba como el estímulo condicionado. Los resultados demuestran que los ratones pueden ser acondicionadas de manera efectiva con la estimulación de la barba como el CS, al igual que los conejos cabeza-fija se pueden acondicionar con la vibración de la barba 27. Heiney et al. Demostró la estimulación de la almohadilla de la barba como un CS eficaz dirigiendo un soplo débil de aire a la almohadilla 15 de la barba. Aunque ambas técnicas demuestran acondicionado eficaz, la colocación de un peine sobre bigotes seleccionados y vibrando el peine permite la capacidad de estimular whiske individuor filas o incluso barbas individuales. Esta técnica se ha utilizado en estudios previos para permitir que los animales sirven como su propio control (es decir, la fila de la barba estimulado se comparó con una fila de patillas no estimuladas) 20.
En resumen, una preparación de frente fijo de parpadeo acondicionado bigotes que se comunica permite para una plataforma craneal garantizado para realizar técnicas avanzadas y experimentación que anteriormente había sido imposible o difícil de realizar. la estimulación de la barba leve se utiliza como el estímulo condicionado y se utilizó un choque eléctrico suave como el estímulo no condicionado. parpadeo respuestas se registraron con los cables colocados por vía subcutánea detrás del párpado. aprendizaje fiable se demostró en ratones con la estimulación directa de los bigotes seleccionados como el CS y descargas eléctricas periorbital como los EE.UU., y hay aprendizaje fue evidente en los ratones que recibieron presentaciones aleatorias de la CS y los EE.UU.. Los registros de EMG proporcionan un confiable y reltivamente método simple para registrar las respuestas de parpadeo y observando cómo cambian las respuestas a través de las sesiones de entrenamiento.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el Departamento de Defensa (W81XWH-13-01-0243) y los Institutos Nacionales de Salud (R37) AG008796. Agradecemos a Alan Baker en el taller de maquinaria para la construcción de la Universidad de Northwestern el aparato de cilindro de cabeza fija. Agradecemos al Dr. Shoai Hattori por su orientación en MATLAB y Solidworks. Agradecemos al Dr. John Power para el software LabView que controló el experimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Exervo TeraNova Foam Roller 36" x 6" | Amazon | B002ONUM0E | For cylinder |
| Plexiglas | Custom-made; 1 cm thick | ||
| Metal Rods (12.7 mm diameter) | Custom-made | ||
| 4-40 machine screw (.25 in. long) | Amazon Supply | B00F33Q8QO | For cylinder |
| Classic Design Hair Comb | Conair | 93505WG-320 | For whisker stimulation |
| 2-Layer Rectangular Bending Actuator | Piezo Systems | T220-A4-303X | For whisker stimulation |
| Solder and Flux Kit | Piezo Systems | MSF-003-NI | For whisker stimulation |
| Magnetic Base | Thor Labs | MB175 | For whisker stimulation |
| Threaded rod for magnetic base | Custom-made | ||
| Strips based on 221 series nylon strip connectors from Electronic Connector Corp. | Custom-made, based on Weiss and Disterhoft, 2008 | ||
| TO-220 Style Transistor | Amazon Supply | B0002ZPZYO | For connector; for the wings |
| Relia-Tac Sockets | Electronic Connector Corp. | 220-S02 | For connector |
| Relia-Tac Pins | Electronic Connector Corp. | 220-P02 | For headpiece |
| 0-80 stainless steel machine screw (1 in. long) | Amazon Supply | B000FN68EE | Locking Screw |
| 0-80 stainless steel machine screw hex nut (5/32 in. thick) | Amazon Supply | B000N2TK7Y | Locking Screw Head |
| Loctite Super Glue-Liquid | Loctite | 1365896 | Cyanoacrylic glue; for the locking screw |
| Quick Setting Epoxy | Ace Hardware | 18613 | For connector and whisker stimulation system |
| Ethernet Cable Wires | Ethernet cable can be taken apart to use the individual wires for the connector | ||
| Polyimide coated stainless steel wires (2 in. long, .005 in. diameter) | PlasticsOne | 005sw/2.0 37365 S-S | For headpiece, EMG and shock wires |
| Stainless steel uncoated wire (.005 in. diameter) | AM Systems | 792800 | For headpiece, ground wires |
| Tenma Variable Autotransformer | Tenma | 72-110 | For the whisker stimulation; rheostat to adjust current to the bending actuator |
| Amplifier | A-M Systems | 1700 | Amplifier for filtering and amplifying EMG signals |
| WPI A385R stimulus isolator | World Precision Instruments | 31405 | For the electrical shock |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein: Animal Health | 50031 | For surgery; anesthesia |
| Buprenex Injectable CIII | Reckett Benckiser Pharmaceuticals Inc | NDC 12496-0757-1 | For surgery; analgesic |
| Akwa Tears: Lubricant Ophthalmic Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | Artificial tear ointment to prevent dry eyes while under anesthesia |
| Povidine-Iodine Prep Pads | PDI | NDC 10819-3883-1 | For surgery; antiseptic |
| Alcohol Prep Pads | May be purchased from any standard pharmacy | ||
| Stainless steel surgical scalpel handles (no.3) | Integra Miltex | 4-7. | For surgery |
| Stainless steel surgical scalpel blades | Integra Miltex | 4-310 or 4-315 | For surgery; number 10 or 15 scalpel blade |
| 3% Hydrogen Peroxide | May be purchased from any standard pharmacy | ||
| Micro Clip | Roboz | RS-5459 | For surgery, to hold back skin |
| 00-90 stainless steel machine screw (0.0625 in. long) | Amazon Supply | B002SG89X4 | For surgery, to wrap ground wire around |
| Professional Rotary Tool | Walnut Hollow | 29637 | Hand drill for surgery, to drill holes in skull |
| Inverted Cone Burr | Roboz | RS-6282C-34 | Inverted cone burr size 34; for surgery, to drill holes in skull |
| Engraving Cutter Drill Bit | Dremel | 106 | Engraving cutter; 1.6 mm bit; for surgery, to drill holes in skull |
| C&B Metabond-Quick! Cement System "B" Quick Base | Parkell | S398 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System Clear L-Powder | Parkell | S399 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System "C" Universal TBB Catalyst 0.7 ml | Parkell | S371 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System Ceramic Mixing Dish with temperature strip | Parkell | S387 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| Swiss Tweezers, style #5 | World Precision Instruments | 504506 | For surgery |
| Puritan Cotton-Tipped Applicators | VWR International | 10806-005 | For surgery |
| Dental Caulk Grip Cement Kit | Dentsply | 675570 | For surgery; dental cement |
References
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