Introduction
سرطان المبيض الظهاري (EOC) هو السبب الأكثر شيوعا للوفاة من الخباثة خاص بأمراض النساء، مع ما يقدر بنحو 21290 حالة إصابة جديدة في الولايات المتحدة في عام 2015، ويقدر بنحو 14180 حالة وفاة 1. يتم تشخيص الغالبية العظمى (> 75٪) من النساء يعانون من مرض في وقت متأخر من المرحلة (المرحلة الثالثة أو الرابعة) تتميز منتشر في جميع أجزاء داخل البريتوني وسوء أحوال الطقس. تكرار المرض في التجويف البريتوني بعد العلاج الكيميائي الخط الأول كما هو شائع، ويمثل أحد الأسباب الرئيسية لوفيات 2،3. EOC مستطير بواسطة آلية فريدة من نوعها تضم كلا من امتداد مباشر من الورم الأساسي إلى أجهزة البريتوني المجاورة فضلا عن التفكك أو سفك الخلايا من سطح الورم الرئيسي باسم خلايا مفردة أو مجاميع متعددة الخلايا. يتم تسليط الخلايا في التجويف البريتوني، حيث أنها مقاومة الناجم عن انفصال الخلايا 4. تراكم الاستسقاء البريتوني هو شائع، حيث تتصدى الخلايا السرطانية تسليط التصريف اللمفاوي البريتوني ورumors إنتاج عوامل النمو التي تغير نفاذية الأوعية الدموية. جزء من الخلايا السرطانية سقيفة نعلق على السطح من الأجهزة والهياكل البريتوني بما في ذلك الأمعاء والكبد والثرب ومساريق، وعندها ترسيخ وتتكاثر لإنتاج العديد من الآفات الثانوية نطاق واسع 3،5. ورم خبيث الدموي غير شائع. وهكذا، وإدارة السريرية يتكون عادة من عملية جراحية cytoreductive بما في ذلك "debulking الأمثل"، الذي يعرف بأنه استئصال كل الورم مرئية (مهما كانت صغيرة). ويرتبط cytoreduction كاملة مع زيادة كبيرة في البقاء على قيد الحياة بشكل عام 6،7 ويترافق مع التحدي المتمثل في تحديد وإزالة الآفات <0.5 سم.
لقد أثبتت النماذج الحيوانية الصغيرة فائدة في البحث سرطان المبيض في تحسين فهمنا لتطور المرض، وكذلك في تحديد المؤشرات الحيوية النذير واختبار الكيميائي جديدة أو نهج الجمع بين العلاج. كما الابتدائيموقع الإصابة بسرطان المبيض وورم خبيث هو التجويف البريتوني، ونماذج مثلي من EOC ورم خبيث تنطوي على تحليل وتوصيف المرض داخل الصفاق. وإن كانت هناك تحسينات الأخيرة في القدرة على خلايا الورم صورة، حتى على مستوى خلية واحدة، لا تزال هناك صعوبات كبيرة في قياس عبء الورم النقيلي من مركز عمليات الطوارئ. تبرز هذه التحديات نظرا لعدد وحجم وموقع تشريحي من الآفات النقيلي. وعلاوة على ذلك توجد حاجة إلى الخلايا السرطانية التسمية لتمييزها عن الخلايا المضيفة العادية. وقد استخدمت الدراسات السابقة بروتوكولات وضع العلامات على الأضداد أو ترنسفكأيشن من الخلايا السرطانية مع 8،9 وسيفيراز. وذكر العلامات الفلورية المباشر للخلايا السرطانية أولا قبل Chishima وزملاء العمل في عام 1997 10. تسميات الفلورسنت لا تتطلب إضافة الركيزة الخارجية، وتوفير مجموعة رائعة خصوصية الخلايا السرطانية، وتوفير وسيلة أكثر فعالية لتعقب السرطان ورم خبيث 11،12
هنا نحن تصف طريقة التصوير الضوئي للتحليل الكمي من المرض المنتشر باستخدام نموذج طعم أجنبي مثلي مسانج تتألف من أحمر ببروتين (RFP) -tagged الفئران ID8 خلايا سرطان المبيض 13 و الفئران C57 / BL6 المناعية المختصة. ونحن لشرح طريقة رواية النسبي تقدير عبء الورم الجمع في الجسم الحي وخارج الحي التصوير مع إزالة الأنسجة لصناعة السيارات في مضان. هذا النهج لديه فائدة محتملة في دراسات تهدف إلى تقييم تأثير معين وراثية، أو جينية الدقيقة البيئي التعديلات و / أو طرق العلاج على الانبثاث-جهاز معين من سرطان المبيض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافق جميع في الدراسات المجراة من قبل جامعة نوتردام رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام وتستخدم أنثى الفئران C57 / BL6J.
زراعة الخلايا 1. الفئران سرطان المبيض
- جعل ID8 الفئران المبيض مستنبت الخلايا السرطانية على النحو التالي: 1 لتر من Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع 4٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين، 5 ميكروغرام / مل الانسولين، 5 ميكروغرام / مل ترانسفيرين و5 نانوغرام / مل الصوديوم زيلونيت.
- تنبيغ ID8 الفئران خلايا سرطان المبيض 13 للتعبير عن بروتين أحمر فلوري (RFP) باستخدام الجزيئات lentiviral شراؤها تجاريا معربا عن طلب تقديم العروض وعلامة الاختيار (blasticidin الجينات). لاحظ أن البروتين الفلوري الأخضر يمكن استخدامها، ولكنها توفر إشارة مضان أضعف.
- مباشرة قبل تنبيغ الخلايا ثقافة إلى 50-70٪ التقاء وإضافة المتوسطة الطازجة (بدون البنسلين / الستربتومايسين) يتضمن 1 مل polybrene (5 ميكروغرام / مل النهائيتركيز).
- بلطف ماصة طلب تقديم العروض، الفيروسة البطيئة (20 ميكرولتر) قطرة قطرة في طبق واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة. إزالة المتوسطة واحتضان مع المتوسط الطازجة لمدة 24 ساعة. بدء اختيار الخلايا transduced بإضافة blasticidin إلى مستنبت (5 ميكروغرام / مل)، ومراقبة لخلايا الدم الحمراء باستخدام المجهر مضان (Figure1).
- ثقافة الخلايا الموسومة طلب تقديم العروض في ID8 المتوسط عن طريق بذر حوالي 10 6 خلايا في طبق زراعة الأنسجة وتصور يوميا باستخدام مجهر الضوء حتى أحادي الطبقة الخلية متموجة.
- عندما متموجة، حصاد الخلايا باستخدام التربسين (0.25٪، 3 دقيقة) والعودة القارورة إلى 37 درجة مئوية الحاضنة حتى يتم فصل الخلايا.
- تحييد التربسين مع 6 مل من مستنبت ID8 المحتوية على مصل. ماصة صعودا وهبوطا ضد أسفل الطبق، ثم نقل إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. أجهزة الطرد المركزي في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة، ثم نضح المتوسط باستخدام GLالحمار ماصة.
- غسل الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) عن طريق إعادة التعليق بلطف في 6 مل دافئ برنامج تلفزيوني والطرد المركزي كما هو الحال في 1.5 أعلاه. إعادة تعليق في برنامج تلفزيوني لتركيز النهائي من 5 × 10 6 خلية / مل. حفاظ على الخلايا الحارة (37 درجة مئوية) حتى الحقن.
2. الحقن داخل الصفاق من الخلايا ID8 وفي التصوير فيفو
- حقن كل فأر مع 2 مل من محلول ID8-برنامج تلفزيوني الدافئ لمدة ما مجموعه 10 ملايين الخلايا من خلال داخل الصفاق (IP) حقن. تسمح للخلايا السرطانية على النمو في الجسم الحي لحوالي 10 أسابيع مع التصوير الحي الأسبوعي.
- مباشرة بعد الحقن وكل أسبوع بعد ذلك، وزن الفئران ثم تخدير كل فأر باستخدام آيزوفلوران (معدل تدفق 2.5٪ في 0.5 لتر / دقيقة O 2 التدفق). ملاحظة: تم وزن الفئران، وليس كإجراء الكمي للعبء الورم، ولكن بدلا مقياس أعم من الماوس الفردية التقدم المادي طوال فترة الدراسة. الفئران تزنوتمت مقارنة نهاية الخبر مع القيم الوزن السابقة الخاصة بهم.
- تخدير الفئران عن طريق وضع في غرفة آيزوفلوران. الحفاظ على التخدير المستمر أثناء المسح الضوئي عن طريق وضع رئيس الماوس في مخروط الأنف للتعرض إلى 2.5٪ آيزوفلوران معدل التدفق في جميع أنحاء الداخلي.
- استخدام كريم مزيل الشعر لإزالة الشعر على الجذع والبطن من كل فأر، والشعر الأسود سوف يسبب توهين للإشارة مضان. واستحم الفئران مع ماء دافئ بعد تطبيق كريم مزيل الشعر وتجفيفه مع المناشف الورقية RT.
- في حين تخدير والمسح الضوئي لكامل الجسم من كل فأر باستخدام نظام التصوير الضوئي الحيوانات الصغيرة. مسح جميع الفئران في لفيف في كل نقطة زمنية. استخدام بروتوكول خطوتين التالية (الشكل 2A):
- في الخطوة 1، لمراقبة fluorescently المسمى (RFP) الخلايا السرطانية، وتنفيذ الاستحواذ متعدد الأطياف لجمع ما مجموعه 5 الصور باستخدام مرشحات الإثارة من 440 نانومتر و 460 نانومتر، 480 نانومتر و 520 نانومتر و 540 نانومتر، وتصفية الانبعاثات من 600 نانومتر. استخدام المعلمات الاستحواذ التالية: التعرض قياسي قدره 15 ثانية و 2 × 2 binning، فوف من 160 ملم، ووقف و 1.1.
- في الخطوة 2، لمراقبة الحيوان كله، والحصول على صورة الانعكاس باستخدام فلتر مفتوح الإثارة (الضوء الأبيض)، وهو مرشح الانبعاثات مفتوحة، والتعرض القياسي من 0.2 ثانية مع 2 × 2 binning وفوف من 16 سم. ملاحظة: وقت التصوير الفعلي هو ~ 1 دقيقة.
3. ماوس تشريح والحصول على الصور
- عندما يظهر التصوير الحي وجود مرض أو الحيوانات داخل البريتوني تراكم واسعة النطاق معرض للاستسقاء (كما يتضح من انتفاخ البطن)، الخسارة أو الربح من وزن الجسم أكبر من 20٪، والخمول أو غيرها من علامات الضيق، والموت ببطء كل فأر باستخدام ثاني أكسيد الكربون 2 التخدير تليها خلع عنق الرحم.
- قطع الجلد الأمامية على طول خط الوسط بطني من الفأرة، وذلك باستخدام dissectio مدببةن مقص، من أعلى الفخذين إلى أسفل القفص الصدري. العناية القصوى لقطع طريق فقط طبقة الجلد (الشكل 2Bi). فصل بلطف الجلد من أنسجة البريتوني، ويجري التأكد من عدم ثقب الجدار البريتوني.
- باستخدام مقص تشريح مدببة، وقطع أفقيا على حد سواء على طول الجزء السفلي من القفص الصدري والجزء العلوي من الفخذين إلى إنشاء اثنين من اللوحات من الجلد (الشكل 2B الثاني والثالث).
- وضع كل الماوس على جانبها بطني (التجويف البريتوني باتجاه الأسفل) مع اللوحات الجلد سحبت مفتوحة ومسح كل فأر مع أجهزتها في الموقع باستخدام حيوان نظام التصوير الضوئي الصغير (الشكل 3A، B).
- استخدام نفس المعلمات الحصول على الصور كما هو موضح في 2.4.1.-2.4.2.
- يواصل تشريح الماوس عن طريق استخراج أجهزة البريتوني الفردية بما في ذلك الكبد، الثرب / البنكرياس والمعدة والحجاب الحاجز، والأمعاء الدقيقة والأمعاء الغليظة، واليسار والغشاء البريتوني الصحيح، المبايض، kidneيس، مساريق وسادة من الدهون.
- نلاحظ، تعداد، وتسجيل الأورام واضحة على كل جهاز. استخدام الفرجار لقياس قطر كل ورم.
- تعيين الأورام أقل من 2 ملم في القطر صغيرة، في الفترة ما بين 2 و 5 ملم والمتوسطة وأكبر من 5 ملم واسعة كما.
- وضع أجهزة على قالب جهاز المسح الضوئي (الشكل 4) أن يحدد مكان محدد سلفا لكل جهاز. استخدام برنامج تلفزيوني للحفاظ على أجهزة رطبة.
- مسح كل ورقة من الأجهزة باستخدام حيوان نظام التصوير الضوئي صغير (الشكل 3C، D).
- استخدام نفس المعلمات الحصول على الصور كما هو موضح في الخطوة 2.4.
- بعد المسح، وأجهزة مكان في 10٪ الفورمالديهايد لتمكين معالجة لاحقة للالأنسجة.
4. الكمي لعبء الورم في الصور ه الإسفار
- من أجل تقليل كمية من السيارات ومضان في كل عملية مسح متعدد الأطياف، أولا unmix الملفات باستخدام البرمجيات المتاحة مع نظام التصوير الحيوانات الصغيرة.
- تحميل أول طلب تقديم العروض: في ملف الطيفي فيفو، تليها Autofluor: في ملف فيفو الأحمر في نافذة الصور غير المخلوطة وحدد Unmix.
- تصدير ملفات .bip بتنسيق 16 بت و tiff (بلا مقياس).
- استخدام برنامج ImageJ (خارج الجسم الحي الأجهزة وثم جسم الفأر الكامل مع الأجهزة في الموقع).
- استخدام ملف> فتح لفتح ملفات TIFF. 16 بت من ملفات قالب جهاز المسح الضوئي في ImageJ.
- تحت صورة> ضبط> السطوع / التباين، واختيار لتعيين الحد الأدنى عرض القيمة إلى 0 والحد الأقصى لعرض قيمة +35353 ثم تحتصورة> طاولات بحث، حدد أحمر حار. ملاحظة: سوف تتطلب نماذج حيوانية مختلفة مستويات سطوع مختلفة، ولكن من المهم للحفاظ على سطوع متسقة في جميع أنحاء دراسة معينة.
- باستخدام أداة حر الاختيار، رسم المنطقة الحرة شكل من اختيار الفائدة (ROI) حول كل جهاز واستخدام أداة قياس (CTRL + M) لحساب مساحة سطح كل جهاز. تسجيل مساحة سطح كل جهاز في جدول بيانات.
- مع العائد على الاستثمار رسمها حول كل جهاز، انقر على الحق في العائد على الاستثمار وحدد تكرار لتشمل فقط الجهاز.
- في حين يبحث في الجهاز الفردية، تحت صورة> ضبط> العتبة، واختيار لتعيين عتبة الصورة إلى مستوى عتبة أدنى من + 1200 ومستوى العتبة العليا لل+ 1700 لتحديد فقط. tذ المناطق الاستشعاع الأكثر الزاهية والاختيار لتحديد الخلفية الداكنة. اختر موافق. ملاحظة: الصور قد تتطلب التلاعب اليدوي للالمتزلجون عتبة في ImageJ بحيث يتم اختيار سابقا ألمع المناطق للخطوة التحليل، كما هو مبين أعلاه. وسوف تتطلب نماذج مختلفة من المرض القيود عتبة مختلفة، ولكن من المهم للحفاظ على مستويات عتبة متسقة في جميع أنحاء دراسة معينة.
- تحت تحليل> تحليل الجزيئات، تغيير الحجم (بكسل ^ 2) إلى 10 إنفينيتي، واختيار لمشاهدة: الخطوط العريضة، وتحقق لتحديد فقط "عرض النتائج"، وانقر فوق موافق لقياس كل من المناطق والكثافة الخام المتكاملة لهذه المناطق مشرق، الأورام تعتبر.
- تسجيل قيم المساحة السطحية وكثافة الخام المتكاملة من كل اختيار الورم المعروضة في
- تحت تحليل> أدوات> معايرة بار، إضافة إلى شريط على نطاق والمعايرة على الصور من الأجهزة. ملاحظة: في هذا المثال، تم القيام بذلك عن طريق تغيير الموقع إلى أعالي الحق، ولون التعبئة إلى الأسود، واللون التسمية إلى الأبيض، وعدد من تسميات ل5، الأماكن عشري إلى 0، حجم الخط إلى 12 والتكبير عامل إلى 4.0 وتمكين نص بولد.
- ضمن ملف> حفظ باسم ...، حفظ المونتاج باعتباره TIFF.. و. jpeg.
- استخدام ملف> فتح لفتح ملف .JPEG الأجهزة ومن ثم تحت إدراج> مربع نص
- استخدام ملف> فتح لفتح كل ملفات TIFF. 16 بت من مسح كامل الجسم في ImageJ في ترتيب عدد الماوس.
- تحت صورة> ضبط> السطوع / التباين، واختيار لتعيين الحد الأدنى القيمة المعروضة 0 والحد الأقصى لعرض قيمة ل+ 35353 ثم تحت صورة> طاولات بحث، حدد أحمر حار.
- ضمن ملف> حفظ باسم ...، حفظ المونتاج ككل. المشاجرة. و. jpeg.
تحليل 5. البيانات
- إضافة مناطق مختارة الورم وكثافة متكاملة الخام، على التوالي، لكل جهاز من كل فأر وسجل إجمالي مساحة الورم الجهاز لكل الماوس.
- تطبيع المساحة المسجلة وintegrat الخامقيم كثافة إد لحجم كل جهاز من خلال تقسيم منطقة الورم الكلية والخام القيم متكاملة كثافة من مساحة الجهاز المقابلة (الجدول 1).
- حساب ورسم المتوسط في كل من المناطق سطح الورم طبيعية وتطبيع الخام قيم كثافة متكامل (الشكل 5A، B).
- مقارنة هذه القيم المتوسطة لتلك التي حصلت عن طريق عد بصريا الأورام التي كانت مرئية للعين المجردة أثناء عملية التفتيش من كل جهاز للآفات النقيلي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتميز آلية المنتشر من سرطان المبيض بنسبة منتشر للغاية ورم خبيث، داخل البريتوني تتألف من العديد من الآفات متفاوتة الحجم، بما متعددة (<2mm في) الآفات الصغيرة. وهكذا، واستخدام الخلايا السرطانية RFP المسمى (الشكل 1)، والتصوير الضوئي يوفر طريقة بديلة لالعد والفرز اليدوي وقياس حجم الآفة. تطوير عبء الورم مع مرور الوقت يمكن تحديد وزنها أسبوعيا من الفئران وقياس محيط البطن لقياس احتمال وجود استسقاء. ويوفر في الجسم الحي التصوير الضوئي اتباع نهج متكامل لتقييم عبء الورم (الشكل 2). سرطان المبيض مستطير إلى مواقع متعددة في التجويف البريتوني والسائقين الجزيئية من ورم خبيث في مواقع محددة غير معروفة حاليا. بالإضافة إلى تحديد عبء الورم العام والتضحية التالية تشريح دقيق لا يمكن أن يؤديها لتقييم وتحديد سنويا في مواقع محددة tterns من ورم خبيث. وهكذا، والتصوير الضوئي الأجهزة البريتوني في الموقع (الشكل 3A، B) جنبا إلى جنب مع فيفو تقييم الأجهزة الفردية (الشكل 3C، D) يمكن أن توفر بيانات مفيدة عن عموما مقابل عبء الورم جهاز معين. يمسح المعروضة في الشكل (3) وتمثل نتائج مسح تجاويف البطن وأجهزة الفردية من الفئران مع درجات متفاوتة من عبء الورم. على سبيل المثال، الشكل 3C يظهر معظم عبء الورم في الثرب / البنكرياس والمبيض ومسراق ماوس أ عند مقارنة بنفس تلك الأجهزة في الفأر B، ينظر إلى اختلاف كبير في إشارة (الشكل 3D). استخدام قالب جهاز المسح الضوئي (الشكل 4) يساعد في تحديد عبء الورم جهاز معين. وأكد مراقبة عبء الورم الفرق من الناحية الكمية سواء من حيث مساحة الورم وإشارة الورم كثافة (الجدول 1، الشكل 5).
SS = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> وقد تم تحليل النتائج الموضحة في هذه الأرقام والجدول باستخدام الحد الأدنى والحد الأقصى للعرض مجموعة من 0 إلى + 35353 وذلك لتجنب أي إشارات إيجابية كاذبة ومضان السيارات المنبعثة من الأنسجة. درجات متفاوتة من إشارة رأينا في الشكل 2 و 3 لتوضيح مجموعة كبيرة من عبء الورم الذي يمكن تصوير وكميا باستخدام هذا الأسلوب. البيانات الواردة في الجدول 1 توضح هذه مجموعة كبيرة من تطبيق في قياس كل من مساحة الورم وكثافة إشارة للورم. على سبيل المثال، عند النظر في الثرب / البنكرياس من الفأرة مقابل أن الفأر B، مساحة الورم تطبيع هو 26 أضعاف في الفأر والفأر من B. وعلاوة على ذلك، هو إيراد أمثلة على مجموعة كبيرة من شدة إشارة أيضا في الثرب / بنكرياس الفئران ألف وباء؛ وتطبيع كثافة الخام متكاملة من الفأرة هي 56 مرة أكبر من أن الفأر B. هذه النتائج تثبت صحة compariنانوغرام عبء الورم من عدة اختبار تخضع بالنسبة لبعضها البعض، سواء من حيث مساحة الورم وكثافة إشارة الورم، وذلك باستخدام هذه الطريقة السريعة التي لا تحتاج إلى مزيد من التحليل النسيجي.
الشكل 1. خلايا ID8 الفئران سرطان المبيض معاملات طلب تقديم العروض. (أ) صورة المرحلة الخلايا ID8. (ب) صورة مضان من خلايا ID8. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وقد استخدم الشكل 2. التصوير البصري لايف من C56 / BL6 الفأرة مع عبء الورم البينية البريتوني. (A) كريم مزيل الشعر لإزالة هاي ص من السطح البطني للفأرة قبل المسح. (ب) رسم بياني خط الوسط بطني الأولي والشقوق الجانبية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3). نقطة النهاية مسح البينية البريتوني عبء الورم. (A، B) الفئران يتم تصوير لأول مرة مع الأجهزة في الموقع (الجانب أسفل بطني) عقب افتتاح السطح البطني للفأرة. (C، D) التصوير من أجهزة الفردية. يتم تشريح كل جهاز، وعبء الورم المرئية المسجلة، ووضعها في قالب جهاز المسح الضوئي للتحليل.الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. الجهاز الضوئي قالب. وضعت أجهزة تشريح على القالب مسح الجهاز للحفاظ على الهوية الموضعية الأجهزة الفردية خلال المسح الضوئي.
.. وقد تم تحليل الشكل 5. تطبيع البيانات الكمية لالثرب / البنكرياس والمبيض ومساريق البيانات كما هو موضح في البروتوكول وكما هو مبين في الجدول رقم 1 ماوس ويشير إلى الماوس الممسوحة ضوئيا في 3A لوحة. يشير الماوس باء الماوس الممسوحة ضوئيا في 3B لوحة (أ) منطقة الورم تطبيع. أجري تحليل مضان إشارة الكمي لهذه الأجهزة الثلاثة وكميا من حيث نسبةمن مساحة الورم إلى منطقة سطح الجهاز كاملة لكلا الفئران. (ب) تطبيع كثافة متكاملة الخام. وقد أجريت مضان تحليل الإشارات الكمي لهذه الأجهزة الثلاثة وكميا من حيث نسبة كثافة متكاملة الخام إلى منطقة سطح الجهاز كاملة لكلا الفئران.
| الثرب / البنكرياس | |||
| تطبيع منطقة الورم | تطبيع كثافة الخام المتكاملة | ||
| الماوس ل | 0.5346 | 5.11E + 07 | |
| الماوس B | 0.0203 | 8.97E + 05 | |
| المبايض | |||
| تطبيع منطقة الورم | تطبيع كثافة الخام المتكاملة | ||
| الماوس ل | 4.79E + 07 | ||
| الماوس B | 0.0123 | ||
| المساريقا الأغشية التي تغلف الأمعاء | |||
| تطبيع منطقة الورم | تطبيع كثافة الخام المتكاملة | ||
| الماوس ل | 0.2951 | 2.22E + 07 | |
| الماوس B | 0.0098 | 4.15E + 05 | |
الجدول 1. منطقة الورم تطبيع وتطبيع الخامقيم الكثافة المتكاملة في الثرب / البنكرياس والمبيض ومساريق كل من الفأر A و B. ماوس المشاركة تشريح والمسح الضوئي، ومجزأة كل جهاز ومضان لها كميا لتحديد نسبة مساحة الورم إلى المساحة الإجمالية الجهاز وشدة من مضان لهذه المناطق الورم. تم اختيار الثرب / البنكرياس والمبيض ومساريق كما كان لديهم أقوى الإشارات مضان في كل من المجموعات الإيجابية والسلبية السيطرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وعلى النقيض من الدراسات التي تستخدم خلايا سرطان المبيض الإنسان التي يجب أن تجرى في الفئران المناعة، ووصف بروتوكول أعلاه يستخدم مناعيا الفئران C57 / BL6 وخلايا سرطان المبيض الفئران مسانج. في حين أن هذا يمكن تقييم الدور المحتمل للتتسرب المناعة في تطور الورم والانبثاث، وجود الشعر الداكن على سطح البطن يجعل التصوير أقل حساسية. استخدام مزيل الشعر لإزالة الشعر قبل التصوير يعزز الحصول على الصور، ولكن، وخاصة للتجارب التي تتطلب التصوير الطولي تستغرق وقتا طويلا. أصلع الفئران "عارية" يمكن أن تستخدم في هذا البروتوكول ولا تتطلب إزالة الشعر على أساس مزيل الشعر. وعلاوة على ذلك، الفئران عارية تفتقر إلى نظام المناعة يعمل، لذلك يمكن أيضا أن تستخدم لتقييم نمو خلايا سرطان المبيض الإنسان في التجارب حيث المساهمة في الجهاز المناعي ليست قيد التحليل.
كما تجدر الإشارة إلى أن عمق intraperيعرض الأورام itoneal أيضا التحديات التقنية، كما بصري التصوير مضان عموما لن كشف الأورام على أعماق تزيد على 5 مم. وعلاوة على ذلك، فإن انتشار استسقاء السائل وجود الخلايا السرطانية الاستسقاء توفر تعقيدات إضافية. وقد لاحظنا كبير تقلب الماوس إلى ماوس في تكوين السائل الاستسقاء، حتى عندما تم حقنها مع خط الخلية نفسها. وهكذا في وجود استسقاء، وهذه الطريقة هي الأفضل لتحليل نقطة النهاية من عبء الورم جهاز معين بدلا من التصوير الطولي الروتيني للتطور. في الحالة الراهنة، لوحظت تغييرات جذرية في عبء الورم بين المثال الفئران، بحيث أفواج من 4-5 الفئران عادة ما تكون كافية للتحليل الإحصائي. في حالة وجود اختلافات أقل دراماتيكية في عبء الورم، وسوف تكون هناك حاجة الاشخاص الخاضعين للتجارب إضافية للوصول إلى السلطة الإحصائية. بينما توضح الأمثلة الموجودة في هذه الوثيقة تختلف اختلافا كبيرا في حجم الورم، والتصوير مضان البصرية يمكن استخدامها لكشف الفروق أصغر بكثير في عبء الورم جهاز معين، لا سيما بالمقارنة مع، على الوزن أو القياسات الفرجار على الآفات الصغيرة (لا يظهر) .Resolution وسوف حساسية تختلف مع خط الخلية ونظام التصوير. في هذه الحالة، يزرع النقيلي صغيرة مثل 400 ميكرون في القطر يمكن حلها وكميا. وقد وصفت وسائل بديلة بما في ذلك التصوير المقطعي المحوسب على النقيض محسنة (CT) والتصوير بالرنين المغناطيسي (MR)، والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) للتصوير طولية 14،15. طرائق بما في ذلك الجمع بين التصوير التشريحي والوظيفي هي أيضا قيد التطوير 16.
في ما يخص هذه الطريقة المقترحة لتقدير حجم عبء الورم، وتجدر الإشارة إلى أن تحديد عتبات مضان [الخطوة 4.3.5.] ويستند على كثافة مضان ينظر في الصور الجهاز [الخطوة 4.3.2.] ويتم اختيار من قبل المستخدم لتشمل فقط المناطق الأكثر الفلورسنت تعصبإيف لبقية الأعضاء. واستخدمت متفاوتة القيم الحدية في التحليل قبل تحديد قيم العتبة النهائية المستخدمة في هذه الدراسة. مرة واحدة العزم، واستخدمت هذه العتبات نفسها لكل جهاز تحليل ذلك لضمان الاتساق في تقدير حجم ما يعتبر النسيج المنتشر في التحليل البصري الأولي الذي قام به الباحث. تحديد هذه الحدود هو خطوة حاسمة في الإجراء ويحتمل أن تكون قد تختلف من مشروع إلى آخر وفقا لما يحدده الباحث الفردية. في هذه الحالة، تم استخدام أقل عتبة كبيرة وذلك لالتقاط فقط أعلى إشارات كثافة مضان. باستخدام هذا نفس العتبة لكل جهاز تحليل، والتحليل والنتائج تقدم النتائج الكمية النسبية في إطار هذه المجموعة من الفئران. في حين أن هذا الأسلوب يقتصر في تقدير القيم المطلقة من مساحة الورم، فإنه يسمح للباحثين القدرة على المقارنة بين النسبي عبء الورم تطبيع بين نفسهالثانية الأجهزة المختلفة ضمن أفواج من الفئران. وتجدر الإشارة إلى أن هذا النهج يشمل تقدير حجم الأورام التي تكون غير مرئية للعين المجردة.
آلية النقيلي فريدة من النتائج EOC في داء سرطاني منتشر داخل الصفاق نطاق واسع تشمل الأنسجة والأعضاء متعددة، مما يجعل عملية جراحية cytoreductive الأمثل تحديا من الناحية التقنية. كما cytoreduction الكامل يرتبط بشكل إيجابي مع البقاء على قيد الحياة، ويترتب على ذلك وضع استراتيجيات علاجية جديدة لمكافحة ما يبرره الانبثاث داخل البريتوني. تقييم الكفاءة العلاجية، ومع ذلك، يعتمد على الكميات دقيقة من عبء الورم، بما في ذلك تقييم الانبثاث-جهاز معين. باستخدام التصوير الضوئي الخلايا السرطانية الموسومة طلب تقديم العروض في الموقع تصحيح للتألق ذاتي الجهاز، جنبا إلى جنب مع الدقيق خارج الجسم الحي جهاز التصوير، وقد وضعنا نهجا لتحديد داخل الصفاق عبء الورم جهاز معين. ومن المثير للاهتمام، وتشير تحليلاتناأن المواقع المفضلة من ورم خبيث في هذا النموذج، كما هو محدد من قبل الورم منطقة عبء / سطح، مماثلة لتلك التي وجدت في النساء المصابات بسرطان المبيض (الثرب، المبيض، الأمعاء، مساريق) 2،4،5. لذلك يجب أن يكون هذا النهج فائدة في المستقبل في تقييم العلاجات التجريبية تهدف إلى استهداف المرض المنتشر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
هذه المقالة هي جزء من عدد خاص عن التصوير المتعدد الوسائط ما قبل السريرية، برعاية بروكر BIOSPIN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning | 10-014-CM | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437-028 | |
| penicillin/streptomycin | |||
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I-1884 | |
| Bruker Xtreme small animal imaging system | Bruker Corp. | ||
| Bruker Multispectral software | Bruker Corp | ||
| lentiviral particles with Red fluorescent protein | GenTarget, Inc. | LVP023 | |
| trypsin for cell culture | Corning | 25-053-CI | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion) | purchases from drugstore | n/a | |
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | free download | |
| dissecting tools (forceps) | Roboz Surgical Instrument | RS 5130 | |
| dissecting tools (Scissors) | Roboz Surgical Instrument | RS 5910 |
References
- American Cancer Society. , Available from: http://www.cancer.org/cancer/ovariancancer/overviewguide/ovarian-cancer-overview-key-statistics (2015).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
- Halkia, E., Spiliotis, J., Sugarbaker, P. Diagnosis and management of peritoneal metastases from ovarian cancer. Gastroenterology Research and Practice. 2012, 541842-541854 (2012).
- Barbolina, M. V., et al. Microenvironmental regulation of ovarian cancer metastasis. Cancer Treatment and Research. 149, 319-334 (2009).
- Lengyel, E., et al. Epithelial ovarian cancer experimental models. Oncogene. 33 (28), 3619-3633 (2014).
- Harter, P., duBois, A. The role of surgery in ovarian cancer with special emphasis on cytoreductive surgery for recurrence. Current Opinion in Oncology. 17 (5), 505-514 (2005).
- Bristow, R. E., Puri, I., Chi, D. S. Cytoreductive surgery for recurrent ovarian cancer: a meta-analysis. Gynecologic Oncology. 112 (1), 265-274 (2009).
- Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death and Differentiation. 9, 786-789 (2002).
- Sweeney, T. J., et al. Visualizing the kinetics of tumor-cell clearance in living animals. Proceedings of the National Academy of Science USA. 96, 12044-12049 (1999).
- Chishima, T., et al. Cancer invasion and micrometastasis visualized in live tissue by green fluorescent protein expression. Cancer Research. 57, 2042-2047 (1997).
- Bouvet, M., et al. Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model. Cancer Research. 62, 1534-1540 (2002).
- Hoffman, R. M. The Multiples Uses of Fluorescent Proteins to Visualize Cancer in vivo. Nature Reviews. 5, 796-806 (2005).
- Roby, K. F., et al. Development of a syngeneic mouse model for events related to ovarian cancer. Carcinogenesis. 21 (4), 585-591 (2000).
- Rampurwala, M., Ravoori, M. K., Wei, W., Johnson, V. E., Vikram, R., Kundra, V. Visualization and quantification of intraperitoneal tumors by in vivo computed tomography using negative contrast enhancement strategy in a mouse model of ovarian cancer. Translational Oncology. 2 (2), 96-106 (2009).
- Kim, T. J., et al. Antitumor and antivascular effects of AVE8062 in ovarian carcinoma. Cancer Research. 67, 9337-9345 (2007).
- Picchio, M., et al. Advanced ovarian carcinoma: usefulness of [(18)F]FDG-PET in combination with CT for lesion detection after primary treatment. Quarterly Journal of Nuclear Medicine. 47, 77-84 (2003).
