Introduction
Epithelialen Ovarialkarzinom (EOC) ist die häufigste Todesursache von gynäkologischen Krebserkrankung, mit einem geschätzten 21.290 Neuerkrankungen in den USA im Jahr 2015 und schätzungsweise 14.180 Todesfälle 1. Die überwiegende Mehrheit (> 75%) der Frauen mit Spätstadium der Krankheit diagnostiziert (Stadium III oder IV) durch diffuse Intraperitonealtest Metastasierung und schlechter Prognose charakterisiert. Wiederauftreten der Krankheit in der Bauchhöhle folgenden First-Line - Chemotherapie ist auch üblich , und stellt eine der Hauptursachen für die Sterblichkeit 2,3. EOC metastasiert durch einen einzigartigen Mechanismus sowohl direkte Verlängerung aus dem Primärtumor zu benachbarten Peritonealdialyse Organe sowie durch die Dissoziation oder vergießen von Zellen aus der primären Tumoroberfläche als einzelne Zellen oder mehrzelligen Aggregate beteiligt sind. Die Zellen werden in die Bauchhöhle Schuppen, wobei sie Ablösung induzierte Apoptose 4 widerstehen. Anhaftungen von Peritonealdialyse Aszites ist weit verbreitet, wie Schuppen Tumorzellen Peritonealdialyse Lymphdrainage und t blockierenumors produzieren Wachstumsfaktoren, die die vaskuläre Permeabilität zu verändern. Ein Teil der Schuppen Tumorzellen heften sich an die Oberfläche von Peritoneal Organe und Strukturen , einschließlich Darm, Leber, Omentum und Mesenterium, woraufhin sie mehrere weit verbreitet Sekundärläsionen 3,5 herzustellen verankern und sich vermehren. Hämatogener Metastasierung ist selten. So klinische Management besteht üblicherweise aus onkologischer Chirurgie einschließlich "optimalen debulking", definiert als Resektion aller sichtbaren Tumors (egal wie klein). Komplette Zytoreduktion ist mit einem deutlichen Anstieg der Gesamtüberlebenszeit 6,7 zugeordnet und mit der Herausforderung der Identifizierung und Beseitigung von Läsionen <0,5 cm verbunden.
als auch bei der Identifizierung von prognostischer Biomarker und Erprobung neuer Chemotherapien oder Kombinationstherapie Ansätze Kleintiermodellen haben Nutzen bei Ovarialkarzinom Forschung bewiesen in unserem Verständnis der Krankheitsprogression zu verbessern. Als primäreWebsite von Eierstockkrebsinzidenz und Metastasierung ist die Bauchhöhle, orthotopen Modelle von EOC Metastasierung die Analyse und Charakterisierung von intraperitoneale Krankheit betreffen. Obwohl es in der Fähigkeit, Bildtumorzellen jüngsten Verbesserungen gewesen, auch auf Einzelzellebene, gibt es immer noch erhebliche Schwierigkeiten in der metastasierten Tumorbelastung von EOC zu quantifizieren. Diese Herausforderungen entstehen durch die Anzahl, Größe und anatomische Lage der Metastasen. Weiterhin besteht ein Bedarf nach Etikettenkrebszellen, um sie von normalen Wirtszellen zu unterscheiden. Frühere Studien haben Antikörper-basierten Markierungsprotokolle oder Transfektion von Tumorzellen mit Luciferase 8,9 verwendet. Direkte Fluoreszenzmarkierung von Krebszellen wurde erstmals 1997 von 10 Chishima und Mitarbeitern berichtet. Fluoreszierende Markierungen erfordern keine Zugabe von exogenem Substrat und liefern vorzügliches Tumorzellspezifität, bieten ein wirksameres Mittel Krebsmetastase 11,12 verfolgen
Wir beschreiben hier eine optische Bildgebungsverfahren für die quantitative Analyse von Metastasen eine syngene orthotoper Xenograftmodell von rot fluoreszierendes Protein (RFP) umfasste mit -markierte murine ID8 Ovarkrebszellen 13 und immunkompetenten C57 / BL6 - Mäusen. Wir zeigen , ein neues Verfahren der relativen Quantifizierung der Tumorlast in vivo Vereinigen und ex vivo - Bildgebung mit Entfernung von Gewebe Autofluoreszenz. Dieser Ansatz hat einen potentiellen Nutzen in Studien entwickelt, um die Wirkung von spezifischen genetischen, epigenetischen oder Mikroumweltänderungen und / oder Behandlungsmethoden für organspezifische Metastasierung des Ovarialkarzinoms zu bewerten.
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Protocol
Alle in - vivo - Studien wurden von der University of Notre Dame Animal Care und Use Committee und verwendet weiblichen C57 / BL6J Mäuse zugelassen.
1. Murine Ovarian Cancer Cell Culture
- Machen das ID8 murine Eierstockkrebszellkulturmedium wie folgt: 1 L von Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), supplementiert mit 4% fötalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin / Streptomycin, 5 ug / ml Insulin, 5 ug / ml Transferrin und 5 ng / ml Natriumselenit.
- Unter Verwendung von kommerziell beschafft lentivirale Partikel exprimieren , RFP und einen Selektionsmarker (Blasticidin - Gen) transduzieren ID8 murine Ovarkrebszellen 13 bis rot fluoreszierendes Protein (RFP) exprimieren. Beachten Sie, dass grün fluoreszierendes Protein verwendet werden kann, bietet aber eine schwächere Fluoreszenzsignal.
- Unmittelbar vor der Transduktion, Kulturzellen zu 50-70% Konfluenz und fügen Sie frisches Medium (ohne Penicillin / Streptomycin), die 1 ml Polybren enthält (5 ug / ml finalKonzentration).
- Gently Pipette RFP-Lentivirus (20 ul) tropfenweise in die Schale und für 72 Stunden bei 37 ° C inkubiert. Entfernen Sie Medium und Inkubation mit frischem Medium für 24 Stunden. Beginnen Selektion von transduzierten Zellen durch Blasticidin zum Kulturmedium Zugabe von (5 & mgr; g / ml) und Monitor für rote Zellen unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 1 ).
- Kultur die RFP-markierten Zellen in ID8 Medium um etwa 10 6 Zellen in eine Gewebekulturschale Säen und Visualisierung täglich mit einem Lichtmikroskop , bis die Zellschicht konfluent ist.
- Wenn konfluent, ernten die Zellen unter Verwendung von Trypsin (0,25%, 3 min) und zurück den Kolben an die C - Inkubator 37 o , bis die Zellen abgelöst werden.
- Neutralisieren des Trypsins mit 6 ml ID8 Kulturmedium, das Serum. Pipette nach oben und unten gegen den Boden der Schale, dann Transfer zu einem 15 ml konischen Röhrchen. Zentrifuge bei 1200 UpM für 2 Minuten absaugen dann das Medium mit einem glass Pipette.
- Waschen Sie die Zellen mit Phosphat-gepufferte Saline (PBS), indem Sie vorsichtig in 6 ml warmem PBS Resuspendieren und Zentrifugieren wie in 1.5 oben. In PBS auf eine Endkonzentration von 5 x 10 6 Zellen / ml resuspendieren. Halten Zellen warm (37 ° C) bis zur Injektion.
2. intraperitoneale Injektion von ID8 Zellen und in - vivo - Bildgebung
- Injizieren jeder Maus mit 2 ml des warmen ID8-PBS-Lösung für insgesamt 10 Millionen Zellen durch intraperitoneale (ip) Injektion. Lassen Tumorzellen für ca. 10 Wochen mit wöchentlichen Live - Bildgebung in vivo zu wachsen.
- Unmittelbar nach der Injektion und jede Woche danach die Mäuse wiegen und dann betäuben jede Maus Isofluran (2,5% Durchfluss in 0,5 l / min O 2 Flow) verwendet wird . Anmerkung: Die Mäuse wurden gewogen, nicht als ein quantitatives Maß der Tumorlast, sondern eine allgemeinere Maß der einzelnen Maus physikalischen Progression während der Studie. Mäuse wiegents wurden mit ihrem eigenen früheren Gewichtswerten verglichen.
- Anesthetize Mäuse durch in einer Isofluran Kammer platzieren. Pflegen konstante Anästhesie während des Scannens durch die Positionierung der Maus den Kopf in den Nasenkegel für die Belichtung mit 2,5% Flussrate Isofluran während des gesamten Verfahrens.
- Verwenden Sie Enthaarungscreme die Haare auf dem Oberkörper und Bauch jeder Maus zu entfernen, da das schwarze Haar Abschwächung des Fluoreszenzsignals verursacht. Mäuse werden mit warmem Wasser nach dem Aufbringen der Enthaarungscreme gewaschen und mit RT Papiertüchern getaucht.
- Während anästhesiert, scannen Sie den gesamten Körper jeder Maus ein kleines Tier optische Abbildungssystem verwendet wird. Scannen Sie alle Mäuse in einer Kohorte zu jedem Zeitpunkt. Verwenden Sie die folgenden zwei Schritt - Protokoll (2A):
- fluoreszenzmarkierten (RFP) Tumorzellen in Schritt 1 zu beobachten, führen Multispektraldaten Erwerb insgesamt 5 Bilder Filter mit Anregung von 440 nm zu sammeln, 460 nm, 480 nm, 520 nm und 540 nm und einem Emissionsfilter von 600 nm. Verwenden Sie die folgenden Erfassungsparameter: eine Standardbelichtung von 15 Sekunden, 2 x 2 - Binning, FOV von 160 mm und f Stopp von 1,1.
- In Schritt 2 das ganze Tier zu beobachten, ein Reflexionsbild unter Verwendung eines offenen Anregungsfilter (weißes Licht), ein offenes Emissionsfilter, eine Standardbelichtung von 0,2 sec mit 2 x 2-Binning und ein FOV von 16 cm erwerben. Hinweis: Die tatsächliche Aufnahmezeit ist ~ 1 min.
3. Maus Dissection und Image Acquisition
- Wenn die Live - Darstellung das Vorhandensein von umfangreichen Intraperitonealtest Krankheit oder Tiere zeigen Akkumulation von Aszites zeigt (wie von Blähungen belegt), Verlust oder Gewinn an Körpergewicht von mehr als 20%, Lethargie oder andere Anzeichen von Leiden, einschläfern jede Maus mit CO 2 Narkose durch zervikale Dislokation gefolgt.
- Schneiden Sie die Haut nach vorne entlang der ventralen Mittellinie der Maus, mit einer Spitz DISSECTIOn Schere, von der Oberseite der Oberschenkel an der Unterseite des Brustkorbs. Größte Vorsicht walten lassen nur die Hautschicht zu durchschneiden (Abbildung 2Bi). Vorsichtig trennen die Haut von Peritonealgewebe, sicher die Bauchwand nicht durchstoßen zu sein.
- Mit einer Spitz Dissektion Schere, geschnitten seitlich sowohl entlang der Unterseite des Brustkorbs und der Oberseite der Oberschenkel zu schaffen zwei Hautlappen (2B ii, iii).
- Platzieren Sie jede Maus auf ihrer Bauchseite (Bauchhöhle nach unten gerichtet) mit den Hautlappen aufgerissen und scannen jede Maus mit ihren Organen in situ unter Verwendung des Kleintier optische Abbildungssystem (3A, B).
- Verwenden Sie die gleichen Bildaufnahmeparameter wie in 2.4.1.-2.4.2 beschrieben.
- Halten Sie die Maus Sezieren durch Extrahieren einzelner Peritonealdialyse Organe, einschließlich Leber, omentum / Bauchspeicheldrüse, Magen, Zwerchfell, Dünndarm, Dickdarm, links und rechts Peritoneum, Ovarien, kidneys, Gekröse und Fettpolster.
- Beachten Sie, aufzuzählen, und sichtbare Tumoren an jedem Organ aufzunehmen. Verwenden eine Dicke, den Durchmesser jedes Tumors zu messen.
- Bezeichnen Tumoren weniger als 2 mm im Durchmesser so klein, zwischen 2 und 5 mm als Medium und größer als 5 mm so groß.
- Platzieren Sie die Organe auf der organ Scanvorlage (4) , die eine vorbestimmte Position für jedes Organ identifiziert. Verwenden Sie PBS die Organe feucht zu halten.
- Scannen Sie jedes Blatt von Organen das kleine Tier optische Abbildungssystem (3C, D).
- Verwenden Sie die gleichen Bildaufnahmeparameter wie in Schritt 2.4 beschrieben.
- Nach dem Scannen Platz Organe in 10% Formaldehyd nachfolgende Verarbeitung für die Histologie zu ermöglichen.
4. Quantifizierung der Tumorlast in the Fluoreszenzbilder
- Um die Menge der Autofluoreszenz in jedem Multispektraldaten Scan zu reduzieren, entmischen zuerst die Dateien Software zur Verfügung, mit dem Kleintierbildgebung System.
- Laden Sie zuerst das RFP: In - vivo - Spektral-Datei, gefolgt von der Autofluor: In Vivo Red - Datei im Unmixed Images Fenster und wählen Sie entmischen.
- Exportieren Sie die .bip-Dateien als 16-Bit-Tiff (unskaliert) Format.
- Verwenden Sie ImageJ Software (ex vivo Organe und dann die volle Maus Körper mit Organen in situ).
- Verwenden Sie Datei> Öffnen Sie die 16 - Bit - TIFF - Dateien der Organscanvorlagendateien in ImageJ zu öffnen.
- Unter Bild> Anpassen> Helligkeit / Kontrast, wählen Sie den Minimalwert angezeigt auf 0 zu setzen und die maximal angezeigte Wert auf 35.353 und dann unterBild> Lookup - Tabellen, wählen Sie Red Hot. Hinweis: Verschiedene Tiermodelle werden verschiedene Helligkeitsstufen erfordern, aber es ist wichtig, um die Helligkeit übereinstimmend.Alle einer gegebenen Studie zu halten.
- Mit dem Freihand - Auswahl - Werkzeug zeichnen Sie eine Region Freiform von Interesse Auswahl (ROI) um jedes Organ und verwenden Sie das Messwerkzeug (STRG + M) , um die Oberfläche des jeweiligen Organs zu berechnen; notieren Sie die Oberfläche jedes Organ in einer Tabelle.
- Mit der ROI um jedes Organ gezeichnet, klicken Sie rechts in der ROI Duplikate und wählen Sie nur die Orgel aufzunehmen.
- Während bei den einzelnen Organ suchen, unter Bild> Anpassen> Schwellenwert, wählen Sie auf einen niedrigeren Schwellenwert von + 1200 und einem oberen Schwellenwert von + 1700 die Schwelle des Bildes zu setzen onl zu wähleny die meisten hell fluoreszieren Regionen und überprüfen dunklen Hintergrund zu wählen; wählen Sie OK. Hinweis: Die Bilder manuelle Manipulation der Schwellen Schiebern in ImageJ erfordern kann, so daß die zuvor hellsten Bereiche für den Analyseschritt ausgewählt sind, wie oben gezeigt. Verschiedene Krankheitsmodelle werden unterschiedliche Schwelleneinschränkungen erfordern, aber es ist wichtig, dass die Schwellenwerte im Einklang während einer bestimmten Studie zu halten.
- Unter Analysieren> Partikel analysieren, ändern Sie die Größe (Pixel ^ 2) bis 10-Unendlichkeit, wählen zu zeigen: Outlines, überprüfen nur "Ergebnis anzeigen" auszuwählen , und klicken Sie auf OK sowohl die Bereiche und rohen integrierten Dichten dieser hellen Bereichen zu messen, als Tumoren.
- Notieren Sie sich die Werte der Oberfläche und die Raw Integrierte Dichte jeder Auswahl Tumor in der angezeigten
- Unter Analysieren> Tools> Kalibrierung Bar, eine Kalibrierungsskala bar auf die Bilder der Organe hinzufügen. Hinweis: In diesem Beispiel wurde dies durch eine Änderung der Lage nach oben rechts, die Füllfarbe auf Schwarz, die Farbe des Labels auf Weiß, die Anzahl der Etiketten bis 5, die Dezimalstellen auf 0, um die Schriftgröße 12 und der Zoom gemacht Faktor 4,0 und ermöglicht Bold Text.
- Unter Datei> Speichern unter ..., speichern Sie die Montage als Tiff und .Jpeg.
- Verwenden Sie Datei> Öffnen Sie die JPEG - Datei der Organe zu öffnen und dann unter Einfügen> Textfeld
- Verwenden Sie Datei> Öffnen jedes der 16 Bit zu öffnen TIFF - Dateien der Ganzkörper - Scans in ImageJ in der Reihenfolge der Maus Nummer.
- Unter Bild> Anpassen> Helligkeit / Kontrast, wählen Sie das Minimum, angezeigte Wert auf 0 und der maximale Anzeigewert + 35353 und dann unter Bild> Lookup - Tabellen, wählen Sie Red Hot.
- Unter Datei> Speichern unter ..., speichern Sie die Montage als a. Tiff und .Jpeg.
5. Datenanalyse
- Fügen Sie die Tumorauswahlbereiche und rohen integrierten Dichten jeweils für jedes Organ jeder Maus und notieren Sie die Gesamtfläche Organtumor für jede Maus.
- Normalisieren der aufgezeichneten Bereich und rohe integrated Dichtewerte für die Größe des jeweiligen Organs durch den gesamten Tumor und Gesamt roh integrierte Dichtewerte dividiert durch die entsprechende Organoberfläche (Tabelle 1).
- Berechnen und zeichnen Sie den Mittelwert der beiden normalisierte Tumoroberflächenbereiche und die normalisierte Roh integrierte Dichtewerte (5A, B).
- Vergleichen dieser Mittelwerte zu denjenigen erhalten durch visuelles Zählen der Tumoren, die während der Inspektion jedes Organ für metastatischen Läsionen mit dem bloßen Auge sichtbar waren.
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Representative Results
Der metastasierendem Mechanismus des Ovarialkarzinoms durch hochdiffusem Intraperitonealtest Metastasierung gekennzeichnet, bestehend aus zahlreichen Läsionen unterschiedlicher Größe, darunter mehrere kleine (<2 mm) Läsionen. Somit ist die Verwendung von RFP-markierten Tumorzellen (Abbildung 1) und optische Bildgebung stellt eine alternative Methode zur manuellen Zählung und Messung der Größe der Läsion. Die Entwicklung von Tumorbelastung im Laufe der Zeit kann der Mäuse und die Messung der Bauchumfang von wöchentlich bestimmt werden , mit einem Gewicht von möglichen Vorhandensein von Aszites zu messen. In vivo optische Bildgebung liefert einen komplementären Ansatz der Tumorlast (Abbildung 2) zu beurteilen. Eierstockkrebs metastasiert auf mehrere Standorte in der Bauchhöhle und molekularen Treiber von ortsspezifischen Metastasierung sind derzeit nicht bekannt. Neben der Ermittlung des Gesamttumorlast, nach der Tötung sorgfältige Präparation durchgeführt werden ortsspezifische pa zu bewerten und zu quantifizierentterns der Metastasierung. Somit optische Abbildungs peritonealer Organe in situ (3A, B) in Kombination mit ex vivo Beurteilung der einzelnen Organe (3C, D) können nützliche Daten über den Gesamt vs organspezifischen Tumorlast bereitzustellen. Die Scans dargestellt in Abbildung 3 stellen die Ergebnisse des Abtastens der Bauchhöhle und einzelne Organe von Mäusen mit variierenden Grad der Tumorlast. Beispielsweise zeigt 3C die meisten Tumorbelastung in Omentum / Pankreas, der Eierstöcke und Mesenterium von Maus A. Im Vergleich zu den gleichen Organen in Maus - B, ein signifikanter Unterschied in Signal gesehen (Figur 3D). Die Verwendung der organ Scanvorlage (4) hilft bei der Identifizierung von organspezifischen Tumorlast. Die Beobachtung der Differentialtumorbelastung quantitativ sowohl hinsichtlich der Tumorfläche und Tumorsignalintensität (Tabelle 1, Abbildung 5) bestätigt.
Figur 2 zu sehen und 3 veranschaulichen die Vielzahl von Tumorbelastung , die abgebildet werden kann und quantifiziert unter Verwendung dieses Verfahrens. Die Daten in Tabelle 1 veranschaulicht diesen großen Bereich der Anwendbarkeit sowohl in Tumorfläche und die Signalintensität des Tumors zu quantifizieren. Wenn beispielsweise im Omentum / Pankreas von Maus-A im Vergleich zu dem Maus-B, die normierte Tumor-Oberfläche beträgt 26 mal größer in Maus-A aus als Ferner Maus B., der große Bereich der Signalintensität auch im Omentum ist beispiels / Pankreas von Mäusen A und B; die normalisierte Roh integrierte Dichte von Maus-A ist 56-mal größer als die der Maus B. Diese Ergebnisse die Gültigkeit der Compari demonstrierendie Tumorlast mehrerer Test ng Themen relativ zueinander, sowohl in Bezug auf Tumor Oberfläche und Tumorsignalintensität, diese schnelle Methode, die nicht weiter histologische Analyse erfordert.
Abbildung 1. ID8 Murine Ovarkrebszellen Express RFP. (A) Phase Bild von ID8 - Zellen. (B) Fluoreszenzbild von ID8 Zellen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Live - Optical Imaging von C56 / Bl6 Maus mit intraperitoneale Tumorlast. (A) Enthaarungscreme wurde verwendet , hai zu entfernen r von der Bauchseite der Maus vor dem Scannen. (B) Diagramm anfängliche ventralen Mittellinie und seitliche Einschnitte zeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Endpoint - Scanning von intraperitoneale Tumorlast. (A, B) Mäuse werden zunächst mit Organen in situ (Bauchseite nach unten) nach dem Öffnen der Bauchseite der Maus. (C, D) Imaging einzelner Organe abgebildet. Jedes Organ wird seziert, visual Tumorbelastung aufgezeichnet und auf dem Organ Scanvorlage zur Analyse gegeben.target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
4. Organ Scanning - Vorlage Abbildung. Dissected Organe werden auf der Orgel Scanvorlage platziert Positions Identifizierung einzelner Organe während des Scannens aufrechtzuerhalten.
.. Abbildung 5. Normalized Quantitative Daten für das Omentum / Pancreas, Ovarien und Mesentery Daten analysiert wurden , wie in Protokoll beschrieben und wie in Tabelle 1 gezeigt Maus A bezieht sich auf die Maus in das Panel 3A abgetastet wird ; Maus - B bezieht sich auf die Maus in das Panel 3B gescannt. (A) Normalized Tumorbereich. Fluoreszenzsignal Quantifizierung Analyse dieser drei Organe wurde in Form eines Verhältnisses durchgeführt und quantifiziertder Tumoroberfläche auf ganze Organoberfläche für beide Mäuse. (B) normalisierten Roh integrierte Dichte. Fluoreszenzsignal Quantifizierungsanalyse dieser drei Organe wurde in Bezug auf ein Verhältnis von rohem integrierten Dichte ganze Organoberflächenbereich für beide Mäusen durchgeführt und quantifiziert.
| Omentum / Pancreas | |||
| Normierte Tumorfläche | Normalisierten Roh Integrierte Dichte | ||
| Maus A | 0,5346 | 5.11E + 07 | |
| Maus - B | 0,0203 | 8.97E + 05 | |
| Ovarien | |||
| Normierte Tumorfläche | Normalisierten Roh Integrierte Dichte | ||
| Maus A | 4.79E + 07 | ||
| Maus - B | 0,0123 | ||
| Gekröse | |||
| Normierte Tumorfläche | Normalisierten Roh Integrierte Dichte | ||
| Maus A | 0,2951 | 2.22E + 07 | |
| Maus - B | 0,0098 | 4.15E + 05 | |
Tabelle 1. Normalized Tumorfläche und normalisierten RohIntegrierte Dichtewerte im Omentum / Pancreas, Ovarien und Mesentery sowohl Maus A und Maus B. Pfosten Dissektion und Scannen wurde jedes Organ segmentiert und seine Fluoreszenz der Anteil der Tumorbereich zu Gesamtorganoberfläche und die Intensitäten der zur Bestimmung quantifiziert Fluoreszenz für diese Tumorarealen. Omentum / Pankreas, der Eierstöcke und Mesenteriums wurden ausgewählt, da sie die stärksten Fluoreszenzsignale in sowohl der positiven und negativen Kontrollgruppen hatten.
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Discussion
Im Gegensatz zu Studien mit menschlichen Eierstockkrebszellen verwendet, die bei immunsupprimierten Mäusen durchgeführt werden müssen, beschrieben das Protokoll nutzt oben immunokompetente C57 / BL6-Mäusen und syngenen Maus Eierstockkrebszellen. Während diese Einschätzung der möglichen Rolle von Immun Infiltrate in der Tumorprogression und Metastasierung ermöglicht, macht das Vorhandensein von dunklen Haaren auf der Bauchoberfläche Bildgebung weniger empfindlich. Verwendung eines Haarentfernungs Haare vor der Bilderzeugung verbessert die Bildaufnahme zu entfernen, ist jedoch zeitaufwendig, insbesondere für Experimente erfordern Längs Bildgebung. Hairless 'nackten' Mäuse können in diesem Protokoll verwendet werden und erfordern keine Enthaarungsmittel basierte Haarentfernung. Weiterhin Nacktmäusen fehlt ein funktionierendes Immunsystem, so kann auch das Wachstum von menschlichen Eierstockkrebszellen in Experimenten zur Beurteilung verwendet werden, wobei der Beitrag des Immunsystems nicht unter Analyse ist.
Es sollte auch, dass die Tiefe der intraper bemerkt werden,itoneal Tumoren stellt auch technische Herausforderungen, als optische Fluoreszenzbildgebung in der Regel nicht Tumoren in einer Tiefe mm größer als 5 zu erkennen. Darüber hinaus bieten die Prävalenz von Ascitesflüssigkeit und das Vorhandensein von Aszites-Tumorzellen zusätzliche Komplikationen. Wir haben bei der Bildung von Ascitesflüssigkeit signifikante Maus zu Maus Variabilität beobachtet, selbst wenn sie mit der gleichen Zelllinie injiziert. Also in Gegenwart von Aszites, ist dieses Verfahren bevorzugt, Endpunktanalyse der organspezifischen Tumorlast anstatt Routine Längsabbildungsprogressions. Im aktuellen Fall, dramatische Veränderungen in Tumorbelastung wurden zwischen den beispielsweise Mäusen festgestellt, so dass Kohorten von vier bis fünf Mäuse wird in der Regel für die statistische Analyse ausreichen. Im Falle von weniger dramatische Unterschiede in der Tumorlast, werden zusätzliche Versuchspersonen benötigt werden statistische Aussagekraft zu erreichen. Während die hierin deutlich in Tumorvolumen, optische Fluoreszenzabbildung gezeigten Beispielen unterscheiden können verwendet werden,viel kleinere Unterschiede in organspezifischer Tumorlast erkennen, insbesondere im Vergleich zu Gewicht- oder caliper basierten Messungen an kleinen Läsionen (nicht gezeigt) .Resolution und Empfindlichkeit mit Zelllinie und Abbildungssystem variieren. Im vorliegenden Fall kann metastatic Implantate so klein wie 400 & mgr; m im Durchmesser aufgelöst und quantifiziert werden. Alternative Methoden , einschließlich kontrastverstärkten Computertomographie (CT), Magnetresonanz (MR) -Abbildung und Positronen - Emissions - Tomographie (PET) wurden zur Längsabbildungs 14,15 beschrieben. Modalities kombinierte anatomische und funktionelle Bildgebung einschließlich sind ebenfalls in der Entwicklung 16.
In Bezug auf dieses vorgeschlagene Verfahren zur Quantifizierung der Tumorlast, ist zu beachten, dass die Bestimmung der Fluoreszenzschwellenwerte [Schritt 4.3.5.] Auf der Intensität der Fluoreszenz in den Bildern zu sehen organ basiert [Schritt 4.3.2.] und wird durch den Benutzer gewählt, um nur die meisten fluoreszierenden Bereiche relative auf den Rest des Organs. Variierende Schwellenwerte wurden in der Analyse verwendet, bevor die endgültigen Schwellenwerte in dieser Studie verwendet bestimmen. Sobald sie bestimmt wurden diese gleichen Schwellenwerte für jedes Organ verwendet analysiert, um Konsistenz bei der Quantifizierung von zu gewährleisten, was durch den Forscher getan metastatischen Gewebe durch die anfängliche visuelle Analyse erachtet wird. Die Bestimmung dieser Schwellenwerte ist ein kritischer Schritt in dem Verfahren und möglicherweise von einem Projekt zum anderen durch die einzelnen Forscher ermittelten variieren. In diesem Fall wurde eine große untere Schwelle verwendet, um nur die höchste Intensitätsfluoreszenzsignale zu erfassen. Durch die Verwendung dieser gleichen Schwellenwert für jedes Organ analysiert, bieten die Analyse und die Ergebnisse vergleichende quantitative Ergebnisse im Rahmen dieser Gruppe von Mäusen. Während dieses Verfahren bei der Quantifizierung der absoluten Werte der Tumorfläche begrenzt ist, ermöglicht es die Fähigkeit Forscher relativen normalisierten Tumorlast unter den gleichen a vergleichen,nd verschiedenen Organen innerhalb Kohorten von Mäusen. Es sollte beachtet werden, dass dieser Ansatz die Quantifizierung von Tumoren enthält, die nicht mit bloßem Auge.
Der einzigartige metastasierendem Mechanismus der EOC Ergebnisse in weit intraperitoneale Karzinomatose verbreitet mehreren Geweben und Organen beteiligt, wodurch eine optimale onkologischer Chirurgie technisch anspruchsvoll. Als komplette Zytoreduktion positiv mit Gesamtüberleben korreliert, so folgt, dass die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien intraperitonealen Metastasierung zu bekämpfen gerechtfertigt ist. Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit ist jedoch abhängig von der genauen Quantifizierung der Tumorlast, einschließlich der Bewertung der organspezifische Metastasierung. Mit Hilfe der optischen Bildgebung von RFP-markierten Tumorzellen in situ für Orgel Autofluoreszenz korrigiert, kombiniert mit einer sorgfältigen Ex - vivo - Organ - Bildgebung, haben wir einen Ansatz entwickelt , um intraperitoneale organspezifischen Tumorlast zu quantifizieren. Interessanterweise zeigen unsere Analysendass bevorzugte Stellen von Metastasen in diesem Modell, wie von Tumorlast / Fläche definiert, sind ähnlich denen bei Frauen mit Eierstockkrebs (Omentum, Eierstock-, Darm-, Mesenterium) 2,4,5 gefunden. Daher sollte dieser Ansatz bei der Bewertung der experimentellen Therapie Zukunft Nutzen haben entworfen metastasierten Erkrankung zum Ziel.
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Disclosures
Dieser Artikel ist Teil einer Sonderausgabe über Multimodal Pre-Clinical Imaging, gesponsert von Bruker Biospin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning | 10-014-CM | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437-028 | |
| penicillin/streptomycin | |||
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I-1884 | |
| Bruker Xtreme small animal imaging system | Bruker Corp. | ||
| Bruker Multispectral software | Bruker Corp | ||
| lentiviral particles with Red fluorescent protein | GenTarget, Inc. | LVP023 | |
| trypsin for cell culture | Corning | 25-053-CI | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion) | purchases from drugstore | n/a | |
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | free download | |
| dissecting tools (forceps) | Roboz Surgical Instrument | RS 5130 | |
| dissecting tools (Scissors) | Roboz Surgical Instrument | RS 5910 |
References
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