Introduction
Cancro ovarico epiteliale (EOC) è la più comune causa di morte per neoplasia ginecologica, con una stima di 21,290 nuove diagnosi negli Stati Uniti nel 2015 e si stima che 14.180 decessi 1. La stragrande maggioranza (> 75%) delle donne con diagnosi di malattia in stadio avanzato (stadio III o IV) caratterizzata da diffuse metastasi intra-peritoneale e prognosi infausta. Recidiva di malattia nella cavità peritoneale dopo chemioterapia di prima linea è comune e rappresenta una delle principali cause di mortalità 2,3. EOC metastatizza da un unico meccanismo che coinvolge sia diretta estensione dal tumore primario agli organi peritoneali vicini così come per dissociazione o spargimento di cellule dalla superficie del tumore primario come singole cellule o aggregati multicellulari. Le cellule sono capannone nella cavità peritoneale, in cui resistono distacco indotta l'apoptosi 4. Accumulo di ascite peritoneale è comune, come le cellule tumorali capannone bloccare il drenaggio linfatico peritoneale e tumors producono fattori di crescita che alterano la permeabilità vascolare. Una porzione di cellule tumorali capannone attaccare alla superficie degli organi peritoneali e strutture compreso intestino, fegato, omento e mesentere, dopo di che ancorano e proliferano per produrre più lesioni secondarie ampiamente diffusi 3,5. metastasi ematogena è raro. Così, gestione clinica comunemente è costituito da chirurgia citoriduttiva tra cui "debulking ottimale", definita come la resezione di tutto tumore visibile (non importa quanto piccolo). Citoriduzione completa è associato ad un significativo aumento della sopravvivenza totale 6,7 ed è associato con la sfida di identificazione e la rimozione delle lesioni <0,5 cm.
modelli piccoli animali hanno dimostrato l'utilità nella ricerca sul cancro ovarico nel migliorare la nostra comprensione della progressione della malattia, nonché l'identificazione di biomarcatori prognostici e la sperimentazione di nuovi chemioterapie o approcci di terapia di combinazione. Come il primariosito di incidenza del cancro ovarico e metastasi è la cavità peritoneale, modelli ortotopici di EOC metastasi coinvolgono l'analisi e la caratterizzazione della malattia intraperitoneale. Anche se ci sono stati i recenti miglioramenti nella capacità di cellule tumorali immagine, anche a livello di singola cellula, esistono ancora notevoli difficoltà nel quantificare il carico tumorale metastatico del EOC. Queste sfide si presentano a causa del numero, le dimensioni e la localizzazione anatomica delle lesioni metastatiche. Inoltre esiste una necessità di cellule tumorali etichetta per distinguerli dai normali cellule ospiti. Studi precedenti hanno utilizzato protocolli di etichettatura a base di anticorpi o trasfezione di cellule tumorali con luciferasi 8,9. Etichettatura diretta fluorescente delle cellule tumorali è stato segnalato da Chishima e collaboratori nel 1997 10. Etichette fluorescenti non richiedono aggiunta di substrato esogeno e di offrire una piacevole specificità delle cellule tumorali, fornendo un mezzo più efficace per tenere traccia delle metastasi del cancro 11,12
Qui si descrive un metodo di imaging ottico per l'analisi quantitativa della malattia metastatica utilizzando un modello di xenotrapianto ortotopico singenici composta da proteina fluorescente rossa (RFP) -tagged murine ID8 cellule di cancro ovarico 13 e topi C57 / BL6 immuno-competenti. Abbiamo dimostrato un nuovo metodo di relativa carico tumorale quantificazione combinando in vivo ed ex vivo l'imaging con rimozione del tessuto auto-fluorescenza. Questo approccio ha potenziale utilità in studi volti a valutare l'effetto di specifici genetica, epigenetica o microambientali modifiche e / o modalità di trattamento sulla metastasi organo-specifiche di cancro ovarico.
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Protocol
Tutti gli studi in vivo sono stati approvati dalla University of Notre Dame cura degli animali e del Comitato uso e utilizzati femminili topi C57 / BL6J.
1. murino Ovarian Cancer Cell Culture
- Rendere il murino terreno di coltura delle cellule del cancro ovarico ID8 come segue: 1 L di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con 4% siero fetale bovino (FBS), 1% penicillina / streptomicina, 5 mg / Insulina ml, 5 mg / ml transferrina e 5 ng / ml di sodio selenite.
- Trasdurre ID8 murine cellule di cancro ovarico 13 per esprimere proteine rosso fluorescente (RFP) utilizzando particelle lentivirali commercialmente acquistati che esprimono RFP e un marcatore di selezione (blasticidin gene). Si noti che la proteina fluorescente verde può essere utilizzato, ma fornisce un segnale di fluorescenza debole.
- Immediatamente prima di trasduzione, le cellule di coltura per 50 - 70% di confluenza e aggiungere mezzo fresco (senza penicillina / streptomicina), che include 1 ml polibrene (5 mg / ml finaleconcentrazione).
- Delicatamente pipetta RFP-lentivirus (20 ml) goccia a goccia nel piatto e incubare a 37 ° C per 72 ore. Rimuovere medie e incubare con terreno fresco per 24 ore. Iniziare selezione di cellule trasdotte aggiungendo blasticidin al mezzo di coltura (5 mg / ml) e monitor per eritrociti mediante microscopia in fluorescenza (Figura 1).
- Coltivare le cellule RFP-tag in media ID8 di semina di circa 10 6 cellule in un piatto di coltura tissutale e la visualizzazione di tutti i giorni utilizzando un microscopio ottico fino a quando il monostrato cellulare è confluenti.
- Quando confluenti, raccogliere le cellule con tripsina (0,25%, 3 min) e riportare il pallone al incubatore a 37 o fino a quando le cellule sono staccati.
- Neutralizzare la tripsina con 6 ml di mezzo di coltura contenente siero ID8. Pipettare su e giù contro il fondo del piatto, poi trasferire in un tubo da 15 ml. Centrifugare a 1200 rpm per 2 minuti, quindi aspirare il mezzo utilizzando un glass pipetta.
- Lavare le cellule con tampone fosfato (PBS) per risospendere delicatamente in 6 ml di caldo PBS e centrifugazione come in 1.5 sopra. Risospendere in PBS ad una concentrazione finale di 5 x 10 6 cellule / ml. Mantenere le cellule calde (37 ° C) fino a iniezione.
2. iniezione intra-peritoneale di cellule ID8 e in vivo Imaging
- Iniettare ogni topo con 2 mL di soluzione calda ID8-PBS per un totale di 10 milioni di cellule attraverso (ip) iniezione intra-peritoneale. Consentono alle cellule tumorali di crescere in vivo per circa 10 settimane con l'imaging dal vivo ogni settimana.
- Immediatamente dopo l'iniezione e ogni settimana da allora in poi, pesare i topi e poi anestetizzare ogni topo usando isofluorane (portata 2,5% in O 2 flusso di 0,5 l / min). Nota: I topi sono stati pesati, non come una misura quantitativa della massa tumorale, ma piuttosto una misura più generale dell topo progressione fisica durante lo studio. I topi pesanots sono stati confrontati con i propri valori di peso precedenti.
- Anestetizzare topi mettendo in una camera isofluorane. Mantenere l'anestesia costanti durante la scansione posizionando la testa del mouse nel naso-cono per l'esposizione al 2,5% isofluorane portata durante tutta la procedura.
- Usare una crema depilatoria per rimuovere i peli sul torace e dell'addome di ogni topo, come i capelli neri causerà attenuazione del segnale di fluorescenza. I topi sono bagnate con acqua calda dopo applicazione della crema depilatoria e asciugati con carta assorbente RT.
- Mentre anestetizzato, scansione dell'intero corpo di ciascun topo usando un piccolo sistema di imaging ottico animale. Scansione di tutti i topi in una coorte in ogni punto. Utilizzare i seguenti due step protocollo (Figura 2A):
- Nel passaggio 1, per osservare fluorescente (RFP), le cellule tumorali, eseguire l'acquisizione multispettrale a raccogliere un totale di 5 immagini utilizzando filtri di eccitazione di 440 nm, 460 nm, 480 nm, 520 nm e 540 nm, ed un filtro di emissione di 600 nm. Utilizzare i seguenti parametri di acquisizione: un'esposizione standard di 15 sec, 2 x 2 binning, FOV di 160 mm, e f arresto di 1.1.
- Al punto 2, per osservare l'intero animale, acquisire un'immagine di riflessione utilizzando un filtro aperto di eccitazione (luce bianca), un filtro di emissione aperto, un'esposizione standard di 0,2 sec con 2 x 2 binning e un FOV di 16 cm. Nota: Il tempo di imaging attuale è ~ 1 min.
3. mouse dissezione e Image Acquisition
- Quando l'imaging dal vivo mostra la presenza di una lunga malattia intraperitoneale o animali accumulo mostra di ascite (come evidenziato da distensione addominale), la perdita o il guadagno di peso corporeo superiore al 20%, letargia o altri segni di sofferenza, eutanasia ogni mouse utilizzando CO 2 anestesia seguita da dislocazione cervicale.
- Tagliare la pelle anteriormente lungo la linea mediana ventrale del mouse, utilizzando dissectio appuntiton forbici, dalla parte superiore delle cosce alla parte inferiore della gabbia toracica. Prestare la massima attenzione a tagliare solo lo strato di pelle (Figura 2BI). separare delicatamente la pelle dal tessuto peritoneale, facendo attenzione a non forare la parete peritoneale.
- Utilizzando forbici dissezione appuntiti, tagliati lateralmente sia lungo la parte inferiore della gabbia toracica e la parte superiore delle cosce per creare due lembi di pelle (Figura 2B ii, iii).
- Posizionare ogni mouse sul lato ventrale (cavità peritoneale rivolta verso il basso) con i lembi cutanei tirato aperta e scansione ogni topo con i suoi organi in situ utilizzando il piccolo sistema di imaging ottico animale (Figura 3A, B).
- Utilizzare gli stessi parametri di acquisizione di immagini, come descritto nella 2.4.1.-2.4.2.
- Continuare a sezionare il mouse con l'estrazione di singoli organi peritoneali tra cui il fegato, omento / pancreas, stomaco, il diaframma, intestino tenue, intestino crasso, a sinistra ea destra del peritoneo, ovaie, kidneys, mesentere e cuscinetto adiposo.
- Osservare, enumerare, e registrare i tumori visibile in ogni organo. Utilizzare un calibro per misurare il diametro di ciascun tumore.
- Designare tumori meno di 2 mm di diametro più piccolo, tra 2 e 5 mm come media e maggiore di 5 mm più grande.
- Posizionare gli organi sul modello di scansione organo (figura 4) che identifica una posizione predeterminata per ogni organo. Utilizzare PBS per mantenere gli organi umido.
- Scansione ogni foglio di organi utilizzando il piccolo sistema di imaging ottico animale (Figura 3C, D).
- Utilizzare gli stessi parametri di acquisizione di immagini come descritto al punto 2.4.
- Dopo la scansione, luogo organi in formaldeide al 10% per consentire la successiva lavorazione per l'esame istologico.
4. Quantificazione del carico tumorale in thImmagini e fluorescenza
- Al fine di ridurre la quantità di auto-fluorescenza ogni scansione multispettrale, prima unmix i file utilizzando software disponibile con il piccolo sistema di imaging animali.
- Caricare prima la richiesta di offerta: Nel file di spettrale Vivo, seguito dal Autofluor: Nel file di Vivo rosso nella finestra non miscelati Immagini e selezionare Unmix.
- Esportare i file in formato .bip 16 bit .tiff (non in scala).
- Utilizzare il software ImageJ (ex vivo organi e poi il corpo pieno mouse con organi in situ).
- Utilizzare File> Apri per aprire i file TIFF a 16 bit dei file di modello di scansione organo in ImageJ.
- Sotto Immagine> Regola> Luminosità / Contrasto, scegliere di impostare il minimo valore visualizzato a 0 e il massimo valore visualizzato a 35.353 e poi sottoImmagine> tabelle di ricerca, selezionare Red Hot. Nota: I vari modelli animali saranno richiedono diversi livelli di luminosità, ma è importante per mantenere la luminosità costante durante un determinato studio.
- Utilizzando lo strumento Selezione a mano libera, disegnare una regione a forma libera di selezione interesse (ROI) intorno ad ogni organo e utilizzare lo strumento di misura (CTRL + M) per calcolare la superficie di ciascun organo; registrare la superficie di ogni organo in un foglio di calcolo.
- Con il ROI disegnato attorno ad ogni organo, fate clic destro all'interno del ROI e selezionare Duplica per includere solo l'organo.
- Guardando il singolo organo, sotto Immagine> Regola> Soglia, scegliere di impostare la soglia di immagine ad un più basso livello di soglia del + 1200 ed una soglia di livello superiore della + 1700 per selezionare only regioni più luminose fluorescenti e di controllo per selezionare sfondo scuro; selezionare OK. Nota: Le immagini possono richiedere manipolazione manuale dei cursori di soglia in ImageJ modo che le aree precedentemente brillanti sono selezionati per la fase di analisi, come mostrato sopra. Diversi modelli di malattia saranno richiedono diversi vincoli di soglia, ma è importante per mantenere i livelli di soglia costanti durante un determinato studio.
- Sotto Analizza> Analisi Particelle, modificare la dimensione (pixel ^ 2) a 10-Infinity, scegliere di visualizzare: contorni, di controllo per selezionare solo "Risultati" e fare clic su OK per misurare sia le aree e densità prime integrati di queste regioni luminose, tumori considerati.
- Registrare i valori della superficie e la densità di Raw integrato di ogni selezione del tumore visualizzato nel
- Sotto Analizza> Strumenti> Calibrazione Bar, aggiungere una barra di scala di calibrazione per le immagini degli organi. Nota: In questo esempio, questo è stato fatto cambiando la posizione di alto a destra, il colore di riempimento al nero, il colore dell'etichetta di bianco, il numero di etichette a 5, le cifre decimali a 0, la dimensione del carattere a 12 e la Zoom fattore a 4,0 e consentendo testo in grassetto.
- Sotto File> Salva con nome ..., salvare il montaggio come .tiff e .jpeg.
- Utilizzare File> Apri per aprire il file .jpeg degli organi e poi sotto Inserisci> Casella di testo
- Utilizzare File> Apri per aprire ciascuno dei file TIFF a 16 bit delle scansioni corpo pieno in ImageJ in ordine di numero di mouse.
- Sotto Immagine> Regola> Luminosità / Contrasto, scegliere di impostare il minimo valore visualizzato 0 e il massimo valore visualizzato a + 35353 e poi sotto Immagine> tabelle di ricerca, selezionare Red Hot.
- Sotto File> Salva con nome ..., salvare il montaggio come. Tiff e .jpeg.
Analisi 5. I dati
- Aggiungere le aree di selezione tumorali e densità integrati prime, rispettivamente, per ogni organo di ciascun topo e registrare la superficie totale tumorale organo per ogni mouse.
- Normalizzare l'area registrata e integrat primevalori di densità ED per la dimensione di ciascun organo dividendo l'area tumorale totale e valori di densità integrati prime totale dalla corrispondente superficie dell'organo (Tabella 1).
- Calcolare e tracciare la media di entrambe le superfici del tumore normalizzati ei valori di densità integrati prime normalizzati (Figura 5A, B).
- Confrontare questi valori medi a quelli ottenuti contando visivamente i tumori che erano visibili ad occhio nudo durante l'ispezione di ogni organo per lesioni metastatiche.
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Representative Results
Il meccanismo metastatico del cancro ovarico è caratterizzato da altamente diffusa metastasi intraperitoneale composto da numerose lesioni di varie dimensioni, tra cui più di piccole dimensioni (<2 mm) lesioni. Pertanto, l'uso di cellule tumorali RFP marcato (Figura 1) e l'imaging ottico fornisce un metodo alternativo per conteggio manuale e la misurazione delle dimensioni della lesione. Lo sviluppo della massa tumorale nel tempo può essere determinata settimanale pesata di topi e misura della circonferenza addominale per misurare potenziale presenza di ascite. In vivo imaging ottico fornisce un approccio complementare per valutare il carico tumorale (Figura 2). Il cancro ovarico metastatizza a più siti nella cavità peritoneale e driver molecolari delle metastasi site-specific sono attualmente sconosciute. Oltre alla determinazione del carico globale del tumore, dopo il sacrificio attenta dissezione può essere effettuata per valutare e quantificare pa site-specifictterns di metastasi. Così, imaging ottico di organi peritoneali in situ (Figura 3a, b) in combinazione con ex vivo valutazione dei singoli organi (Figura 3C, D) in grado di fornire dati utili sulla complessiva vs carico tumorale organo-specifica. Le scansioni presentati nella figura 3 rappresentano i risultati di scansione delle cavità addominali e singoli organi di topi con diversi gradi di carico tumorale. Ad esempio, la Figura 3C mostra il peso più del tumore in omento / pancreas, delle ovaie e del mesenterio di mouse A. Rispetto a quegli stessi organi nel topo B, una differenza significativa nel segnale è visibile (Figura 3D). L'uso del modello di scansione organo (figura 4) aiuta nella identificazione di carico tumorale organo-specifiche. L'osservazione della massa tumorale differenziale è confermato quantitativamente sia in termini di superficie tumorale e l'intensità del segnale del tumore (Tabella 1, Figura 5).
figura 2 e 3 illustrano l'ampia gamma di carico tumorale che può essere ripreso e quantificato utilizzando questo metodo. I dati della Tabella 1 illustra la vasta gamma di applicabilità nella quantificazione sia superficie del tumore e l'intensità del tumore segnale. Ad esempio, quando si guarda la omento / pancreas di topo A rispetto a quella del mouse B, la superficie del tumore normalizzata è 26 volte maggiore di un mouse di mouse B. Inoltre, l'ampia gamma di intensità di segnale è esemplificato nel omento / pancreas di topi A e B; normalizzato densità grezzo integrato Mouse A è 56 volte maggiore di quella del mouse B. Questi risultati dimostrano la validità dei comparing il carico tumorale di diversi test sottopone rispetto all'altro, sia in termini di superficie del tumore e l'intensità del segnale del tumore, utilizzando questo metodo rapido che non richiede ulteriori analisi istologica.
Figura 1. Le cellule ID8 Murine Ovarian Cancer RFP Express. (A) immagine di fase di cellule ID8. (B) immagine di fluorescenza delle cellule ID8. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Optical Imaging in diretta di C56 / BL6 Mouse con intraperitoneale massa tumorale. (A) Crema depilatoria è stato utilizzato per rimuovere hai R dalla superficie ventrale del mouse prima della scansione. (B) Schema linea mediana ventrale iniziale e incisioni laterali. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Endpoint scansione di intraperitoneale carico tumorale. (A, B) I topi sono prima ripreso con gli organi in situ (lato ventrale verso il basso) in seguito all'apertura della superficie ventrale del mouse. (C, D) Imaging dei singoli organi. Ogni organo è sezionato, il carico tumorale visiva registrati, e collocato sul modello di scansione organo per l'analisi.target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Organo di scansione Template. organi sezionati sono immessi sul modello di scansione organo di mantenere l'identificazione di posizione dei singoli organi durante la scansione.
.. Figura 5. normalizzato dati quantitativi per la Omentum / Pancreas, ovaie e Mesentere dati sono stati analizzati come descritto nel protocollo e come indicato nella Tabella 1 Mouse A si riferisce al mouse scansionati in pannello 3A; il mouse B si riferisce al mouse scansionato in pannello di 3B. (A) zona tumorale normalizzato. analisi dei segnali di fluorescenza quantificazione di questi tre organi stata condotta e quantificato in termini di rapportodi tumore superficie di tutta la superficie organo per entrambi i topi. (B) normalizzato grezzo della densità integrata. Fluorescenza analisi dei segnali quantificazione di questi tre organi stata condotta e quantificato in termini di rapporto di densità integrato greggio intera superficie organo per entrambi i topi.
| Omento / Pancreas | |||
| Normalizzato Area tumore | Normalizzato Densità Raw integrato | ||
| Un mouse | 0,5346 | 5.11E + 07 | |
| topo B | 0,0203 | 8.97E + 05 | |
| ovaie | |||
| Normalizzato Area tumore | Normalizzato Densità Raw integrato | ||
| Un mouse | 4.79E + 07 | ||
| topo B | 0,0123 | ||
| mesentere | |||
| Normalizzato Area tumore | Normalizzato Densità Raw integrato | ||
| Un mouse | 0,2951 | 2.22E + 07 | |
| topo B | 0,0098 | 4.15E + 05 | |
Tabella 1. normalizzato tumore Area e normalizzato RawI valori di densità integrata nel omento / pancreas, ovaie e Mesentere sia un mouse e mouse B. Messaggio dissezione e la scansione, ogni organo è stato segmentato e la sua fluorescenza quantificati per determinare la percentuale di area di tumore per superficie totale degli organi e le intensità del fluorescenza per queste aree tumorali. L'omento / pancreas, ovaie e mesentere sono stati selezionati come avevano fatto i più forti segnali di fluorescenza all'interno di entrambi i gruppi di controllo positivi e negativi.
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Discussion
In contrasto con gli studi utilizzando cellule di cancro ovarico umano che devono essere condotti in topi immunocompromessi, il protocollo sopra descritto utilizza topi immunocompetenti C57 / BL6 e le cellule di cancro ovarico murini singenici. Mentre questo consente di valutare il ruolo potenziale di infiltrati immunitari in progressione tumorale e metastasi, la presenza di peli scuri sulla superficie addominale rende meno sensibili di imaging. Uso di un depilatoria per rimuovere i capelli prima di imaging migliora l'acquisizione delle immagini, ma in termini di tempo, in particolare per esperimenti richiedono l'imaging longitudinale. topo senza peli 'Nude' possono essere utilizzati in questo protocollo e non necessitano di rimozione dei capelli depilatoria-based. Inoltre, topi nudi mancano di un funzionamento del sistema immunitario, in modo possono anche essere utilizzati per valutare la crescita di cellule tumorali ovariche umane in esperimenti in cui il contributo del sistema immunitario non è sotto analisi.
Va inoltre notato che la profondità di intrapertumori itoneal presenta anche sfide tecniche, come imaging di fluorescenza ottica generalmente non rilevare i tumori a profondità superiori a 5 mm. Inoltre, la prevalenza del liquido ascitico e la presenza di cellule tumorali ascitico forniscono ulteriori complicazioni. Abbiamo osservato significativa variabilità del mouse a mouse nella formazione di liquido ascitico, anche quando iniettato con la stessa linea cellulare. Così, in presenza di ascite, questo metodo è preferibile per l'analisi end-point di carico tumorale organo-specifica piuttosto che di routine di imaging longitudinale progressione. Nel caso attuale, sono stati notati cambiamenti drammatici nella massa tumorale tra i topi esempio, in modo tale che coorti di quattro o cinque topi di solito è sufficiente per l'analisi statistica. Nel caso di differenze meno drammatiche in massa tumorale, saranno necessari i soggetti sperimentali aggiuntivi per raggiungere il potere statistico. Mentre gli esempi riportati qui differiscono notevolmente in volume del tumore, fluorescenza ottico può essere usato perrilevare differenze molto più piccole del carico tumorale organo-specifiche, in particolare rispetto al peso-o misurazioni pinza basata su piccole lesioni (non mostrati) .Risoluzione e la sensibilità varierà con la linea cellulare e sistema di imaging. Nel caso di specie, gli impianti metastatico piccolo come 400 micron di diametro possono essere risolti e quantificati. Metodi alternativi, tra cui la tomografia contrast-enhanced computerizzata (TC), la risonanza magnetica (MR), e la tomografia ad emissione di positroni (PET) sono state descritte per l'imaging longitudinale 14,15. Modalità tra cui l'imaging combinato anatomica e funzionale sono anche in fase di sviluppo 16.
In riferimento a questa metodo proposto per la quantificazione della massa tumorale, va osservato che la determinazione delle soglie di fluorescenza [Fase 4.3.5.] Si basa sull'intensità della fluorescenza visto nelle immagini di organi [Fase 4.3.2.] e viene scelta dall'utente per includere solo le regioni più fluorescenti relative al resto dell'organo. valori soglia Variando stati usati nell'analisi prima di determinare i valori di soglia finali utilizzati in questo studio. Una volta determinato, queste stesse soglie sono stati usati per ogni organo analizzato in modo da garantire la coerenza nella quantificazione di quanto ritenuto tessuto metastatico dall'analisi visiva iniziale svolto dal ricercatore. La determinazione di queste soglie è un passaggio fondamentale nella procedura e potenzialmente potrebbe variare da un progetto all'altro, come determinato dal singolo ricercatore. In questo caso, una grande soglia inferiore è stato utilizzato in modo da catturare solo la più segnali di intensità di fluorescenza. Utilizzando la stessa soglia per ogni organo analizzato, l'analisi e risultati offrono risultati quantitativi comparativi nel contesto di questa coorte di topi. Mentre questo metodo è limitato in quantificazione dei valori assoluti di superficie tumorale, permette ai ricercatori di confrontare le relative carico tumorale normalizzato fra lo stesso unND diversi organi all'interno coorti di topi. Va notato che questo approccio comprende quantificazione di tumori che non sono visibili ad occhio nudo.
Il meccanismo metastatico unica di EOC risultati in carcinosi intraperitoneale ampiamente diffusi che coinvolgono più organi e tessuti, rendendo la chirurgia citoriduttiva ottimale tecnicamente impegnativo. Come completa citoriduzione correla positivamente con la sopravvivenza globale, ne consegue che lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per combattere le metastasi intra-peritoneale è garantito. Valutazione dell'efficacia terapeutica, tuttavia, dipende precisa quantificazione della massa tumorale, compresa la valutazione delle metastasi organo-specifiche. Utilizzando imaging ottico delle cellule tumorali RFP-tag in situ corretto per autofluorescenza organo, in combinazione con attenzione l'imaging organo ex vivo, abbiamo sviluppato un approccio per quantificare intraperitoneale carico tumorale organo-specifica. È interessante notare che le nostre analisi mostranoche i siti preferiti di metastasi in questo modello, come definito dal tumore zona carico / superficie, sono simili a quelle che si trovano nelle donne con tumore ovarico (omento, ovaie, intestino, mesentere) 2,4,5. Quindi questo approccio dovrebbe avere utilità futura nella valutazione di terapie sperimentali progettati per colpire la malattia metastatica.
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Disclosures
Questo articolo fa parte di un numero speciale su Imaging multimodale pre-clinico, sponsorizzato da Bruker Biospin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning | 10-014-CM | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437-028 | |
| penicillin/streptomycin | |||
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I-1884 | |
| Bruker Xtreme small animal imaging system | Bruker Corp. | ||
| Bruker Multispectral software | Bruker Corp | ||
| lentiviral particles with Red fluorescent protein | GenTarget, Inc. | LVP023 | |
| trypsin for cell culture | Corning | 25-053-CI | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion) | purchases from drugstore | n/a | |
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | free download | |
| dissecting tools (forceps) | Roboz Surgical Instrument | RS 5130 | |
| dissecting tools (Scissors) | Roboz Surgical Instrument | RS 5910 |
References
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