Introduction
Ovarialcancer (EOC) er den vanligste dødsårsaken fra gynecologic malignitet, med anslagsvis 21,290 nye diagnoser i USA i 2015 og anslagsvis 14,180 dødsfall 1. De aller fleste (> 75%) av kvinner diagnostisert med sent stadium sykdommen (stadium III eller IV) preget av diffuse intra-peritoneal metastasering og dårlig prognose. Tilbakefall av sykdommen i bukhulen etter førstelinje kjemoterapi er også vanlig, og representerer en viktig årsak til dødelighet 2,3. EOC metastasizes ved en unik mekanisme som involverer både direkte forlengelse fra den primære tumor til nabo peritoneal-organer samt ved dissosiasjon eller shedding av celler fra den primære tumor overflate som enkeltceller eller multi-cellulære aggregater. Celler blir skur inn i bukhulen, karakterisert ved at de motstår løsgjøring-indusert apoptose 4. Oppbygging av peritoneal ascites er vanlig, som kaster kreftceller blokkere peritoneal lymfedrenasje og tumors produsere vekstfaktorer som endrer vaskulær permeabilitet. En del av skur tumorceller feste seg til overflaten av peritoneale organer og strukturer, inkludert tarm, lever, omentum og mesenteriet, hvoretter de anker og proliferere for å produsere flere vidt spredte sekundære lesjoner 3,5. Hematogenous metastase er uvanlig. Dermed klinisk ledelse består vanligvis av cytoreduserende kirurgi inkludert "optimal debulking", definert som reseksjon av all synlig tumor (uansett hvor lite). Fullstendig cytoreduksjon er assosiert med en signifikant økning i total overlevelse 6,7 og er forbundet med utfordringen med identifikasjon og fjerning av lesjoner <0,5 cm.
Små dyremodeller har vist nytte i eggstokkreft forskning i å forbedre vår forståelse av sykdomsutvikling samt legitimasjon av prognostiske biomarkører og testing av nye kjemoterapi eller kombinasjonsbehandling tilnærminger. Som primærside eggstokkreft forekomst og metastase er bukhulen, ortotopiske modeller av EOC metastasering involverer analyse og karakterisering av intraperitoneal sykdom. Selv om det har vært de siste forbedringer i evnen til bilde kreftceller, selv på celle-nivå, det finnes fortsatt betydelige vanskeligheter i å kvantifisere metastatisk svulst byrden av EOC. Disse utfordringene oppstår på grunn av antall, størrelse og anatomisk plassering av metastatiske lesjoner. Videre foreligger det et behov for å merke kreftceller til å skille dem fra normale vertsceller. Tidligere studier har benyttet antistoffbaserte merkingsprotokoller eller transfeksjon av tumorceller med luciferase 8,9. Direkte fluorescerende merking av kreftceller ble først rapportert av Chishima og medarbeidere i 1997 10. Fluorescerende markører krever ikke tilsetning av eksogent substrat og gi utsøkt tumorcelle spesifisitet, noe som gir et mer effektivt middel for å spore kreft metastase 11,12
Heri vi beskriver en optisk avbildningsmetode for kvantitativ analyse av metastatisk sykdom ved hjelp av en syngene orthotopic xenograft modell består av rød fluorescerende protein (RFP) -tagged murine ID8 eggstokkreft celler 13 og immunkompetente C57 / BL6 mus. Vi viser en ny fremgangsmåte for relativ tumorbyrden kvantifisering kombinere in vivo og ex vivo avbildning med fjerning av vev auto-fluorescens. Denne tilnærmingen har potensial verktøy i studier designet for å evaluere effekten av spesifikke genetiske, epigenetiske eller mikro-miljø modifikasjoner og / eller behandlingsmetoder på organspesifikk metastasering av eggstokkreft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in vivo studier ble godkjent av University of Notre Dame Animal Care og bruk komité og brukt kvinnelige C57 / BL6J mus.
1. Murine Ovarian Cancer Cell Culture
- Gjør ID8 murine eggstokkreft cellekulturmedium som følger: 1 liter av Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 4% føtalt bovint serum (FBS), 1% penicillin / streptomycin, 5 ug / ml insulin, 5 ug / ml Transferrin og 5 ng / ml natriumselenitt.
- Transduce ID8 murine eggstokkreft celler 13 å uttrykke Red Fluorescent Protein (RFP) bruker kommersielt anskaffet lentiviral partikler uttrykker RFP og en seleksjonsmarkør (blasticidin genet). Legg merke til at grønt fluorescerende protein kan brukes, men gir et svakere signal fluorescens.
- Umiddelbart før transduksjon, kultur celler til 50 - 70% samløpet og tilsett frisk medium (uten penicillin / streptomycin) som inneholder en ml polybrene (5 mikrogram / ml endeligkonsentrasjon).
- Forsiktig pipette RFP-lentivirus (20 mL) dråpevis i formen og inkuberes ved 37 o C i 72 timer. Fjern medium og inkuberes med friskt medium i 24 timer. Begynn utvalg av omsatte celler ved å legge blasticidin til kultur medium (5 mikrogram / ml) og overvåke for røde celler med fluorescens mikroskopi (Figur 1).
- Kultur RFP-merkede celler i ID8 medium ved såing ca 10 6 celler i et vev kultur tallerken og visualisere daglig bruker et lysmikroskop inntil cellen monolayer er konfluent.
- Ved konfluent, høste cellene ved hjelp av trypsin (0,25%, 3 min) og tilbake i kolben til 37 ° C inkubator inntil cellene er frittliggende.
- Nøytralisere trypsin med 6 ml ID8 kulturmedium inneholdende serum. Pipetter opp og ned mot bunnen av fatet, deretter overføre til en 15 ml konisk tube. Sentrifuger ved 1200 rpm i 2 minutter, deretter suge mediet ved hjelp av en glass pipette.
- Vask cellene med fosfatbufret saltvann (PBS) ved forsiktig resuspendering i 6 ml varm PBS og sentrifugering som i 1.5 ovenfor. Re-suspendere i PBS til en sluttkonsentrasjon på 5 x 10 6 celler / ml. Hold celler varme (37 o C) før injeksjon.
2. Intra-peritoneal Injeksjon av ID8 celler og in vivo Imaging
- Injisere hver mus med 2 ml av den varme ID8-PBS-oppløsning for totalt 10 millioner celler gjennom intra-peritoneal (ip) injeksjon. Tillat kreftceller til å vokse in vivo i ca 10 uker med ukentlig live bildebehandling.
- Umiddelbart etter injeksjon, og hver uke etterpå, veie mus og deretter bedøve hver mus bruker isofluorane (2,5% strømningshastighet på 0,5 l / min O 2 flow). Merk: Musene ble veiet, og ikke som et kvantitativt mål på tumorbyrden, men snarere en mer generell måling av individuell mus fysisk progresjon gjennom hele studien. mus veiets ble sammenlignet med sine egne tidligere vektverdier.
- Anesthetize mus ved å plassere i en isofluorane kammer. Oppretthold konstant anestesi under skanning ved å plassere musen hodet i nesen-membran for eksponering mot 2,5% flow rate isofluorane gjennom hele prosedyren.
- Bruk riktige fløte for å fjerne hår på torso og magen hos hver mus, som svart hår vil føre til svekking av fluorescens-signalet. Mus som er badet med varmt vann etter påføring av hårfjerningskrem og tørket med papirhåndklær RT.
- Mens bedøvet, skanne hele kroppen av hver mus ved hjelp av et lite dyr optisk imaging system. Skanne alle mus i en kohort på hvert tidspunkt. Bruk følgende totrinns protokoll (figur 2A):
- I trinn 1, for å observere fluorescensmerkede (RFP) tumorceller, utføre multispektrale oppkjøpet å samle totalt 5 bilder med eksitasjon filtre av 440 nm, 460 nm, 480 nm, 520 nm og 540 nm og en emisjonsfilter på 600 nm. Bruk følgende oppkjøp parametere: en standard eksponering på 15 sek, 2 x 2 binning, FOV på 160 mm, og f stopp på 1,1.
- I trinn 2, for å observere hele dyret, å erverve et bilde reflektansen ved bruk av en åpen eksitasjonsfilteret (hvitt lys), en åpen utslipp filter, en standard eksponering på 0,2 sek med 2 x 2 binning og en FOV på 16 cm. Merk: Den faktiske bilde tid er ~ 1 min.
3. Mouse Dissection og Image Acquisition
- Når levende avbildning viser tilstedeværelse av omfattende intra-peritoneal sykdom eller dyr utstillings opphopning av ascites (som gjenspeiles av oppblåst mage), tap eller gevinst på kroppsvekt større enn 20%, slapphet eller andre tegn på stress, avlive hver mus ved hjelp av CO 2 anestesi etterfulgt av cervikal dislokasjon.
- Kutt huden anteriorly langs ventrale midtlinjen av musen, ved hjelp av spisse dissection saks, fra toppen av lårene til bunnen av brystkassen. Vær svært nøye med å skjære gjennom bare huden lag (Figur 2Bi). Forsiktig skille huden fra peritoneal vev, være sikker på å ikke punktere peritoneal veggen.
- Ved hjelp av spisse disseksjon saks, skåret sideveis både langs bunnen av brystkassen og toppen av lårene for å skape to fliker av hud (figur 2B ii, iii).
- Plasser hver mus på sin ventrale side (bukhulen vender nedover) med hudlapper trukket åpen og skanne hver mus med dens organer in situ ved hjelp av små dyr optisk avbildningssystem (figur 3A, B).
- Bruk samme bildeinnhentingsparametre som beskrevet i 2.4.1.-2.4.2.
- Fortsett dissekere musen ved å trekke ut enkelt peritoneal organer inkludert lever, omentum / bukspyttkjertel, mage, pessar, tynntarm, tykktarm, venstre og høyre bukhinnen, eggstokker, kidneys, mesenteriet og fett pad.
- Observer, nummerere, og registrere synlige svulster på hvert organ. Bruke et skyvelære for å måle diameteren av hver tumor.
- Utpeke tumorer mindre enn 2 mm i diameter som små, på mellom 2 og 5 mm som medium og som er større enn 5 mm så stor.
- Plasser organene på orgelet skanning mal (figur 4) som identifiserer et bestemt sted for hvert organ. Bruke PBS for å holde organene fuktig.
- Skanner hvert ark av organer ved hjelp av små dyr optisk avbildningssystem (figur 3C, D).
- Bruk samme bildeinnhentingsparametre som beskrevet i trinn 2.4.
- Etter skanning, for å plassere organene i 10% formaldehyd aktivere påfølgende behandling for histologi.
4. Kvantifisering av tumorbyrden i thBilder fra e Fluorescens
- For å redusere mengden av auto-fluorescens i hver multispektrale skanning første unmix filene ved hjelp av programvare som er tilgjengelig med små dyr avbildningssystem.
- Laster først RFP: In Vivo spektral fil, etterfulgt av Autofluor: In Vivo Red fil i ublandet bilder vinduet og velg Unmix.
- Eksportere .bip filene som 16 bits TIFF (uskalert) format.
- Bruk ImageJ programvare (ex vivo organer og deretter full musen kroppen med organer i situ).
- Bruk Fil> Åpne for å åpne 16 bits TIFF-filer av orgel skanning malfiler i ImageJ.
- Under bilde> Juster> Lysstyrke / kontrast, velger å sette minimum viste verdien til 0 og maksimal verdien slik 35353 og deretter underBilde> oppslagstabeller, velg Red Hot. Merk: Ulike dyremodeller vil kreve forskjellige lysstyrkenivåer, men det er viktig å holde lysstyrken konsekvent gjennom en gitt studie.
- Bruk av Freehand markeringsverktøyet tegne en fri form region av interesse utvalg (ROI) rundt hvert organ og bruke måleverktøyet (CTRL + M) for å beregne arealet av hvert organ; ta arealet av hvert organ i et regneark.
- Med ROI trukket rundt hvert organ, høyreklikk innenfor ROI og velg Duplicate å inkludere bare orgel.
- Mens du ser på det enkelte organ under bilde> Juster> Threshold, velger å sette terskelen av bildet til en lavere terskel Nivå + 1200 og en øvre grenseverdi på + 1700 for å velge only de kraftigst fluorescerende regioner og sjekke for å velge Mørk bakgrunn; velg OK. Merk: Bildene kan kreve manuell manipulering av terskel glidere i ImageJ slik at de tidligere lyseste områdene er valgt for analyse trinn, som vist ovenfor. Ulike sykdomsmodeller vil kreve forskjellige terskel begrensninger, men det er viktig å holde terskelnivåer konsekvent gjennom en gitt studie.
- Under Analyser> Analyser Partikler, endre størrelse (piksler ^ 2) til 10-Infinity, velge å vise: Outlines, sjekk for å velge bare "resultatvisning" og klikk OK for å måle både områder og rå integrert tettheter av disse lyse områdene, anses svulster.
- Registrere verdier for overflatearealet og den rå Integrated Tetthet av hver tumor valg vist i
- Under Analyser> Verktøy> Kalibrering Bar, legge en kalibrerings skala bar til bilder av organer. Merk: I dette eksemplet, dette ble gjort ved å endre posisjon til Øvre høyre, fyllfargen til svart, Label Color White, antall etiketter til fem, de desimaler som skal 0, skriftstørrelsen til 12 og zoom faktor til 4,0 og muliggjør Fet tekst.
- Under Fil> Lagre som ..., lagre montasjen som en tiff og .jpeg.
- Bruk Fil> Åpne for å åpne JPEG-fil av organer og deretter under Insert> Tekstboks
- Bruk Fil> Åpne for å åpne hver av de 16 bits TIFF-filer av full kroppsskanning i ImageJ for mus nummer.
- Under bilde> Juster> Lysstyrke / kontrast, velger å sette minimum viste verdien til 0 og Maximum viste verdien til + 35 353 og deretter under Bilde> Oppslag Bord, velg Red Hot.
- Under Fil> Lagre som ..., lagre montasjen som en. TIFF og JPEG.
5. Data Analysis
- Tilsett tumor merkede områder og rå integrerte tettheter, henholdsvis for hvert organ av hver enkelt mus og registrere det totale organ tumorområdet for hver mus.
- Normalisere innspilt området og rå integrattetthetsverdier for størrelsen av hvert organ ved å dividere det totale tumorområdet og total rå integrerte tetthetsverdier av det tilsvarende organ overflateareal (Tabell 1) ED.
- Beregne og plotte gjennomsnittet av begge de normaliserte tumor flater og de normaliserte rå integrerte tetthetsverdier (figur 5A, B).
- Sammenligne disse gjennomsnittsverdier for de som erholdes ved visuell telling av svulster som var synlige for det blotte øye under inspeksjon av hvert organ for metastatiske lesjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den metastatisk mekanisme for eggstokkreft er preget av svært diffuse intra-peritoneal metastase består av mange lesjoner av varierende størrelse, inkludert flere små (<2mm) lesjoner. Således bruk av RFP-merkede tumorceller (figur 1) og optisk imaging tilveiebringer en alternativ metode til manuell telling og måling av lesjon størrelse. Utviklingen av tumorbyrden over tid kan bli bestemt ved ukentlig veiing av mus og måling av abdominal omkrets for å måle potensialet nærvær av ascites. In vivo optisk avbildning gir en komplementær måte for å vurdere tumorbyrden (figur 2). Eggstokkreft metastasizes til flere områder i bukhulen og molekylære driverne av stedsspesifikke metastaser er foreløpig ukjent. I tillegg til fastsettelse av generelle tumorbyrden, kan følgende offer forsiktig disseksjon utføres for å vurdere og kvantifisere stedsspesifikke patterns av metastasering. Dermed kan optisk avbildning av peritoneal organer i situ (figur 3A, B) kombinert med ex vivo vurdering av individuelle organer (figur 3C, D) gir nyttige data om generell vs organspesifikk tumorbyrde. De skanner presentert i Figur 3 representerer resultatene av skanning bukhulen og enkelte organer hos mus med varierende grad av tumorbyrde. For eksempel viser figur 3C den mest tumorbelastning i omentet / bukspyttkjertel, eggstokker og mesenterium av mus A. Når sammenlignet med de samme organer i mus B, er en betydelig forskjell i signal blir sett (figur 3D). Bruken av orgelet skanningen sjablon (figur 4) hjelper til identifikasjon av organspesifikk tumorbyrde. Observasjonen av differensialtumorbyrden bekreftes kvantitativt både i form av tumoroverflateareal og tumorsignalintensitet (tabell 1, figur 5).
figur 2 og 3 illustrerer det store spekter av tumorbyrden som kan avbildes og kvantifiseres ved hjelp av denne metoden. Dataene i tabell 1 illustrerer dette store utvalg av anvendbarhet i kvantifisere både tumoroverflateareal og signalstyrken for tumoren. For eksempel, når man ser på det omentum / bukspyttkjertel fra mus En sammenlignet med mus B, er den normaliserte tumoroverflatearealet 26 ganger større i mus En mus enn B. Videre er det store utvalg av signalintensiteten er også eksemplifisert i omentum / bukspyttkjertel fra mus A og B; den normaliserte rå integrert densitet på mus En er 56 ganger større enn den til mus B. Disse resultater viser gyldigheten av Comparing av tumorbelastning av flere testpersonene i forhold til hverandre, både når det gjelder tumoroverflateareal og tumorsignalintensitet, ved hjelp av denne rask metode som ikke krever videre histologisk analyse.
Figur 1. ID8 Murine eggstokkreft celler Express RFP. (A) Fase bilde av ID8 celler. (B) Fluorescens bilde av ID8 celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Levende Optisk Imaging av C56 / BL6 mus med Intra-peritoneal Tumor Burden. (A) Hårfjerningskrem ble brukt til å fjerne hai r fra baksiden av musen før du skanner. (B) Diagram som viser innledende ventral midtlinjen og laterale snitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Endpoint Skanning av Intra-peritoneal Tumor Burden. (A, B) Mus første avbildes med organer i situ (ventral side ned) etter åpningen av ventral overflaten av musen. (C, D) Imaging av enkelte organer. Hvert organ er dissekert, visuell tumorbyrde innspilt, og plassert på orgel skanning mal for analyse.target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Organ skanning mal. Dissekerte organer er plassert på orgel skanning malen for å opprettholde posisjons identifisering av enkeltorganer under skanning.
.. Figur 5. Normalisert kvantitative data for Omentum / Pancreas, eggstokker og mesenteriet Data ble analysert som beskrevet i protokollen, og som vist i tabell 1 mus En viser til mus undersøkt i panel 3A; mus B henviser til mus skannes i panel 3B. (A) Normalisert tumorområdet. Fluorescenssignalet kvantifisering analyse av disse tre organene ble utført og kvantifisert i forhold til en ratioav tumoroverflateareal til hele organet flateareal for både mus. (B) Normalisert rå integrert tetthet. Fluorescenssignalet kvantifisering analyse av disse tre organene ble utført og kvantifisert i forhold til et forhold på rå integrert densitet for hele organet flateareal for både mus.
| Omentum / Pancreas | |||
| Normalisert Tumor-området | Normalisert Raw Integrert Tetthet | ||
| mus A | 0,5346 | 5.11E + 07 | |
| mus B | 0,0203 | 8.97E + 05 | |
| eggstokkene | |||
| Normalisert Tumor-området | Normalisert Raw Integrert Tetthet | ||
| mus A | 4.79E + 07 | ||
| mus B | 0,0123 | ||
| mesentery | |||
| Normalisert Tumor-området | Normalisert Raw Integrert Tetthet | ||
| mus A | 0,2951 | 2.22E + 07 | |
| mus B | 0,0098 | 4.15E + 05 | |
Tabell 1. Normalisert tumorområdet og Normalisert RawIntegrerte Tetthet verdier i Omentum / Pancreas, eggstokker og mesenteriet av både mus En mus og B. Post disseksjon og scanning ble hver organ segmentert og dens fluorescens kvantifisert for å bestemme andelen av tumorområdet til total organ overflateareal og intensitetene av fluorescens for disse tumorområdene. Omentum / bukspyttkjertel, eggstokker og mesenteriet ble valgt fordi de hadde de sterkeste fluorescens-signaler i både de positive og negative kontrollgrupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I motsetning til studier med humane eggstokkreft celler som må gjennomføres i immunsupprimerte mus, beskrevet protokollen ovenfor benytter immunkompetente C57 / BL6 mus og syngene murine eggstokkreft celler. Selv om dette muliggjør vurdering av den potensielle rolle av immun infiltrater i tumorprogresjon og metastase, tilstedeværelse av mørkt hår på bukhinnen gjengir bilde mindre følsom. Bruk av en hårfjerningskrem for å fjerne hår før bildebehandling forbedrer bildeoverføring, men er tidkrevende, spesielt for eksperimenter som krever langsgående bildebehandling. Naken 'naken' mus kan brukes i denne protokollen og ikke krever riktige basert hårfjerning. Videre nakne mus mangler et fungerende immunsystem, så kan også benyttes for å vurdere veksten av humane eggstokkreft celler i forsøk hvor bidraget fra immunsystemet ikke er under analyse.
Det bør også bemerkes at dybden av intraperitoneal svulster presenterer også tekniske utfordringer, som optisk fluorescens bildebehandling vil generelt ikke oppdage svulster på havdyp større enn 5 mm. Videre, forekomsten av ascites fluid, og tilstedeværelsen av ascitiske tumorceller inneholder ytterligere komplikasjoner. Vi har observert signifikant mus-til-mus variabilitet i dannelsen av ascitesvæsken, selv når injisert med den samme cellelinje. Således, i nærvær av ascites, er denne metode å foretrekke for ende-punkt analyse av organspesifikk tumorbelastning i stedet for rutinemessig langsgående avbildning av progresjon. I dagens tilfelle ble dramatiske endringer i tumorbyrde bemerket mellom eksempel mus, slik at årskull av fire til fem mus vil vanligvis være tilstrekkelig for statistisk analyse. I tilfelle av mindre dramatiske forskjeller i tumorbyrde, vil ytterligere eksperimentelle fag være nødvendig for å oppnå statistisk styrke. Selv om eksemplene som er vist her varierer betydelig i tumorvolum, kan optisk fluorescens avbildning benyttes til ådetektere mye mindre forskjeller i organspesifikk tumorbyrden, særlig når sammenlignet med vekt eller kaliberbaserte målinger av små lesjoner (ikke vist) .Resolution og følsomheten vil variere med cellelinje og avbildningssystem. I den foreliggende sak, kan metastatisk implantater så små som 400 mikrometer i diameter løses og kvantifisert. Alternative metoder inkludert kontrastforsterket computertomografi (CT), magnetisk resonans (MR) avbildning, og positronemisjonstomografi (PET) har blitt beskrevet for langsgående bildebehandling 14,15. Modaliteter inkludert kombinert anatomisk og funksjonell avbildning er også under utvikling 16.
I forhold til denne foreslåtte fremgangsmåte for kvantifisering av tumorbyrden, bør det bemerkes at bestemmelsen av fluorescens tersklene [Trinn 4.3.5.] Er basert på intensiteten av fluorescens sett i organ bildene [Trinn 4.3.2.] og er valgt av brukeren for å inkludere bare de mest fluorescerende regionene forlengive til resten av organet. Varierende terskelverdier ble anvendt i analysen før bestemmelse av de endelige terskelverdiene brukt i denne studien. Når bestemt, ble disse samme terskler som brukes for hvert organ analysert for slik å sikre konsistens i kvantifisering av hva som anses metastatisk vev av den første visuelle analyse gjort av forskeren. Fastsettelsen av disse grenseverdiene er et kritisk trinn i prosedyren og potensielt kan variere fra ett prosjekt til den andre som bestemmes av den enkelte forsker. I dette tilfelle ble en stor nedre terskel som brukes for å fange opp bare de høyeste intensitet fluorescenssignaler. Ved å bruke denne samme terskelen for hvert organ analysert, analyse og resultatene gir sammenlignende kvantitative resultater innenfor rammen av denne kohort av mus. Selv om denne metoden er begrenset i kvantifisering av absoluttverdier av tumoroverflateareal, kan det forskere muligheten for å sammenligne relative normaliserte tumorbelastning blant de samme ennd ulike organer i kohorter av mus. Det bør bemerkes at denne tilnærmingen omfatter kvantifisering av tumorer som ikke er synlige for det blotte øye.
Den unike metastatisk mekanisme EOC resultater i spres intraperitoneal karsinomatose involverer flere vev og organer, gjengivelse optimal cytoreduserende kirurgi teknisk utfordrende. Som komplett cytoreduksjon positivt korrelerer med total overlevelse, følger det at utviklingen av nye terapeutiske strategier for å bekjempe intra-peritoneal metastasering er berettiget. Vurdering av terapeutisk effekt, men er avhengig av nøyaktig kvantifisering av tumorbyrden, inkludert vurdering av organspesifikk metastasering. Bruk av optisk avbildning av RFP-merkede tumorceller i situ korrigert for orgel autofluorescence, kombinert med forsiktig ex vivo orgel imaging, har vi utviklet en tilnærming til å kvantifisere intraperitoneal organspesifikk tumorbyrde. Interessant, våre analyser visersom foretrukne områder av metastase i denne modellen, som definert av tumorbyrden / overflateareal, er lik de som finnes i kvinner med eggstokkreft (omentum, eggstokk, tarm, mesenteriet) 2,4,5. Derfor denne tilnærmingen bør ha tidig nytte i vurderingen av eksperimentelle behandlingsformer utformet for å målrette metastatisk sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Denne artikkelen er en del av et spesialnummer om Multimodal Pre-Clinical Imaging, sponset av Bruker Biospin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning | 10-014-CM | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437-028 | |
| penicillin/streptomycin | |||
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I-1884 | |
| Bruker Xtreme small animal imaging system | Bruker Corp. | ||
| Bruker Multispectral software | Bruker Corp | ||
| lentiviral particles with Red fluorescent protein | GenTarget, Inc. | LVP023 | |
| trypsin for cell culture | Corning | 25-053-CI | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion) | purchases from drugstore | n/a | |
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | free download | |
| dissecting tools (forceps) | Roboz Surgical Instrument | RS 5130 | |
| dissecting tools (Scissors) | Roboz Surgical Instrument | RS 5910 |
References
- American Cancer Society. , Available from: http://www.cancer.org/cancer/ovariancancer/overviewguide/ovarian-cancer-overview-key-statistics (2015).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
- Halkia, E., Spiliotis, J., Sugarbaker, P. Diagnosis and management of peritoneal metastases from ovarian cancer. Gastroenterology Research and Practice. 2012, 541842-541854 (2012).
- Barbolina, M. V., et al. Microenvironmental regulation of ovarian cancer metastasis. Cancer Treatment and Research. 149, 319-334 (2009).
- Lengyel, E., et al. Epithelial ovarian cancer experimental models. Oncogene. 33 (28), 3619-3633 (2014).
- Harter, P., duBois, A. The role of surgery in ovarian cancer with special emphasis on cytoreductive surgery for recurrence. Current Opinion in Oncology. 17 (5), 505-514 (2005).
- Bristow, R. E., Puri, I., Chi, D. S. Cytoreductive surgery for recurrent ovarian cancer: a meta-analysis. Gynecologic Oncology. 112 (1), 265-274 (2009).
- Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death and Differentiation. 9, 786-789 (2002).
- Sweeney, T. J., et al. Visualizing the kinetics of tumor-cell clearance in living animals. Proceedings of the National Academy of Science USA. 96, 12044-12049 (1999).
- Chishima, T., et al. Cancer invasion and micrometastasis visualized in live tissue by green fluorescent protein expression. Cancer Research. 57, 2042-2047 (1997).
- Bouvet, M., et al. Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model. Cancer Research. 62, 1534-1540 (2002).
- Hoffman, R. M. The Multiples Uses of Fluorescent Proteins to Visualize Cancer in vivo. Nature Reviews. 5, 796-806 (2005).
- Roby, K. F., et al. Development of a syngeneic mouse model for events related to ovarian cancer. Carcinogenesis. 21 (4), 585-591 (2000).
- Rampurwala, M., Ravoori, M. K., Wei, W., Johnson, V. E., Vikram, R., Kundra, V. Visualization and quantification of intraperitoneal tumors by in vivo computed tomography using negative contrast enhancement strategy in a mouse model of ovarian cancer. Translational Oncology. 2 (2), 96-106 (2009).
- Kim, T. J., et al. Antitumor and antivascular effects of AVE8062 in ovarian carcinoma. Cancer Research. 67, 9337-9345 (2007).
- Picchio, M., et al. Advanced ovarian carcinoma: usefulness of [(18)F]FDG-PET in combination with CT for lesion detection after primary treatment. Quarterly Journal of Nuclear Medicine. 47, 77-84 (2003).
