Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Количественное внутрибрюшинным метастаз рака яичников

Published: July 18, 2016 doi: 10.3791/53316
* These authors contributed equally

Introduction

Эпителиальный рак яичников (EOC) является наиболее распространенной причиной смерти от гинекологических злокачественных новообразований, с предполагаемой 21,290 новых диагнозов в США в 2015 году и приблизительно 14,180 смертей 1. Подавляющее большинство (> 75%) женщин с диагнозом поздней стадии заболевания (стадия III или IV) характеризуется диффузным внутрибрюшинным метастазирования и неблагоприятным прогнозом. Рецидив заболевания в брюшной полости следующей химиотерапии первой линии является обычным явлением и представляет собой основную причину смертности 2,3. EOC метастазирует с помощью уникального механизма с участием как прямое расширение первичной опухоли в соседние органы брюшины, а также путем диссоциации или пролития клеток с поверхности первичной опухоли в виде отдельных клеток или многоклеточных агрегатов. Клетки пролил в брюшную полость, в которой они сопротивляются отряду индуцированный апоптоз 4. Скопление перитонеального асцита является обычным явлением, поскольку проливают опухолевые клетки блокируют перитонеальный лимфатический дренаж и тumors производят факторы роста, которые изменяют проницаемость сосудов. Часть пролитой опухолевых клеток прикрепляются к поверхности перитонеальных органов и структур , включая кишечник, печень, сальник и брыжейку, вследствие чего они пролиферируют и якорь для получения множества широко распространяемых вторичных поражений 3,5. Гематогенное метастаз редко. Таким образом, клиническое лечение обычно не состоит из циторедуктивного хирургии, включая "оптимальной циторедукция", которая определяется как резекция всей видимой опухоли (независимо от того, насколько мал). Полная циторедукции связано со значительным увеличением общей выживаемости 6,7 и связано с проблемой выявления и устранения повреждений <0,5 см.

Мелкие животные модели доказали полезность в исследованиях рака яичников в улучшении нашего понимания прогрессирования заболевания, а также в выявлении прогностических биомаркеров и тестирования новых химиотерапевтических препаратов или подходов комбинированной терапии. Как основнойсайт яичников заболеваемости раком и метастазирования является брюшная полость, ортотопической модели EOC метастазирования включают анализ и характеристику внутрибрюшинного болезни. Хотя были недавние улучшения в способности к опухолевым клеткам изображения, даже на уровне одной клетки, по-прежнему существуют значительные трудности в количественной оценке метастатического бремя опухоли EOC. Эти проблемы возникают из-за количества, размера и анатомического расположения метастатических поражений. Кроме того, существует потребность в раковых клетках этикетки, чтобы отличить их от нормальных клеток-хозяев. Предыдущие исследования использовали антитела на основе протоколов маркировки или трансфекции опухолевых клеток с помощью люциферазы 8,9. Прямое флуоресцентное мечение раковых клеток было впервые сообщено Тисима и соавторами в 1997 году 10. Флуоресцентные метки не требуют добавления экзогенного субстрата и обеспечивают изысканную опухолевых клеток специфичность, обеспечивая более эффективные средства для отслеживания метастазирования рака 11,12

Здесь мы опишем метод оптической визуализации для количественного анализа метастазами с использованием сингенную ортотопической модели ксенотрансплантата , состоящий из красного флуоресцентного белка (RFP) -tagged мышиного ID8 клеток рака яичников 13 и иммунокомпетентных мышам C57 / НД6. Мы демонстрируем новый метод относительного опухолевой количественного сочетания в естественных условиях и естественных изображений экс с удалением ткани автофлуоресценции. Такой подход имеет потенциальное применение в исследованиях, направленных на оценку влияния конкретных генетических, эпигенетических или микро-экологических изменений и / или методов лечения на органоспецифической метастазирования рака яичников.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все исследования в естественных условиях были одобрены Университета Нотр - Дам уходу и использованию животных комитета и использовали самок мышей C57 / BL6J.

1. Мышиный рак яичников Культура клеток

  1. Сделать мышиный овариальный культуральной среды клеток рака ID8 следующим образом: 1 л Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 4% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 1% пенициллина / стрептомицина, 5 мкг / мл инсулина, 5 мкг / мл трансферрина и 5 нг / мл селенита натрия.
  2. Трансдукции ID8 мышиных клеток рака яичников 13 , чтобы выразить красный флуоресцентный белок (RFP) с использованием коммерчески закупленных лентивирусов частицы , выражающие RFP и маркер селекции (бластицидин ген). Обратите внимание, что зеленый флуоресцентный белок может быть использован, но обеспечивает более слабый сигнал флуоресценции.
    1. Непосредственно перед трансдукции клеток культуры до 50 - 70% сплошности и добавить свежую среду (не содержащую пенициллин / стрептомицин), который включает в себя 1 мл полибрена (5 мкг / мл, конечнаяконцентрация).
    2. Аккуратно пипетку ЗП-лентивирусов (20 мкл) по каплям в чашку и инкубировать при 37 ° С в течение 72 ч. Удалить среду и инкубируют со свежей средой в течение 24 часов. Начинают выбор трансдуцированных клеток путем добавления бластицидин к культуральной среде (5 мкг / мл) и монитор для красных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии (Figure1).
  3. Культура ЗП-меченый клеток в среде ID8 посевом приблизительно 10 6 клеток в блюдо культуры ткани и визуализации ежедневно с помощью светового микроскопа , пока клеточный монослой не сливающийся.
  4. Когда сливающиеся, сбора клеток с помощью трипсина (0,25%, 3 мин) и возвращают колбу на 37 ° С инкубатор до тех пор , пока клетки не отделяются.
  5. Нейтрализовать трипсина 6 мл ID8 культуральной среде, содержащей сыворотку. Пипетировать вверх и вниз по отношению к нижней части блюда, а затем переносят в 15 мл коническую трубку. Центрифуга при 1200 оборотов в минуту в течение 2 мин, а затем отсасывает среды с использованием ГЛпопка пипетку.
  6. Промывают клетки фосфатно-солевым буфером (PBS), осторожно снова суспендируют в 6 мл теплой PBS и центрифугирование, как в 1.5 выше. Повторное приостановить в PBS до конечной концентрации 5 × 10 6 клеток / мл. Держите клетки теплой (37 ° С) до инъекции.

2. интраперитонеально из ID8 клеток и в естественных изображений

  1. Вводят каждую мышь с 2 мл теплого раствора ID8-PBS в течение в общей сложности 10 миллионов клеток через внутрибрюшинным (IP) инъекции. Разрешить опухолевым клеткам расти в естественных условиях в течение приблизительно 10 недель при еженедельном живого изображения.
  2. Сразу же после инъекции и каждую неделю после этого, весят мышей , а затем анестезию каждой мыши с помощью изофлуораном (скорость потока 2,5% в 0,5 л / мин O 2 потока). Примечание: Мыши были взвешены, а не в качестве количественной меры бремени опухоли, а скорее более общей меры индивидуальной мыши физической прогрессии на протяжении всего исследования. Мыши весятТ.С. сравнивались со своими предыдущими значениями веса.
    1. Обезболить мышей путем размещения в изофлуораном камере. Поддерживать постоянные анестезии при сканировании с помощью позиционирования головки мыши в носовой конус для воздействия 2,5% изофлуораном расхода в течение всей процедуры.
  3. Используйте крем для удаления волос для удаления волос на туловище и брюшко каждой мыши, как черные волосы вызовет ослабление сигнала флуоресценции. Мыши омываются теплой водой после нанесения крема депиляции и сушат с помощью RT бумажных полотенец.
  4. В то время как под наркозом, сканирование всего тела каждой мыши с помощью небольшого животного оптической системы формирования изображения. Сканирование всех мышей в когорте в каждый момент времени. Используйте следующие два шага протокола (Рисунок 2A):
    1. На шаге 1, чтобы наблюдать флуоресцентно меченных (RFP) опухолевых клеток, выполнить мультиспектральных приобретение собрать в общей сложности 5 изображений с помощью фильтров возбуждения 440 нм, 460 нм, 480 нм, 520 нм и 540 нм, и фильтр эмиссии 600 нм. Используйте следующие параметры приобретения: стандартной экспозиции 15 сек, 2 х 2 Биннинг, FOV 160 мм, а е остановки 1.1.
    2. На шаге 2, чтобы наблюдать весь животное, приобретают отражательной изображение с использованием открытого фильтра возбуждения (белый свет), фильтр открытого излучения, стандартной экспозиции 0,2 сек с 2 х 2 биннинга и FOV 16 см. Примечание: Фактическое время формирования изображения составляет ~ 1 мин.

3. Мышь Вскрытие и Image Acquisition

  1. Когда живой визуализации показывает наличие обширного внутрибрюшинным заболевания или животных проявляют накопление асцита ( о чем свидетельствует вздутие живота), потери или прироста массы тела более чем на 20%, вялость или другие признаки бедствия, эвтаназии каждой мыши , используя CO 2 анестезии с последующим смещением шейных позвонков.
  2. Разрежьте кожу кпереди вдоль вентральной средней линии мыши, используя заостренный dissectioN ножницы, из верхней части бедра до нижней части грудной клетки. Возьмите крайнюю осторожность , чтобы прорезать только слой кожи (рис 2BI). Аккуратно отделить кожу от перитонеального ткани, будучи уверенным, чтобы не проколоть брюшную стенку.
  3. С помощью заостренных рассечение ножницами, вырезанные в поперечном направлении и вдоль нижней части грудной клетки и верхней части бедра , чтобы создать две откидные створки кожи (рис 2B II, III).
  4. Поместите каждую мышь на его брюшной стороне (брюшной полости были обращены вниз) с кожных лоскутов распахнула и сканировать каждую мышь с его органами на местах с использованием мелких животных оптической системы визуализации (рис 3A, B).
    1. Используйте те же параметры получения изображения, как описано в 2.4.1.-2.4.2.
  5. Продолжайте рассечения мышь путем выделения отдельных перитонеального органов, включая печень, сальник / поджелудочной железы, желудка, диафрагмы, тонкой кишки, толстой кишки, левый и правый брюшины, яичников, kidneYS, брыжейки и жировой ткани.
    1. Заметим, перечислить, и записывать видимые опухоли на каждом органе. С помощью штангенциркуля для измерения диаметра каждой опухоли.
    2. Назначают опухоли менее 2 мм в диаметре , как малые, в возрасте от 2 до 5 мм , в качестве среды и более чем на 5 мм больше.
  6. Поместите органы на шаблоне сканирования органа (рисунок 4) , который идентифицирует заранее определенное место для каждого органа. Используйте PBS, чтобы сохранить органы во влажном состоянии.
  7. Сканирование каждого листа органов с использованием мелких животных оптической системы визуализации (рис 3C, D).
    1. Используйте те же параметры получения изображения, как описано в шаге 2.4.
  8. После сканирования, место органы в 10% формальдегида, с тем чтобы последующую обработку для гистологического исследования.

4. Количественное опухолевой нагрузки в гоэлектронной флуоресцентных изображений

  1. Для того, чтобы уменьшить количество автофлуоресценции в каждом многоспектральном сканирования, сначала unmix файлы с помощью программного обеспечения, доступного с маленькой системы формирования изображения для животных.
    1. Загрузите сначала RFP: In Vivo спектрального файла, за которым следует Autofluor: In Vivo Red файл в окне Несмешанные изображения и выберите Unmix.
  2. Экспорт .bip файлы как (немасштабируемого) формате 16 бит .tiff.
  3. С помощью программного обеспечения ImageJ (виво органы бывших , а затем полное тело мыши с органами на месте).
    1. Используйте Файл> Открыть , чтобы открыть 16 - битных файлов .tiff файлов шаблонов сканирования орган в ImageJ.
    2. Под Image> Adjust> Brightness / Contrast, выбрать Установить минимальное отображаемое значение 0 , а максимальное отображаемое значение +35353 , а затем вImage> таблицы поиска, выберите Red Hot. Примечание: Различные животные модели потребуют различных уровней яркости, но важно, чтобы сохранить яркость последовательно на протяжении данного исследования.
    3. С помощью инструмента выделения областей произвольной формы, нарисуйте в свободной форме область выбора процентного (ROI) вокруг каждого органа и с помощью инструмента Measure (CTRL + M) , чтобы вычислить площадь поверхности каждого органа; записать площадь поверхности каждого органа в электронную таблицу.
    4. С ROI, описанной вокруг каждого органа, щелкните правой кнопкой мыши в пределах ROI и выберите Копировать , чтобы включить только орган.
    5. Глядя на отдельного органа, при Image> Adjust> Threshold, выберите для установки порога изображения на нижний уровень порога + 1200 и верхний пороговый уровень + 1700 , чтобы выбрать ONLу наиболее ярко флуоресцирующих регионов и проверить , чтобы выбрать темный фон; выберите ОК. Примечание: Изображения могут потребовать ручного манипулирования пороговых ползунков в ImageJ таким образом, что ранее яркие области выбраны для этапа анализа, как было показано выше. Различные модели заболевания требуют различных пороговых ограничений, но важно, чтобы держать пороговые уровни, соответствующие на протяжении данного исследования.
    6. В разделе Анализ> Анализ частиц, изменение размера ( в пикселях ^ 2) до 10-бесконечность, выбрать Показать: Контуры, проверьте , чтобы выбрать только "Показывать результаты" и нажмите кнопку OK , чтобы измерить обе области и сырые интегрированные плотности этих ярких областей, считающиеся опухоли.
    7. Запишите значения площадь поверхности и сырье интегральной плотности каждого выбора опухоли отображается в
    8. В разделе Анализ> Инструменты> Бар Калибровка, добавить калибровки масштабную линейку к изображениям органов. Примечание: В данном примере это было сделано путем изменения местоположения в верхний правый угол, цвет заливки на черный, этикетке белый цвет, число наклеек на 5, десятичных знаков после запятой 0, размер шрифта до 12 и зума фактор 4.0 и позволяет полужирный текст.
    9. Под Файл> Сохранить как ..., сохранить монтаж как .tiff и .jpeg.
    10. Используйте Файл> Открыть , чтобы открыть файл .jpeg органов , а затем в Insert> Text Box
    11. Используйте Файл> Открыть , чтобы открыть каждый из 16 битных .tiff файлов полных сканирования тела в ImageJ в порядке убывания количества мыши.
    12. Под Image> Adjust> Brightness / Contrast, выбрать Установить минимальное отображаемое значение 0 , а максимальное значение отображается до + 35353 , а затем в меню Image> таблицы поиска, выберите Red Hot.
    13. Под Файл> Сохранить как ..., сохранить монтаж в виде. Tiff и .jpeg.

5. Анализ данных

  1. Добавьте области отбора опухолевых и сырые интегрированные плотности, соответственно, для каждого органа каждой мыши и записывают общую площадь опухоли орган для каждой мыши.
  2. Нормализация записанной области и сырой интегЗначения плотности е изд размера каждого органа путем деления общей площади опухоли и общего необработанных значений интегральной плотности по соответствующей площади поверхности органа (таблица 1).
  3. Рассчитать и построить среднее обоих нормированных участков поверхности опухоли и нормированных исходных комплексных значений плотности (рис 5А, В).
  4. Сравните эти средние значения к полученным путем визуального подсчета опухолей, которые были видны невооруженным глазом при осмотре каждого органа для метастатических поражений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Метастатическим механизм развития рака яичников характеризуется высокой диффузного внутрибрюшинным метастазирования, состоящей из многочисленных очагов различного размера, в том числе несколько небольших (<2 мм) поражений. Таким образом, использование RFP-меченых опухолевых клеток (рисунок 1) и оптических изображений обеспечивает альтернативный метод для ручного подсчета и измерения размера повреждения. Развитие опухолевой с течением времени может быть определена путем еженедельное взвешивание мышей и измерения брюшной обхвате , чтобы оценить потенциальное присутствие асцита. В естественных условиях оптических изображений обеспечивает дополнительный подход к оценке опухолевой нагрузки (рисунок 2). Рак яичников метастазирует в нескольких местах в брюшную полость и молекулярных водителей по конкретным участкам метастазирования в настоящее время неизвестно. В дополнение к определению общего бремени опухоли, после умерщвления осторожно рассечение может быть выполнена для оценки и количественного определения конкретного участка годовыхtterns метастазирования. Таким образом, оптическая томография перитонеальных органов на месте (рис 3A, B) в сочетании с экс естественных условиях оценки отдельных органов (рис 3C, D) может предоставить полезные данные о целом против опухолевой органоспецифической. Сканирование , представленные на рисунке 3 представлены результаты сканирования брюшной полости и отдельные органы мышей с различной степенью опухолевой массы . Например, на рисунке 3C показывает наибольшее бремя опухоли в сальнике / поджелудочной железы, яичников и брыжейки мышей A. По сравнению с теми же органов у мышей B, значительная разница в сигнале видно (рис 3D). Использование шаблона сканирования органа (рисунок 4) помогает в идентификации опухолевой органоспецифической. Наблюдение дифференциального опухолевой подтверждается количественно как с точки зрения площади поверхности опухоли и интенсивности сигнала опухоли (таблица 1, рисунок 5).

рисунке 2 и 3 иллюстрируют широкий спектр опухолевой , которые могут быть отображены и количественно оценить с помощью этого метода. Данные , приведенные в таблице 1 иллюстрирует этот большой диапазон применимости в количественной оценке как опухолевые , площадь поверхности и интенсивности сигнала опухоли. Например, при взгляде на сальнике / поджелудочной железе мышей А по сравнению с Mouse B, нормализованная площадь поверхности опухоли в 26 раз больше в мышь, чем мышь B. Кроме того, большой диапазон интенсивности сигнала также демонстрируется в сальнике / поджелудочной железы мышей а и В; нормированный сырой интегральной плотности курсот в 56 раз больше, чем у мышей В. Эти результаты демонстрируют обоснованность сравненг бремя опухоли нескольких испытуемых по отношению друг к другу, с точки зрения как опухоли площади поверхности и интенсивности сигнала опухоли, с помощью этого быстрым способом, который не требует дальнейшего гистологический анализ обработанных.

Рисунок 1
Рисунок 1. ID8 Мышиные клеток рака яичников Экспресс RFP. (A) фазовое изображение клеток ID8. (В) флуоресценция изображение клеток ID8. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Живая Оптическая Визуализация C56 / НД6 мышь с внутрибрюшинным опухолевого Burden. (А) Крем для депиляции использовали для удаления Хаев г от вентральной поверхности мыши перед сканированием. (В) Диаграмма , показывающая исходную вентральной срединной линии и боковые разрезы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3AC
Рисунок 3BD
Рисунок 3. Конечная точка Сканирование внутрибрюшинным Опухоль Бремя. (А, В) Мышей сначала визуализируют с помощью органов на месте (вентральной стороной вниз) после открытия вентральной поверхности мыши. (C, D) визуализации отдельных органов. Каждый орган расчленена, бремя визуальной опухоли регистрируются и размещают на шаблоне сканирования орган для анализа.целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Organ Сканирование шаблона. Препарированные органы размещаются на шаблоне сканирования органа для поддержания позиционной идентификации отдельных органов во время сканирования.

Рисунок 5
.. Рисунок 5. Нормированные количественные данные для Сальник / поджелудочная железа, яичники и брыжейки данные были проанализированы , как описано в протоколе и , как показано в таблице 1 , мышь относится к мыши проверяемых в панели 3А; мышь B относится к мыши сканируемого в панели 3В. (A) область Нормированная опухоли. Количественное сигнала флюоресценции анализ этих трех органов был проведен и количественно с точки зрения соотношенияплощади поверхности опухоли на всей площади поверхности органа для обеих мышей. (В) Нормализованная сырец интегральная плотность. Флуоресцентный сигнал Количественное анализ этих трех органов был проведен и количественно с точки зрения соотношении сырой интегральной плотности на всей площади поверхности органа для обеих мышей.

Сальник / Поджелудочная
Нормализованная Опухоль Площадь Нормализованная сырье интегральной плотности
мышь 0,5346 5.11E + 07
Мышь B 0,0203 8.97E + 05
Яичники
Нормализованная Опухоль Площадь Нормализованная сырье интегральной плотности
мышь 4.79E + 07
Мышь B 0,0123
брыжейка
Нормализованная Опухоль Площадь Нормализованная сырье интегральной плотности
мышь 0,2951 2.22E + 07
Мышь B 0,0098 4.15E + 05

Таблица 1. Нормированная Опухоль Площадь и нормализованной сырьеИнтегрированные значения плотности в сальнике / поджелудочная железа, яичники и брыжейки как мышь и мышь B. Post рассечения и сканирования, каждый орган был сегментирован и его флуоресценции количественно определить долю площади опухоли к общей площади поверхности органов и интенсивностей флуоресценции для этих опухолевых областей. Сальник / поджелудочной железы, яичников и брыжейки были выбраны, поскольку они имели самые сильные сигналы флуоресценции в пределах положительных и отрицательных контрольных групп.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В отличие от исследований с использованием клеток рака яичников человека, которые должны быть проведены в ослабленным иммунитетом мышей, протокол, описанный выше, использует иммунокомпетентных мышей C57 / НД6 и сингенных мышиных клеток рака яичников. Хотя это позволяет проводить оценку потенциальной роли иммунных инфильтратов в опухолевой прогрессии и метастазирования, наличие темных волос на брюшной поверхности делает изображения менее чувствительным. Использование депиляции для удаления волос до начала обработки изображений увеличивает получение изображений, но требует больших затрат времени, в частности, для проведения экспериментов, требующих продольную томографию. Голые "обнаженные" мыши могут быть использованы в данном протоколе, и не требуют удаления волос на основе удаления волос. Кроме того, безволосые мыши не хватает функционирование иммунной системы, так что могут быть также использованы для оценки роста клеток рака яичников человека в экспериментах, где вклад иммунной системы не находится под анализом.

Следует также отметить, что глубина intraperitoneal опухоли также представляет технические трудности, так как формирование оптических изображений флуоресценции, как правило, не обнаруживают опухоли на глубине более 5 мм. Кроме того, преобладание асцитической жидкости и наличие асцитической опухолевых клеток обеспечивают дополнительные осложнения. Мы наблюдали значительную вариабельность мыши к мышиному в формировании асцитической жидкости, даже при введении с той же клеточной линии. Таким образом, при наличии асцита, этот способ является предпочтительным для конечной точки анализа опухолевой органоспецифической, а не рутинной продольной визуализации прогрессии. В данном случае, были отмечены значительные изменения в опухолевой между например мышей, таким образом, что когорты четырех до пяти мышей, как правило, достаточно для статистического анализа. В случае менее существенных различий в опухолевой дополнительные экспериментальные предметы будут необходимы для достижения статистической мощности. Хотя примеры, приведенные в данном документе значительно различаются по объему опухоли, оптических изображений флуоресценции можно использовать дляобнаруживать гораздо меньшие различия в опухолевой органоспецифической, особенно по сравнению с весовым или измерения суппорта на основе на небольших повреждений (не показаны) .Resolution и чувствительность будет изменяться в зависимости от клеточной линии и системы формирования изображения. В данном случае, метастатические имплантаты размером до 400 мкм в диаметре могут быть решены и количественно. Альтернативные методы , включая контрастированием компьютерная томография (КТ), магнитно - резонансной томографии (МРТ) и позитронно - эмиссионной томографии (ПЭТ), были описаны для продольной визуализации 14,15. Механизмы включая комбинированные анатомическую и функциональную визуализацию также в стадии разработки 16.

В отношении этого предлагаемого способа количественного опухолевой массы, следует отметить, что определение флуоресценции порогов [стадии 4.3.5.] Основан на интенсивности флуоресценции видно на изображениях, органных [Этап 4.3.2.] и выбирается пользователем, чтобы включить только самые флуоресцентные регионы RELATив к остальной части органа. Варьирование пороговые значения были использованы в анализе, прежде чем определить окончательный пороговых значений, используемых в данном исследовании. После того, как определено, те же самые пороги использовались для каждого органа анализируемый с тем, чтобы обеспечить согласованность в количественной оценке того, что считается метастатической ткани путем первоначального визуального анализа, проведенного исследователем. Определение этих пороговых значений является важным шагом в процедуре и потенциально может варьироваться от одного проекта к другому, как определено отдельным исследователем. В этом случае большое нижний порог был использован для того, чтобы захватить только наибольшую интенсивность сигналов флуоресценции. Используя этот же порог для каждого органа анализируемого, анализ и результаты предлагают сравнительные количественные результаты в контексте этой когорте мышей. В то время как этот способ ограничен в количественной оценке абсолютных значений площади поверхности опухоли, она позволяет исследователям возможность сравнить относительную нормализованное опухолевой среди тех же ай различные органы в пределах когорты мышей. Следует отметить, что этот подход включает в себя определение количества опухолей, которые не видны невооруженным глазом.

Уникальный метастатическим механизм результатов EOC в широко распространяемых внутрибрюшинного карциноматозом с участием нескольких тканей и органов, оказания оптимальной циторедуктивной хирургии технически сложной задачей. Как полная циторедукции положительно коррелирует с общей выживаемости, то отсюда следует, что разработка новых терапевтических стратегий по борьбе с внутрибрюшинным метастаз является оправданным. Оценка терапевтической эффективности, однако, зависит от точного количественного опухолевой массы, включая оценку органоспецифической метастаз. Использование оптических изображений РПД-меченый опухолевых клеток in - situ скорректированной для органа автофлюоресценции, в сочетании с тщательной экс естественных изображений органов, мы разработали подход к количественной оценке внутрибрюшного органа конкретной опухолевой. Интересно отметить, что наши анализы показывают,что предпочтительные участки метастазирования в этой модели, как это определено опухолевой области нагрузка / поверхности, аналогичны тем , которые встречаются у женщин с раком яичников (Сальник, яичников, кишечника, брыжейки) 2,4,5. Поэтому этот подход должен иметь будущую полезность в оценке экспериментальной терапии, предназначенных для целевой метастазирования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Эта статья является частью специального выпуска на мультимодальные доклинической визуализации, авторами которого являются Bruker BioSpin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium Corning 10-014-CM
Fetal bovine serum Gibco 10437-028
penicillin/streptomycin
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement Sigma I-1884
Bruker Xtreme small animal imaging system Bruker Corp.
Bruker Multispectral software Bruker Corp
lentiviral particles with Red fluorescent protein GenTarget, Inc. LVP023
trypsin for cell culture Corning 25-053-CI
PBS Corning 21-040-CM
depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion) purchases from drugstore  n/a
ImageJ software  http://imagej.nih.gov/ij/  free download
dissecting tools (forceps) Roboz Surgical Instrument  RS 5130
dissecting tools (Scissors) Roboz Surgical Instrument RS 5910

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Cancer Society. , Available from: http://www.cancer.org/cancer/ovariancancer/overviewguide/ovarian-cancer-overview-key-statistics (2015).
  2. Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
  3. Halkia, E., Spiliotis, J., Sugarbaker, P. Diagnosis and management of peritoneal metastases from ovarian cancer. Gastroenterology Research and Practice. 2012, 541842-541854 (2012).
  4. Barbolina, M. V., et al. Microenvironmental regulation of ovarian cancer metastasis. Cancer Treatment and Research. 149, 319-334 (2009).
  5. Lengyel, E., et al. Epithelial ovarian cancer experimental models. Oncogene. 33 (28), 3619-3633 (2014).
  6. Harter, P., duBois, A. The role of surgery in ovarian cancer with special emphasis on cytoreductive surgery for recurrence. Current Opinion in Oncology. 17 (5), 505-514 (2005).
  7. Bristow, R. E., Puri, I., Chi, D. S. Cytoreductive surgery for recurrent ovarian cancer: a meta-analysis. Gynecologic Oncology. 112 (1), 265-274 (2009).
  8. Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death and Differentiation. 9, 786-789 (2002).
  9. Sweeney, T. J., et al. Visualizing the kinetics of tumor-cell clearance in living animals. Proceedings of the National Academy of Science USA. 96, 12044-12049 (1999).
  10. Chishima, T., et al. Cancer invasion and micrometastasis visualized in live tissue by green fluorescent protein expression. Cancer Research. 57, 2042-2047 (1997).
  11. Bouvet, M., et al. Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model. Cancer Research. 62, 1534-1540 (2002).
  12. Hoffman, R. M. The Multiples Uses of Fluorescent Proteins to Visualize Cancer in vivo. Nature Reviews. 5, 796-806 (2005).
  13. Roby, K. F., et al. Development of a syngeneic mouse model for events related to ovarian cancer. Carcinogenesis. 21 (4), 585-591 (2000).
  14. Rampurwala, M., Ravoori, M. K., Wei, W., Johnson, V. E., Vikram, R., Kundra, V. Visualization and quantification of intraperitoneal tumors by in vivo computed tomography using negative contrast enhancement strategy in a mouse model of ovarian cancer. Translational Oncology. 2 (2), 96-106 (2009).
  15. Kim, T. J., et al. Antitumor and antivascular effects of AVE8062 in ovarian carcinoma. Cancer Research. 67, 9337-9345 (2007).
  16. Picchio, M., et al. Advanced ovarian carcinoma: usefulness of [(18)F]FDG-PET in combination with CT for lesion detection after primary treatment. Quarterly Journal of Nuclear Medicine. 47, 77-84 (2003).

Tags

Медицина выпуск 113 рак яичников метастазирование флуоресценция визуализация мышиная модель брюшина
Количественное внутрибрюшинным метастаз рака яичников
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lewellen, K. A., Metzinger, M. N.,More

Lewellen, K. A., Metzinger, M. N., Liu, Y., Stack, M. S. Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis. J. Vis. Exp. (113), e53316, doi:10.3791/53316 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter